通過殼聚糖處理提高青蒿中青蒿素含量的方法

2023-07-06 18:14:41

專利名稱：通過殼聚糖處理提高青蒿中青蒿素含量的方法
技術領域：
本發明屬於生物培養技術領域，具體涉及一種提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技術：
青蒿素作為一種有效的抗瘧藥物已經得到全世界的認同。目前，青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取。Artemisia a皿ua L.(青蒿)又名黃花蒿，是一年生草本藥用植物。由於青蒿中青蒿素的含量非常低(佔乾重的0.01% -1% )，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。雖然現在已經能夠人工合成青蒿素，但由於難度大，產量低，成本高，不具備商業化生產的可行性。 利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素是一種很有吸引力的方法。然而青蒿素在愈傷組織中含量低於乾重的O. 1%，在芽中最高也只有乾重的0. 16%，而大多數研究在根中沒有檢測到青蒿素，因此利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的可行性不高。另外利用基因工程技術獲得青蒿素含量較高的青蒿新品種是一種較可行的方法，但目前利用基因工程來提高青蒿素含量還處於嘗試階段。 經對現有技術的文獻檢索發現，Dahua Chen等在《Plant Science》(《植物科學》，2000年155期179-185頁)發表了題為"Expression of a chimeric farnesyldiphosphatesynthase gene in Artemisia annua L transgenic plants via Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation"("通過農桿菌介導轉化在青蒿植株中表達法尼基焦磷酸合酶基因")的論文，報導通過在轉基因青蒿植株中過量表達FPS(法尼基焦磷酸合酶)使青蒿素的含量在原有基礎上提高了 2-3倍，但仍只有乾重的1%左右。

發明內容
本發明的目的在於提供一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，且無需高昂的前期投入，操作簡單，便於規模化生產。 本發明提出的提高青蒿中青蒿素含量的方法，是在青蒿開花前期，在採收前1-3
天，用殼聚糖溶液噴青蒿苗植株，然後按期採收，即可提高青蒿中青蒿素的含量。 本發明中所述的殼聚糖溶液，其濃度優選為50 ii M-150 ii M。 本發明中，對青蒿植株培養的具體步驟為，首先將青蒿種子種植於發苗培養基中發苗，然後將青蒿苗移栽於泥炭珍珠巖培養基質中。 所述的發苗培養基，是通過在MS培養液中另外添加25-35g/L的蔗糖和2_3g/L的植物凝膠而得。其中MS培養液為Murashige and Skoog於1962公布。
所述植物凝膠，是指購自Sigma公司的產品Phytagel 。 所述的將青蒿苗移栽，是指待青蒿苗長至5cm左右(如4-6cm)時將其移栽於泥炭珍珠巖培養基質中。 所述泥炭珍珠巖培養基質，其中泥炭和珍珠巖的比例為1 : 0.5-1 : 2。 所述的將青蒿苗移栽於泥炭珍珠巖培養基質中，用普通營養液每周澆灌青蒿苗一
3次。 所述的普通營養液，其組分的重量百分比為0.0033% NH4N03、0.0038% KN03、0. 00088% CaCl2. 2H20、0. 00074% MgS04. 7H20禾口 0. 00034%腿2 04，餘量為水。
本發明的原理在於，用殼聚糖溶液處理青蒿植株能夠在短時間(例如4-48小時)內提高一些青蒿素合成關鍵酶基因的表達，打破青蒿素合成途徑中的一些限速步驟，從而在短時間內積累大量的青蒿素。所述的一些青蒿素合成關鍵酶基因，是指3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶(3_hydroxy_3_methylglutaryl CoA reductase,腦R)基因hmgr、法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase, FPS)基因fps和紫穗槐二烯氧化酶(amorpha-4， 11-diene C-12 oxidase, CYP71AV1)基因cyp71avl。 本發明建立了通過殼聚糖處理提高青蒿素含量的方法，能有效地提高青蒿中青蒿素的含量，處理過的青蒿中青蒿素的含量比對照提高了 11% _60%。本發明的方法不需要利用基因工程方法提高青蒿素含量所需要的相對較高的前期投入，操作簡單，便於規模化生產，對降低青蒿素的生產成本具有重要意義。


圖1為用不同濃度的殼聚糖處理青蒿植株後青蒿素含量的變化示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
實施例 將青蒿種子(來源於重慶酉陽青蒿素含量較高的青蒿品種)種植於發苗培養基上發苗，發苗培養基的配方為MS培養液，其中添加25-35g/L的蔗糖和2-3g/L的植物凝膠。待青蒿苗長至5cm左右移栽於泥炭珍珠巖培養基質(泥炭和珍珠巖的重量比例為1 : 0.5-1 : 2)中，用普通營養液每星期澆灌一次。其中普通營養液組分按重量百分比計為0. 0033% NH4N03、0. 0038% KN03、0. 00088% CaCl2. 2H20、0. 00074% MgS04. 7H20和0. 00034% K^P(V餘量為水。待植株生長到40-60cm左右(植株開花前期)，用殼聚糖溶液處理青蒿植株，同時用水處理的青蒿植株作為對照。兩天後，收穫整株青蒿的葉片，用高效液相色譜測定青蒿素含量。 在上述相同的條件下，分別用50iiM、100iiM和150iiM的殼聚糖溶液處理青蒿植株，3個實施例的結果如圖l所示，對照植株中青蒿素含量佔乾重的1. 1% _1.4%，用殼聚糖處理過的植株中青蒿素含量有了顯著的提高。用50iiM的殼聚糖處理後，青蒿中青蒿素的含量達到乾重的1.5% -1.6% ;用100i!M的殼聚糖處理後，青蒿素含量達到乾重的1.2% -1.3% ;150iiM的殼聚糖處理後，青蒿素含量達到乾重的1.6% -1.8%。
應用本發明的方法，在收穫青蒿前兩天用殼聚糖溶液噴灑青蒿植株，可以顯著提高青蒿素的含量，並且不影響青蒿植株的生物量，從而顯著地提高了青蒿素的產量。由於本方法所採用的殼聚糖濃度低，因此具有投資少、效果顯著、方便易行的特點，對於降低青蒿素的生產成本、滿足青蒿素的大規模生產具有重要意義。
權利要求
一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特徵在於具體步驟為，在青蒿開花前期，在採收前1-3天，用殼聚糖溶液噴青蒿苗植株，然後按期採收。
2. 根據權利要求1所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特徵在於，所述的殼聚糖溶液，其濃度為50 ii M-150 ii M。
3. 根據權利要求1所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特徵在於，所述的青蒿苗植株的培植步驟如下首先將青蒿種子種植於發苗培養基中發苗，然後將青蒿苗移栽於泥炭珍珠巖培養基質中；所述的發苗培養基，是通過在MS培養液中另外添加25-35g/L的蔗糖和2-3g/L的植物凝膠而得；所述的將青蒿苗移栽，是指待青蒿苗長至5cm左右時將其移栽於泥炭珍珠巖培養基質中；所述泥炭珍珠巖培養基質，其中泥炭和珍珠巖的重量比例為1 : 0.5-1 : 2。
4. 根據權利要求3所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特徵在於，所述的將青蒿苗移栽於泥炭珍珠巖培養基質中，用普通營養液每周澆灌青蒿苗一次；所述的普通營養液，其組分的重量百分比為0.0033 % NH4N03、0. 0038 % KN03、`0. 00088% CaCl2. 2H20、0. 00074% MgS04. 7H20禾口 0. 00034%腿2 04，餘量為水。
全文摘要
本發明屬於生物培養技術領域，具體為一種通過殼聚糖處理提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發明首先將青蒿種子種植於發苗培養基中發苗，然後將青蒿苗移栽於泥炭珍珠巖培養基質中，在採收前1-3天用殼聚糖溶液噴灑青蒿苗植株，即能使青蒿中青蒿素的含量提高。本發明能有效地提高青蒿中的青蒿素含量，操作簡單，不需要利用基因工程的方法提高青蒿素含量所需要的相對較高的前期投入，有效降低青蒿素的生產成本，對滿足青蒿素大規模生產具有重要意義。
文檔編號C05G1/00GK101785406SQ20101010559
公開日2010年7月28日 申請日期2010年2月4日 優先權日2010年2月4日
發明者唐羅歐, 孫小芬, 王玥月 申請人:復旦大學