一種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法

2023-07-06 22:35:31

專利名稱：：一種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法
技術領域：
：本發明涉及豬瘟疫苗的研製領域，特別是可作為豬瘟防治的新型疫苗應用於臨床工作中的一種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法。
背景技術：
：豬瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的豬的一種烈性、病毒性傳染病，被國際獸疫周(0IE)和我國獸醫局列位A類傳染病，其症狀特別嚴重、傳播迅速、無國界，豬瘟的爆發往往造成巨大的經濟損失，並且引發嚴重的公共衛生問題。20世紀70年代後期，豬瘟的流行特點發生了很大變化，持續性感染造成非典型豬瘟的出現，以及免疫失敗事件的時有發生，不斷地威脅養豬業的健康發展。其中一個主要原因是不能徹底查清豬群是否存在持續性豬瘟病毒感染的情況，導致無法確定豬瘟病毒抗體的來源，從而無法準確的評價疫苗免疫效果。因此，研製符合疫情特點的新型豬瘟疫苗成為形式的需要。國內外的研究已經證實，E2是豬瘟病毒最主要的保護性抗原蛋白，存在4個獨特的抗原結構域A、B、C、D，位於E2N末端的690位866位胺基酸處，是病毒誘導產生中和抗體的主要部位，是中和性抗原結構域。利用生物學技術在體外表達的E2蛋白免疫動物可產生高水平的中和抗體，足以保護動物免受致死劑量豬瘟強毒的攻擊，因此E2基因是目前研製豬瘟基因工程疫苗的首選抗原基因。體外表達的重組E2蛋白具有抗原性好、表達量大、容易純化、可規模化生產的優勢，製備的基因工程疫苗安全、高效，不存在潛在的危害環境和人類安全的危險因素。同時發展起來的鑑別診斷技術可通過血清抗體檢測的方法準確區分基因工程疫苗免疫抗體和野毒感染抗體，及時發現群體中隱性感染豬瘟病毒的個體，從而採取相應的措施，剔出潛在的傳染源和導致豬瘟爆發的危險因素，達到淨化豬群的目的，將豬瘟的危害降到最小。但是單個E2基因的抗原表位數量有限，影響免疫效果。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種通過增加一個E2基因，能使抗原表位數量增加一倍，彌補抗原表位數量的不足，提高重組E2亞單位疫苗的免疫效果；通過增加胺基酸連接接頭，使獲得的E2蛋白能夠獨立形成空間結構，充分展示各自獨立的抗原表位的一種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法。為解決本發明的技術問題所採用的技術方法包括下述步驟A.利用逆轉錄-聚合酶鏈式反應方法克隆豬瘟疫苗株E2蛋白的編碼基因；B.構建融合E2基因利用基因重組技術，將雙E2基因串聯，在第二個E2基因5'端起始密碼子ATG上遊增加一個大腸桿菌￡coh'RBS5'-AAGGAG-3、序列；同時在串聯的兩個E2基因之間增加胺基酸接頭——5'-GSAGSAAGSGEF-3';C.構建重組表達載體rE2;D.rE2的誘導表達在LB液體培養基中表達rE2;優化表達條件，促進rE2蛋白的可溶性表達；E.rE2純化F.Westernblotting方法檢測rE2活性。2、根據權利要求1所述的一種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於所述步驟D中E2蛋白表達條件的優化是將含有E2基因的重組菌按2.0%的接種量轉接LB液體培養基中，37。C劇烈震蕩培養0D600"0.60.8，加入終濃度為0.10mmol/L的IPTG，在24。C條件下誘導表達24小時；超聲波冰浴條件裂解菌體，收集上清和沉澱樣品，SDS-PAGE凝膠鑑定，獲得可溶性的rE2蛋白質。本發明創造性地以雙E2基因串聯表達方式使E2抗原表位的數量增加一倍，顯著提高了重組E2亞單位疫苗的免疫效果；為了提高串聯後地E2蛋白表達效率，在第二個E2基因5'端起始密碼子(ATG)上遊增加一個大腸桿菌co力')特別是在雙E2基因串聯後的第二個E2基因的5'端起始密碼子(ATG)上遊增加一個大腸桿菌(fco乃')RBS序列(5'-AAGGAG-3');為了最大限度的降低雙基因表達後抗原表位被遮蔽地頻率，在串聯的兩個E2基因之間增加"胺基酸接頭"(AminoAcidLinker)5、-GSAGSAAGSGEF-3、(5'-GGCAGCGCAGGCAGCGCAGCAGGCAGCGGCGAATTC-3、)，促進目標蛋白的正確摺疊和可溶性表達，使獲得的E2蛋白能夠獨立形成空間結構，完整展示各自得抗原表位。利用融合雙基因E2蛋白製備重組亞單位疫苗，其免疫效果與豬瘟兔化弱毒疫苗免疫保護效果相當，可川於豬瘟的臨床免疫工作中。本發明的有益效果在於1.RBS序列對串聯地雙E2基!大l農達的促進作用。通過蛋白質電泳證實，rE2重組蛋白的大小與預測的大小一致，實現了兩個E2基因的共表達，增加的RBS(5'-AAGGAG-3、)提高了下遊E2基因的表達效率。2.胺基酸接頭的作用。在兩個同源E2基閎之問增加的胺基酸接頭可以有效地提高目標蛋白的可溶性，促進rE2蛋白形成正確的空間構象，同時減少包涵體的形成。3.rE2亞單位疫苗的安全性。通過rE2亞單位疫苗對供試動物的臨床反應、可以肯定的認為豬瘟病毒rE2重組亞單位疫苗對試驗動物是安全、可靠的，不會對試驗動物造成不良的影響。4.免疫效果。從抗豬瘟病毒抗體的消長規律和免疫效果的試驗可以得到如下的結論。(1)原核系統農達的可溶性rE2融合蛋白能夠誘導豬產生針對CSFV的中和抗體，足以抵抗致死劑量豬瘟強毒的攻擊下。(2)研製的rE2亞單位疫苗基本達到了豬瘟兔化弱毒細胞系疫苗的保護水平，可成為新型的基因工程疫苗應用在未來的豬瘟預防和控制工作當中。具體實施例方式實施例11、E2基因抗原區域的克隆和重組表達載體pCSFV-rE2的構建按照擴增CSFVE2基因的方法，設計兩對分別含有限制性酶切位點特異性引物見表一，單個E2基因序列跨度為569bp，串聯後為1138bp。表-引物的編號、序列、位賞、長度編號序列位置酶切位點f':2--i5'(;c(;(;ATccc(;GCTA(;c(.:T(;TMG(;AAGAT3'24342462B柳HIE2-l5'GCGMTCCTGTGTAATACACT(;aTCGC3'REcoRIEcoRitableseeoriginaldocumentpage6備註引物E2-2F:GAATCC酶切位點序列;GGCTTC胺基酸接頭序列；ATGGAT為E2基因本序列；RBS序列5'-AAGGAG-3提取疫苗毒株(C-株)總RNA，RT-PCR的方法擴增E2基因主要抗原區片段。雙酶切pGEX-6p-l載體和純化的E2片段，利用共有EcoRI酶切位點將兩個基因連接起來，構建重組表達載體，將其轉化DH5a感受態細胞，構建策略圖譜見圖一。重組質粒經核苷酸序列測定，在確保閱讀框(ORF)正確後，將陽性重組質粒命名為pCSFV-rE2，並轉化到BL21(DE3)感受態細胞中，進行蛋白質表達。2.重組蛋白的誘導表達和產物的SDS-PAGE鑑定LB培養基均為Amp+氨苄青黴素鈉，濃度為10(^g/iiiL。將挑取的單菌落接種到5mLLB液體培養基中，37"C過夜培養；按照2.0%的接菌量轉接LB液體培養基中，培養0D600L60.8，誘導劑IPTG的終濃度為1.0mol/L，37。C培養誘導6h.取lmL誘導後重組齒液，離心後收集沉澱。SDS-PAGE蛋白質電泳凝膠鑑定表達產物。3.E2蛋白表達條件的優化含有E2基因的重組菌按2.0%的接種量轉接1LLB液體培養基中，37。C劇烈震蕩培養0D600L60.8，加入終濃度為0.10mmol/L的IPTG，在24。C條件下誘導表達21小時；超聲波冰浴條件裂解菌體，收集上清和沉澱樣品，SDS-PAGE凝膠鑑定。4.SDS-PAGE和Westernblotting分析目標蛋白試驗表明，在58kDa處有-一條明顯特異性蛋白帶，該蛋白條帶可以被豬瘟的陽性血清識別，確定H的蛋白已經表達。5.豬體攻毒保護實驗5.1CSFVrE2亞單位疫苗豬體免疫試驗5.1.1試驗動物未免疫豬瘟疫苗的50n齡斷奶仔豬(15-20kg)40頭，經檢測無豬瘟病毒血清抗體。5.1.2、試驗設計實驗設rE2亞單位疫苗免疫組30頭豬(SYp組)，設C株豬瘟兔化弱毒疫苗免疫對照5頭豬(Cp組)，空白對照組5頭豬(Bp組)。免疫方法及劑量見表二。兩次免疫時間間隔4周。二免4周後進行免疫效果試驗，即攻毒試驗。5.1.3病毒每株C株豬瘟兔化弱毒疫苗來A商品化的細胞疫苗(40頭份/瓶)；攻毒用的豬瘟病毒為石門系血毒。表二試驗豬分組及免疫劑量tableseeoriginaldocumentpage7備a::—W次免疫E2抗原ffl生理鹽水稀釋，然後滴加卜.j休枳的弗式佐劑(Sigma公,d產品)，充分乳化，豬/l:頸部肌肉沐射lmL/頭.，D對照組漢接種化中位疫苗免疫組相lni劑it的生理鹽水.以IDEXX公司生產的"豬瘟病毒抗體診斷ELISA試劑盒"檢測豬瘟病毒抗體阻斷率，阻斷率》40%抗體陽性，阻斷率《30%為陰性，介於兩者之間為可疑。5.2、E2亞單位疫苗對豬的臨床反應和病理變化5.2.l豬的臨床反應5.2.1.1E2亞單位疫苗免疫豬組(1)試驗組購買的40頭試驗豬按照試驗設計隨機分組，在試驗場地飼養7天，每天測量體溫，結果表明試驗用的動物體溫在38.(TC40.(TC之間，屬於豬的正常體溫範闈，符合試驗要求。飼養期間試驗動物精神狀態良好，食慾旺盛，沒有異常的臨床反應，符合試驗要求.(2)免疫期間的臨床反應rE2亞單位疫苗免疫豬後每天測量體溫。rE2亞單位疫苗免疫組、C株疫苗免疫組和空白對照組的豬體溫在38.(TC40.0。C之間變化，屬於正常體溫範圍.在此期間動物精神狀態良好，採食」H常，生長正常.未出現異常的臨床反應.5.3rE2亞單位疫苗在豬體內的抗體消長規律和攻毒保護實驗5.3.l抗體消長規律第二次亞單位疫苗後4周進行攻毒保護試驗。統計攻毒試驗前宰殺的8頭SYp組豬、2頭Cp組豬和2頭Bp組的血清抗體消長規律(見表三)。表三部分試驗豬的抗體阻斷率tableseeoriginaldocumentpage8判斷標準:阻斷率240W豬瘟病&抗體m性，阻斷率530%為陰性，介丁'兩者之間為可疑。喪中黑體部分為陽性依。通過表三數據統計的結果可知，所有rE2亞單位疫苗免疫組(SYp組)豬的血潔抗體在首次免疫14天後全部為陽性.SYp組與弱毒疫苗免疫組(Cp組)和空白對照組(Bp組)比較發現，rE2亞單位疫苗可以刺激機體產生特異性抗豬瘟病毒抗體，其效果基本達到了與Cp組相同的效果，並且在豬體內，亞單位疫苗產生的豬瘟病毒抗體穩定的、持續性的存在.5.3.免疫效果試驗5.3.1攻毒方法參考"豬瘟兔化弱毒疫苗n型"的豬效力保護試驗方法，進行攻毒保護試驗。剩餘28頭試驗豬在相同條件下分別在頸部皮下注射石門血毒lmL(l(f感染劑量)，每H觀察試驗豬的精神狀態、食慾等臨床反應。5.3.2結果攻毒5天後，對照豬Bpl死亡，8天後Bp3死亡，10天最後1頭空白對照豬死亡。在此期間，rE2亞單位疫苗免疫豬和弱毒疫苗免疫豬未出現異常臨床反應和豬瘟的臨床症狀。根據"豬瘟兔化弱毒疫苗II型"的豬效力保護試驗的要求"如果設4(3頭)頭攻毒對照豬全部發病至少死亡3(2頭)頭，而效檢豬(E2亞單位疫苗免疫組和弱毒疫苗免疫組)全部鍵活或稍有體溫反應，但無豬瘟臨床症狀出現，為免疫合格"的判斷標準，可以判定在攻毒後，亞單位疫苗免疫組和弱毒疫苗免疫組的豬全部被保護。試劑和材料1、毒株由中國農業科學院蘭州獸醫研究所保存。2、引物和測序由Takara公司合成。3、Sigma公司:辣根過諷化物酶標記的兔抗IgG、TMB、IPTG、核酸電泳、弗式佐劑和蛋白電泳所用試劑。4、Takara公司組織總DNA提取試劑盒、擴增用單核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高保真的Taq酶、限制性核酸內切酶(BamHI、Xholl、EcoRI)、T4DNA連接酶。5、安瑪兩亞瓊脂糖4B填料、超濾濃縮管。6、IDEXX公司提供"豬瘟病毒抗體診斷ELISA試劑盒"。序列表OrganizationApplicantStreet:鹽場路徐家坪1City:蘭州State:甘肅Country:中華人民共和國PostalC。de:730046PhoneNumber:0931-8342706FaxNumber:0931-8342052EmailAddress:yinshuanghuikangr置63.comOrganizationName:中國農業科學院蘭州獸醫研究所ApplicationProject〈120〉Title:—種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法〈130>AppFileReference:M.M.Hulst，D.FWestra，G.Wensvoort，R.J.M.Moormann,GlycoproteinElofhogcholeravirusexpressedininsectcellsprotectsswinefromhogcholera,J.Virol.67(1993)5435-5442.〈140〉CurrentAppNumber:10003.2006.7〈141>CurrentFilingDate:2000-06_30Sequence〈213>OrganismName:classicalswinefevervirusE2gene〈400〉PreSequenceString:gaagattacaggtacgcaatatcgtcaaccgatgagatagggctacttggggccggaggt60ctcaccaccacctggaaggaatacaaccacgatttgcaactgaatgacgggaccgtcaag120gccagttgcg180ttggcgtcat240gggaccaacc300gatacgagtc360tatcttgtct420actctgagga480gattgtgtga540tggacatgtg600cacaaagtga660tctggcg卿720catcaccatg780gccgg郷tc840accgtcaagg900aggaggtatt960ctgttcgacg1020tggcaggttctgcataagaacatcaactgactgttgttaagcccaataggca,gtggtccaccatagttg肌aggcgaggaatgaagtatgccctgttaagattacagtcaccaccacccagttgcgttggcgtcattggaccaacccctttaaagtcggctttacccggaaatgggagggaaagtacgtggacgggtaaagaccttcggaaaatgaBattcaaggagaatggtccgcagtagccttagtacgcaatactggaaggaaggcaggttccgcataagaagatcaactgagacagcacttaacttccgtgagatgacttcaaatacgacctgtcatagagtaggagagacagatttattctatggctggcttggtttggtgttcggctacgtcgtcaaccgtacaaccscgtttaaagtcagctttacccagaaatgggagatgtggtcagcattcgagctggtccgggcttgttgaacgggcacagcagtagccctttccattgtaagttccgctgctggacgctggctctaggatatcaatg卿taggatttgcaactcagcacttaacttccgtgacatgacttcagtaggaggtatcctgttcgacgtgcccgttttaatgctttcgagcccaacagcacagaatgggggggc朋cttctggcaaacgctgctggtgcaccatcacgctacttggggaatgacgggtgtggtcagtattcgagctcgtccgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgttaagggaaagtacaatacgaccttgttgaacggt1080aatgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgtcatagagtgcacagcagtg1140agcccaacaactctgaggacagaagtggtaaagaccttcaggagagacaagccctttccg1200cacagaatggattgtgtgaccaccatagtggaaaatgaagatttattctattgtaagttg1260gggggcaactggacatgtgtgaaaggc1287〈212〉Type:腿<211〉Length:1287SequenceName:rE2vaccineSequenceDescription:FeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:E2gene<222〉LocationFrom:1〈222〉LocationTo:558OtherInformation:第一個E2基因CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:CDS<222〉LocationFrom:1<222〉LocationTo:1286OtherInformation:CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:<221〉FeatureKey:EcoRI〈222〉LocationFrom:559〈222〉LocationTo:564OtherInformation:限制性酶切位點EcoRICDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:ABS<222〉LocationFrom:565〈222〉LocationTo:570OtherInformationCDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:ATG<222〉LocationFrom:571〈222〉LocationTo:573OtherInformation:CDSJoin:No大腸桿菌核糖體識別位點起始密碼子FeatureSequence:rE2vaccine:<221〉FeatureKey:AminoAcidLinker<222〉LocationFrom:574<222〉LocationTo:729OtherInformation:增加的胺基酸接頭序列CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:FeatureKey:E2geneLocationFrom:730<222〉LocationTo:1286OtherInformation:串聯的第二個E2基因序列CDSJoin:NoThesisSequence:rE2vaccine:<301〉Authors:vanRijnPA.，MiedemaGKW.，WensvoortG.，etal.Title:Classicalswinefevervirus(CSFV)envelopeglycoproteinE2containingonestructuralantigenicunitprotectspigsfromlethalCSFVchallenge<306〉PageRange:2737-2745〈307〉Date:1996-—-—<308〉DBAccessionNumber:〈309〉DBEntryDate:_-—-—From:To:權利要求1、一種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於包括下述步驟A.利用逆轉錄-聚合酶鏈式反應方法克隆豬瘟疫苗株E2蛋白的編碼基因；B.構建融合E2基因利用基因重組技術，將雙E2基因串聯，在第二個E2基因5′端起始密碼子ATG上遊增加一個大腸桿菌E.coliRBS5`-AAGGAG-3`序列；同時在串聯的兩個E2基因之間增加胺基酸接頭——5`-GSAGSAAGSGEF-3`；C.構建重組表達載體rE2；D.rE2的誘導表達在LB液體培養基中表達rE2；優化表達條件，促進rE2蛋白的可溶性表達；E.rE2純化F.Westernblotting方法檢測rE2活性。2、根據權利要求1所述的一種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於所述步驟D中E2蛋白表達條件的優化是將含有E2基因的重組菌按2.0%的接種量轉接LB液體培養基中，37'C劇烈震蕩培養0D600^0.60.8，加入終濃度為0.10ramol/L的IPTG，在24"C條件下誘導表達24小時；超聲波冰浴條件裂解菌體，收集上清和沉澱樣品，SDS-PAGE凝膠鑑定，獲得可溶性的rE2蛋白質。全文摘要一種豬瘟重組亞單位疫苗的製備方法，包括下述步驟A.利用逆轉錄-聚合酶鏈式反應方法克隆豬瘟疫苗株E2蛋白的編碼基因；B.構建融合E2基因C.構建重組表達載體rE2；D.rE2的誘導表達E.rE2純化。F.Westernblotting方法檢測rE2活性。本發明創造性地以雙E2基因串聯表達方式使E2抗原表位的數量增加一倍，顯著提高了重組E2亞單位疫苗的免疫效果；為提高雙E2蛋白表達效率，在第二個E2基因5′端起始密碼子(ATG)上遊增加一個大腸桿菌RBS序列(5′-AAGGAG-3′)；同時在串聯的E2基因之間增加胺基酸接頭5′-GSAGSAAGSGEF-3′，使獲得的E2蛋白能夠完整展示其抗原表位。本發明的E2蛋白重組亞單位疫苗，免疫保護效果與豬瘟兔化弱毒疫苗相當。文檔編號C12N15/70GK101418303SQ20081015030公開日2009年4月29日申請日期2008年7月6日優先權日2008年7月6日發明者劉湘濤,劉豔紅,孫世琪,尚佑軍,尹雙輝,宏田,韓雪清申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所