包含用於使赭曲毒素去毒的醯胺酶的食品添加劑的製作方法

2023-07-07 02:37:41

專利名稱：包含用於使赭曲毒素去毒的醯胺酶的食品添加劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及使黴菌毒素去毒的方法。更具體地講，本發明涉及醯胺酶和包含至少一種用於使赭曲毒素(尤其是赭曲毒素A)去毒的醯胺酶的飼料和/或食品添加劑。
背景技術：
黴菌毒素是基本上屬於麴黴屬(Aspergillus)、青黴素(Penicillium)和鐮刀菌屬(Fusarium)的真菌的有毒次級代產物。它們可在廣泛的農業商品上以及在世界範圍的各種農藝、生態和採收後條件下產生。黴菌毒素可在田地中、飼料或食品材料的存儲期間，或在食品鏈的後面的時間點進入食品鏈中。它們在食品和飼料中積聚是對人和動物健康的一個巨大威脅，因為消費黴菌毒素汙染的飲食可能會導致致畸效果、致癌效果和雌激素效果或免疫抑制效果。在1985年，世界衛生組織估計大約25%的世界糧食被黴菌毒素汙染(Jelinek等人1989)。由於糧食和穀物全球輸入和輸出的增加以及不斷變化的環境和氣候特點，該數字自此以後有可能已經增長。目如有超過400種黴菌毒素有文獻記載，但最令人關注的以及因此研究最多的黴菌毒素包括:黃麴黴毒素、脫氧瓜萎鐮菌醇、玉米赤黴烯酮、伏馬毒素和赭曲毒素。儘管存在許多產毒素黴菌物種，但僅少數黴菌毒素被視為對人而言是值得注意的。三個真菌屬(麴黴屬、青黴屬和鐮刀菌屬)最常涉及黴菌毒素汙染的情形。真菌的定植、生長和黴菌毒素產生通常受多種因素影響。最重要的因素是溫度和水活度。一般來講，在溫暖區域黃麴黴素是主要的關注點。這是因為產生這些毒素的麴黴屬物種可找到熱帶區域存在的最適條件。相比之下，鐮刀菌屬和青黴屬物種具有較低的最適溫度，因此適應於更溫和的氣候。赭曲毒素、伏馬毒素和玉米赤黴烯酮因此在提供這些條件的區域產生。赭曲毒素是一組由麴黴菌屬或青黴屬的數種真菌作為次級代謝物產生的黴菌毒素，是由香豆素衍生物組成的弱有機酸。有三種公認的赭曲毒素，定為A、B和C。赭曲毒素A是赭曲毒素家族中最豐富的成員，因而最常被檢查到，但也是最有毒性的。赭曲毒素A(赭曲毒素A)是穀物和其他富含澱粉的食品中存在的腎毒性的、致畸的和致癌的黴菌毒素。除了穀物和穀物產品外，赭曲毒素A也存在於廣泛的其他食品中，包括咖啡、可可、酒、啤酒、幹豆、調味料、乾果、葡萄汁、豬腎和暴露於受該黴菌毒素汙染的飼料的非反芻動物的其他肉和肉產品。許多國家已對食品中的赭曲毒素A水平設定了極限，取決於食品的類型和質量，通常在I至IOppb (份/十億份)之間。
權利要求
1.一種分離的醯胺酶，其能夠降解赭曲毒素。
2.根據權利要求1所述的醯胺酶，其中所述赭曲毒素是赭曲毒素A。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的醯胺酶，其中所述醯胺酶包含如下胺基酸序列基序中的至少一個,優選至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個，更優選九個:1)x_P_G_x_x_D_x_H_x_H_x_xG；2)G-x-T；3)G-x-x-x-G-P；4)G-H-x-D；5)D_G_x_x_x_C_x_x_x_x_R_x_x_x_R_x_x-A_x_x_I_K；6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P；7)V_x-A_H_x_x_G_x_x_G；8)H-x-x-x-x-D； 9)G-V-x-1-x-x-G-T-D。
4.根據權利要求中I至4中任一項所述的醯胺酶，其中所述醯胺酶具有Tim桶結構，所述桶結構包括包含6個組氨酸殘基、I個賴氨酸殘基和I個天冬氨酸殘基的活性位點，其中當將所述醯胺酶和SEQ ID NO: I的三級結構相比較時所述活性位點中的所述胺基酸殘基對應於 SEQ ID NO: 1的位置11111、11113、11191、1(246、11287、11289、11307 和0378。
5.根據任一前述權利要求所述的醯胺酶，其中所述醯胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
6.根據任一前述權利要求所述的醯胺酶，其中所述醯胺酶是在PH3-9和21-40°C下溫育時可降解赭曲毒素的醯胺酶。
7.根據任一前述權利要求所述的醯胺酶，其中所述醯胺酶包含具有SEQID NO: 1、SEQID NO:3 或 SEQ ID NO:5-11、13、14 或 15 中任一者的序列，或具有與 SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO:3 或 SEQ ID NO:5-ll、13、14 或 15 中的任一者具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或與SEQ ID NO:USEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
8.根據任一前述權利要求所述的醯胺酶，其中所述醯胺酶包含:具有SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3 的序列或具有與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽；或由包含SEQ ID NO:2的序列或包含與SEQ IDNO:2具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由於遺傳密碼子的簡併性而與SEQ ID N0:2不同的多核苷酸表達所產生的多肽；或由與SEQ ID N0:2相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多核苷酸，或在嚴格條件下雜交至SEQ ID N0:2的互補序列或雜交至與所述互補序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的序列表達所產生的多肽。
9.根據任一前述權利要求所述的醯胺酶，其中在pH7.0和40°C下所述醯胺酶每毫克蛋白質每分鐘水解約至少100、至少200、至少300、至少400至約900納摩爾赭曲毒素A。
10.一種飼料或食品添加劑，其包含能夠降解赭曲毒素的醯胺酶。
11.根據權利要求10所述的飼料或食品添加劑，其中所述赭曲毒素是赭曲毒素A。
12.根據權利要求10或權利要求11所述的飼料或食品添加劑，其中所述醯胺酶是分離的。
13.根據權利要求10至12中任一項所述的飼料或食品添加劑，其中所述醯胺酶包含如下胺基酸序列基序中至少一個，優選至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個，更優選九個:1)x_P_G_x_x_D_x_H_x_H_x_xG；2)G-x-T；3)G-x-x-x-G-P；4)G-H-x-D；5)D_G_x_x_x_C_x_x_x_x_R_x_x_x_R_x_x-A_x_x_I_K；6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P；7)V_x-A_H_x_x_G_x_x_G；8)H-x-x-x-x-D；9)G-V-x-1-x-x-G-T-D。
14.根據權利要求10至13中任一項所述的飼料或食品添加劑，其中所述醯胺酶具有Tim桶結構，所述桶結構包括包含6個組氨酸殘基、I個賴氨酸殘基和I個天冬氨酸殘基的活性位點，其中當將所述醯胺酶和SEQ ID NO:1的三級結構相比較時所述活性位點中的所述胺基酸殘基對應於 SEQ ID NO:l 的位置 H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307 和 D378。
15.根據權利要求10至14中任一項所述的飼料或食品添加劑，其中所述醯胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
16.根據權利要求10至15中任一項 所述的飼料或食品添加劑，其中所述醯胺酶是在PH3-9和21-40°C下溫育時可降解赭曲毒素的醯胺酶。
17.根據權利要求10至16中任一項所述的飼料或食品添加劑，其中所述醯胺酶包含具有 SEQ ID NO: U SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 5-11、13、14 或 15 中任一者的序列，或具有與 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 5_11、13、14 或 15 中的任一者具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5-11、13、14或15相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
18.根據權利要求10至17中任一項所述的飼料或食品添加劑，其中所述醯胺酶包含:具有 SEQ ID NO: I 或 SEQ ID NO: 3 的序列或具有與 SEQ ID NO: I 或 SEQ ID NO: 3具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 3相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽；或由包含SEQ IDNO: 2的序列或包含與SEQ ID NO: 2具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由於遺傳密碼子的簡併性而與SEQ ID NO: 2不同的多核苷酸表達所產生的多肽；或由與SEQ ID NO: 2相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多核苷酸，或在嚴格條件下雜交至SEQ ID NO: 2的互補序列或雜交至與所述互補序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的序列表達所產生的多肽。
19.根據權利要求10至18中任一項所述的飼料或食品添加劑，其中在pH7.0和40°C下所述醯胺酶每毫克蛋白質每分鐘水解約至少100、至少200、至少300、至少400至約900納摩爾赭曲毒素A。
20.根據權利要求10至19中任一項所述的飼料或食品添加劑，其中所述醯胺酶是重組的。
21.根據權利要求10至20中任一項所述的飼料或食品添加劑，其包含能夠表達所述醯胺酶的重組細胞或孢子。
22.根據權利要求21所述的飼料或食品添加劑，其中所述細胞選自:大腸桿菌、鏈黴菌屬、漢遜酵母屬、木黴屬(特別是裡氏木黴)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、麴黴屬(特別是黑麴黴)、植物細胞和/或牙抱杆囷屬、木黴屬或麴黴屬的抱子。
23.根據權利要求10至22中任一項所述的飼料或食品添加劑，其還包含至少一種生理上可接受的載體。
24.根據權利要求23所述的飼料或食品添加劑，其中所述生理上可接受的載體選自如下物質中的至少一種:麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環糊精、小麥、麥麩或小麥組分、稻米或米糠、蔗糖、澱粉、Na2SO4、滑石粉和PVA以及它們的混合物。
25.根據權利要求10至24中任一項所述的飼料或食品添加劑，其中所述飼料包含一種或多種另外的酶。
26.根據權利要求25所述的飼料或食品添加劑，其中所述一種或多種另外的飼料用酶選自:涉及蛋白質降解的酶，包括羧肽酶，優選羧肽酶A、羧肽酶Y，黑麴黴天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb, PEPAc和PEPAd，彈性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶或胃蛋白酶樣蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶，和細菌蛋白酶，包括枯草桿菌蛋白酶及其變體，涉及澱粉代謝、纖維降解、脂質代謝的酶，涉及糖原代謝的蛋白質或酶，澱粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、凝乳酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、表異構酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內切葡聚糖酶、葡糖澱粉酶、葡萄糖氧化酶，-葡糖苷酶，包括3 -葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉化酶、異構酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解、果膠乙醯酯酶、果膠去聚合酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、轉移酶、轉運蛋白、轉谷醯胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:02_氧化還原酶，EC 1.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它們的組合。
27.一種飼料或食品材料，其包含根據權利要求10至26中任一項所述的飼料添加劑。
28.—種飼料或食品，其包含根據權利要求27所述的食品或飼料材料。
29.根據權利要求28所述的飼料，其包含一種或多種選自如下的飼料材料:a)穀類，例如小粒穀物(如小麥、大麥、裸麥、燕麥以及它們的組合)和/或大粒穀物如玉蜀黍或高粱；b)來自穀類的副產物，例如玉米蛋白粉、幹酒糟及可溶物(DDGS)、麥麩、小麥粗粉、小麥次粉、米糠、稻殼、燕麥殼，棕櫚仁和柑橘渣；c)青貯飼料；d)得自如下來源的蛋白質:例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蠶豆、棉花、卡諾拉、魚粉、乾血漿蛋白、肉和骨粉、馬鈴薯蛋白、乳清、幹椰肉、芝麻；e)從植物和動物來源獲得的油和脂肪；f)礦物質和維生素。
30.根據權利要求28所述的食品，其中所述食品包含穀類，例如玉米、小麥、大麥、高粱、穀類產品，例如粥、面、麵包或蛋糕、咖啡、可可、酒、啤酒、幹豆、調味料、乾果、葡萄汁、奶、奶製品如奶酪、肉或肉製品。
31.根據權利要求28至30中任一項所述的飼料或食品,其以約0.0Olmg/kg至約IOg/kg飼料/食品的水平包含所述醯胺酶。
32.根據權利要求28至31中任一項所述的飼料，其用於單胃動物，優選選自禽、豬、家養寵物、魚、貝類和甲殼類的單胃動物消費。
33.一種製備根據權利要求28至32中任一項所述的食品或飼料的方法，其包括向食品或飼料材料添加根據權利要求10至27中任一項所述的食品或飼料添加劑。
34.一種製備根據權利要求10至27中任一項所述的食品或飼料添加劑的方法，其包括將所述醯胺酶與至少一種生理上可接受的載體混合。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述至少一種生理上可接受的載體選自如下物質中的至少一種:麥芽糖糊精、石灰石(碳酸鈣)、環糊精、小麥、麥麩或小麥組分、稻米或米糠、蔗糖、澱粉、Na2SO4、滑石粉、PVA以及它們的混合物。
36.根據權利要求34或權利要求35所述的方法，其包括均化所述食品或飼料添加劑的額外步驟。
37.根據權利要求34至36中任一項所述的方法，其包括將所述食品或飼料添加劑制粒的額外步驟。
38.一種組合物，其包含赭曲毒素汙染的材料和赭曲毒素降解醯胺酶。
39.根據權利要求38所述的組合物，其中所述酶為赭曲毒素A降解醯胺酶。
40.根據權利要求38或權利要求39所述的組合物，其中所述材料汙染有赭曲毒素A和/或赭曲毒素B。
41.根據權利要求38至40中任一項所述的組合物，其中所述醯胺酶是分離的。
42.根據權利要求38至41中任一項所述的組合物，其中所述醯胺酶包含如下胺基酸序列基序中的至少一個，優選至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個，更優選九個:
43.根據權利要求38至42中任一項所述的組合物，其中所述醯胺酶具有Tim桶結構，所述桶結構包括包含6個組氨酸殘基、I個賴氨酸殘基和I個天冬氨酸殘基的活性位點，其中當將所述醯胺酶和SEQ ID NO:1的三級結構相比較時所述活性位點中的所述胺基酸殘基對應於 SEQ ID 勵:1的位置11111、11113、11191、1(246、11287、11289、11307 和0378。
44.根據權利要求38至43中任一項所述的組合物，其中所述醯胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
45.根據權利要求38至44中任一項所述的組合物，其中所述醯胺酶包含具有SEQIDNO:USEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或 15 中任一者的序列，或具有與SEQ ID NO: USEQ ID N0:3 或 SEQ ID N0:5_ll、13、14 或 15 中的任一者具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID N0:USEQ ID N0:3或SEQ ID N0:5_ll、13、14或15相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
46.根據權利要求38至45中任一項所述的組合物，其中所述醯胺酶包含:具有SEQID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 的序列或具有與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 具有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99% 同一1注的序列的多肽序列，或者與 SEQID N0:1或SEQ ID N0:3相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽；或由包含SEQID NO: 2 的序列或包含與 SEQ ID NO: 2 具有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由於遺傳密碼子的簡併性而與SEQ ID N0:2不同的多核苷酸表達所產生的多肽；或由與SEQ ID NO:2相差一個或多個核苷酸添加、缺失和/或置換的多核苷酸表達所產生的多肽；或由在嚴格條件下雜交至SEQ ID N0:2的互補序列或雜交至與所述互補序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一丨丨生的序列的多核苷酸表達所產生的多肽。
47.根據權利要求38至46中任一項所述的組合物，其中在pH7.0和40°C下溫育時所述醯胺酶每毫克蛋白質每分鐘水解約至少100、至少200、至少300、至少400至約900納摩爾赭曲毒素A。
48.根據權利要求38至47中任一項所述的組合物，其中所述醯胺酶是重組的。
49.根據權利要求38至48中任一項所述的組合物，其包含能夠表達所述醯胺酶的重組細胞。
50.根據權利要求49所述的組合物，其中所述細胞選自大腸桿菌、鏈黴菌屬、漢遜酵母屬、木黴屬(特別是氏木黴)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、麴黴屬(特別是黑麴黴)、植物細胞和/或芽孢桿菌屬、木黴屬或麴黴屬的孢子。
51.根據權利要求38至50中任一項所述的組合物，其包含一種或多種另外的酶。
52.根據權利要求51所述的組合物，其中所述一種或多種另外的酶是選自如下的飼料或食品酶:涉及蛋白質降解的酶，包括羧肽酶，優選羧肽酶A、羧肽酶Y，黑麴黴天冬氨酸蛋白酶，優選PEPAa、PEPAb, PEPAc和PEPAd，彈性蛋白酶，氨基肽酶，胃蛋白酶或胃蛋白酶樣蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶，和細菌蛋白酶，包括枯草桿菌蛋白酶及其變體，以及涉及澱粉代謝、纖維降解、脂質代謝的酶、涉及糖原代謝的蛋白質或酶、澱粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、凝乳酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、表異構酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內切葡聚糖酶、葡糖澱粉酶、葡萄糖氧化酶，-葡糖苷酶，包括3 -葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉化酶、異構酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解、果膠乙醯酯酶、果膠去聚合酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、轉移酶、轉運蛋白、轉谷醯胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:02_氧化還原酶，ECl.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它們的組合。
53.根據權利要求51或52所述的組合物，其還包含選自黴菌毒素降解酶例如黃麴黴毒素去毒酶、玉米赤黴烯酮酯酶、玉米赤黴烯酮內酯酶、伏馬毒素羧基酯酶、伏馬毒素氨基轉移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脫氧瓜萎鐮菌醇環氧化物水解酶中的至少一者、黴菌毒素降解微生物例如枯草芽孢桿菌或吸收劑(即黴菌毒素結合劑)，包括至少一種聚合物，例如微生物細胞壁或諸如膨潤土之類的無機物質。
54.根據權利要求38至53中任一項所述的組合物，其中所述組合物是飼料組合物、發酵液或廢水。
55.根據權利要求38至54中任一項所述的組合物,其以約0.0Olmg/kg至約10g/kg的水平包含所述醯胺酶。
56.一種減少材料的赭曲毒素汙染的方法，其包括向所述材料添加赭曲毒素降解醯胺酶。
57.根據權利要求56所述的方法，其中所述酶是赭曲毒素A降解酶。
58.根據權利要求56或權利要求57所述的方法，其中所述材料汙染有赭曲毒素A和/或赭曲毒素B。
59.根據權利要求56至58中任一項所述的方法，其中所述醯胺酶是分離的。
60.根據權利要求56至59中任一項所述的方法，其中所述醯胺酶包含如下胺基酸序列基序中的至少一個,優選至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個，更優選九個:
61.根據權利要求56至60中任一項所述的方法，其中所述醯胺酶具有Tim桶結構，所述桶結構包括包含6個組氨酸殘基、I個賴氨酸殘基和I個天冬氨酸殘基的活性位點，其中當將所述醯胺酶和SEQ ID NO:1的三級結構相比較時所述活性位點中的所述胺基酸殘基對應於 SEQ ID 勵:1的位置11111、11113、11191、1(246、11287、11289、11307 和0378。
62.根據權利要求56至61中任一項所述的方法，其中所述醯胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
63.根據權利要求56至62中任一項所述的方法，其中所述醯胺酶包含具有SEQIDN0:USEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或 15 中任一者的序列，或具有與SEQ ID NO: USEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:5-11、13、14 或 15 中的任一者具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、.98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5-11、.13、14或15相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
64.根據權利要求56至63中任一項所述的方法，其中所述醯胺酶包含:具有SEQIDNO:1 或 SEQ ID NO: 3 的序列或具有與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 3 具有至少 10%、20%、30%、.40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99% 同一1性的序列的多肽序列，或者與 SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 3相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽序列；或由包含SEQ ID NO: 2 的序列或包含與 SEQ ID NO: 2 具有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由於遺傳密碼子的簡併性而與SEQ ID NO:2不同的多核苷酸表達所產生的多肽；或由與SEQ ID NO:2相差一個或多個核苷酸添加、缺失和/或置換的多核苷酸表達所產生的多肽；或由在嚴格條件下雜交至SEQ ID NO:2的互補序列或雜交至與所述互補序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸表達所產生的多肽。
65.根據權利要求56至64中任一項所述的方法,其中在pH7.0和40°C下溫育時所述醯胺酶每毫克蛋白質每分鐘水解約至少100、至少200、至少300、至少400至約900納摩爾赭曲毒素A。
66.根據權利要求56至65中任一項所述的方法，其中所述醯胺酶是重組的。
67.根據權利要求56至66中任一項所述的方法，其包含能夠表達所述醯胺酶的重組細胞。
68.根據權利要求67所述的方法，其中所述細胞選自大腸桿菌、鏈黴菌屬、漢遜酵母屬、木黴屬(特別是氏木黴)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、麴黴屬(特別是黑麴黴)、植物細胞和/或芽孢桿菌屬、木黴屬或麴黴屬的孢子。
69.根據權利要求56至68中任一項所述的方法,還包括添加一種或多種另外的酶。
70.根據權利要求69所述的方法，其中所述一種或多種另外的酶是選自:涉及蛋白質降解的酶，包括羧肽酶，優選羧肽酶、羧肽酶Y，黑麴黴天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb, PEPAc和PEPAd，彈性蛋白酶，氨基肽酶，胃蛋白酶或胃蛋白酶樣蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶，和細菌蛋白酶，包括枯草桿菌蛋白酶及其變體，以及涉及澱粉代謝、纖維降解、月旨質代謝的酶、涉及糖原代謝的蛋白質或酶、乙醯酯酶、氨基肽酶、澱粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、凝乳酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、表異構酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內切葡聚糖酶、葡糖澱粉酶、葡萄糖氧化酶，-葡糖苷酶，包括3 -葡糖苷酶，葡糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉化酶、異構酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解、果膠乙醯酯酶、果膠去聚合酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、轉移酶、轉運蛋白、轉谷醯胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:02_氧化還原酶，ECl.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它們的組合。
71.根據權利要求69或70所述的方法，其還包含選自黴菌毒素降解酶例如黃麴黴毒素去毒酶、玉米赤黴烯酮酯酶、玉米赤黴烯酮內酯酶、伏馬毒素羧基酯酶、伏馬毒素氨基轉移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脫氧瓜萎鐮菌醇環氧化物水解酶中的至少一者、黴菌毒素降解微生物例如枯草芽孢桿菌或吸收劑(即黴菌毒素結合劑)，包括至少一種聚合物，例如微生物細胞壁或諸如膨潤土之類的無機物質。
72.根據權利要求56至71中任一項所述的方法，其中所述組合物是飼料組合物、發酵液或廢水。
73.根據權利要求56至72中任一項所述的方法,其以約0.001mg/kg至約10g/kg的水平包含所述醯胺酶。
74.—種飼料材料，其可通過根據權利要求56至73中任一項所述的方法獲得。
75.—種增加動物的生長速率和/或健康的方法，其包括給所述動物飼餵有效量的根據權利要求28至32中任一項所述的飼料。
76.—種重組細胞或孢子，其編碼可降解赭曲毒素的醯胺酶。
77.根據權利要求76所述的細胞或孢子，其中所述醯胺酶可降解赭曲毒素A。
78.根據權利要求76或權利要求77所述的細胞或孢子，其中所述醯胺酶是重組的。
79.根據權利要求76至78中任一項所述的細胞或孢子，其中所述醯胺酶是分離的。
80.根據權利要求76至79中任一項所述的細胞或孢子，其中所述醯胺酶包含如下胺基酸序列基序中的至少一個，優選至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個，更優選九個:
81.根據權利要求76至80中任一項所述的細胞或孢子，其中所述醯胺酶具有Tim桶結構，所述桶結構包括包含6個組氨酸殘基、I個賴氨酸殘基和I個天冬氨酸殘基的活性位點，其中當將所述醯胺酶和SEQ ID NO:1的三級結構相比較時所述活性位點中的所述胺基酸殘基對應於 SEQ ID NO:1 的位置 H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307 和 D378。
82.根據權利要求76至81中任一項所述的細胞或孢子，其中所述醯胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%純的。
83.根據權利要求76至82中任一項所述的細胞或孢子，其中所述醯胺酶包含具有SEQID NO: 1、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5-11、13、14 或 15 中任一者的序列，或具有與 SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5-11、13、14 或 15 中的任一者具有至少 70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:3或SEQ IDNO:5-11、13、14或15相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽。
84.根據權利要求76至83中任一項所述的細胞或孢子，其中所述醯胺酶包含:具有SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:3 的序列或具有與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID N0:3 具有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99% 同一性的序列的多肽序列，或者與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3相差一個或多個胺基酸添加、缺失和/或置換的多肽序列；或由包含SEQ ID NO:2的序列或包含與SEQ ID NO:2具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸，或由於遺傳密碼子的簡併性而與SEQID NO:2不同的多核苷酸表達所產生的多肽；或由與SEQ ID NO:2相差一個或多個核苷酸添力口、缺失和/或置換的多核苷酸表達所產生的多肽；或由在嚴格條件下雜交至SEQ ID NO: 2的互補序列或雜交至與所述互補序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸表達所產生的多肽。
85.根據權利要求76至84中任一項所述的細胞或孢子，其中所述細胞選自大腸桿菌、鏈黴菌屬、漢遜酵母屬、木黴屬(特別是氏木黴)、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、麴黴屬(特別是黑麴黴)、植物細胞和/或牙抱杆囷屬、木黴屬或麴黴屬的抱子。
86.根據權利要求3所述的酶、根據權利要求13所述的飼料或食品添加劑、根據權利要求42所述的組合物、根據權利要求60所述的方法或根據權利要求80所述的細胞或孢子，其中所述基序包含:
87.根據權利要求86所述的酶、飼料或食品添加劑、組合物、方法或者細胞或孢子，其中所述基序包含:
88.—種飼料或食品添加劑，其包含基本上如本文所述的醯胺酶。
89.—種飼料或食品，其包含基本上如本文所述的飼料添加劑。
90.一種製備飼料或食品 的方法，所述飼料或食品基本上如本文所述。
全文摘要
本發明涉及醯胺酶和包含能夠降解赭曲毒素的醯胺酶的飼料或食品添加劑。
文檔編號A23L1/03GK103209597SQ201180042549
公開日2013年7月17日 申請日期2011年9月6日 優先權日2010年9月6日
發明者於書坤, C.H.波爾森, S.達爾斯加爾德, 王華明, I.尼科萊夫 申請人:杜邦營養生物科學有限公司