核酸序列，含有它們的載體，藥物組合物和治療用途的製作方法

2023-07-06 20:37:36 1

專利名稱：核酸序列，含有它們的載體，藥物組合物和治療用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及核酸序列，含有它們的載體，及其治療用途，特別是基因治療用途。更具體講，本發明涉及含有細胞內結合蛋白(PIL)編碼基因的核酸序列，和它們的基因治療應用，它們結合或不結合在適當的表達載體中。
基因治療就是通過向有關細胞或器官中引入遺傳信息以校正缺陷或異常(突變、異常表達等)。該遺傳信息或在體外引入從器官取出的細胞，改造後的細胞再返回機體中，或直接引入體內適當組織中。關於這一點，文獻中已描述了不同的轉染和基因轉移技術(參見，Roemer和Friedman的Eur.J.Biochem.208(1992)211)。迄今為止，現有技術中提出的基因治療途徑是轉移遺傳病中有關活性多肽(激素、生長素等)，反義基因或為進行免疫接種的抗原性肽的編碼基因。本發明涉及一種新的基因治療途徑，它是轉移並在靶細胞(或組織)中表達一種能夠與細胞元件相作用從而影響細胞功能的胞內肽。本發明更具體是基於證明了體內表達可控制某些細胞功能的改性抗體、然後該抗體留在細胞內的可能性。本發明還基於證明了在用於基因治療的載體(特別是病毒載體)中克隆編碼這種胞內抗體的DNA序列的可能性。
利用抗體進行人體治療一般使其定向並中和循環系統中和/或位於細胞表面的生物複合物，引起免疫系統產生一系列反應，從而將它們消除。但對腫瘤或由如病毒引起的疾病，該方法大多是無效的，因為注入的抗體無法接近引起染病細胞失調的抗原。本發明提供一種新的特別有利的治療方法，它是在細胞內連續產生抗體或治療物，通過與其表位結合減小和/或消除失調。
文獻中已描述了重組表達抗體的可行性。例如，專利EP88994描述了抗體重鏈或輕鏈可變區的體外表達和純化。同樣，US4946778描述了用接頭連接的抗體重鏈和輕鏈可變區所組合的改性抗體之編碼DNA的體外表達。但此專利中描述的抗體無活性，並且一般以不可溶的內含體形式合成。這樣的抗體需經受化學處理(變性、復性等)進行純化，以得到活性形式。本發明證明可以利用這樣的DNA序列在體內直接表達活性胞內抗體。本發明還證明可以利用編碼胞內抗體的這種DNA序列特別在人體中進行基因治療，該序列受使其在哺乳動物細胞中表達的區域的控制。這一新方法使得可以定向於常規免疫接種方法無法接近的細胞元件。而且這一途徑不涉及免疫應答的發展，只是細胞內作用。
因此，本發明的第一個目的在於含有細胞內結合蛋白(PIL)編碼基因的核酸序列，該序列在使得其在哺乳動物細胞中表達的區域控制之下。
本發明還涉及含有如上所定義的核酸序列的載體。更具體講，本發明載體為病毒來源，如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、HSV病毒等。
本發明還涉及這些核酸序列或載體在製備用於外科治療和/或治療人體或動物的藥物組合物中的用途。本發明還涉及含有如上所定義的載體(特別是病毒載體)或核酸序列的藥物組合物。
在本發明的意義上細胞內結合蛋白(PIL)指所有能夠識別其表達所在細胞的元件、選擇性地相互作用並與之親和的蛋白或蛋白片段。這涉及共價或非共價的化學作用。通過與細胞元件(蛋白質、脂質、胺基酸、mRNA、tRNA、rRNA、DNA等)的相互作用，可作用於涉及所述元件的細胞功能，從而控制(刺激、減弱、抑制)該功能。
優選地，本發明的細胞內結合蛋白由抗體衍生的分子或具有與抗體相當的結合特性的分子組成。特別是具有足夠的選擇性和親和性能在體內中和抗原的蛋白質。由於它們的特性和位置以下稱這些分子為細胞內抗體。
免疫球蛋白類的分子—抗體—是天然合成的分泌蛋白(主要是B淋巴細胞)。它們被釋放到細胞外(循環系統)，並在那裡顯示它們的活性(在異地識別並與抗原結合)。現已證明，可以在體內表達編碼細胞內抗體的改性基因，而不影響抗體的特異性和親和力。因此編碼細胞內抗體的本發明核酸序列包括以某種方式改造使抗體不被分泌的抗體基因。具體講，一般通過缺失或突變負責其分泌的序列來改造抗體基因。本發明的細胞內結合蛋白特別可由含抗原結合區的抗體片段組成，如Fab或F(ab)』2片段。但這類細胞內抗體的應用涉及含多個基因的核酸序列的表達，它們分別編碼這些片段的重鏈區和輕鏈區；還涉及這些鏈的體內正確組裝。因此，可用於本發明的細胞內抗體的一種特別有利的形式是相應於抗體輕鏈可變區結合位點的肽通過肽接頭與相應於抗體重鏈可變區結合位點的肽連接。這類稱為ScFv的細胞內抗體的應用是很有益的，因為它由單一基因表達。在實施例中說明如何構建編碼本發明這種改性抗體的核酸序列。
另外，編碼本發明細胞內抗體的核酸序列還可以通過化學、酶或遺傳途徑來改造，以產生穩定的、和/或多功能的、和/或長度減小的細胞內抗體，或為了有利於它們在細胞內的定位。例如，本發明的核酸序列可含有編碼核定位肽的序列(NLS)。特別是，可以將本發明的序列與SV40病毒的NLS編碼序列融合，後者的肽序列如下MPKKKRK(Kalderbn等，Cell 39(1984)499)。
如上所述，本發明的核酸序列含有使編碼PIL的基因在哺乳動物細胞中表達的序列。因此，一般將PIL基因置於轉錄和翻譯啟動子區的控制下，這些啟動子區要在希望進行表達的哺乳動物細胞中有功能。這可以是與所述細胞同源的序列，即天然負責基因在所述細胞中表達的序列。還可以是不同源的序列，即負責蛋白在其它類型細胞中表達的序列，負責抗體在天然條件下表達的序列，病毒表達序列，例如存在於其中引入了本發明序列的載體中，或者合成或半合成序列。
對用於人體的情況，文獻中已描述了許多功能性啟動子，例如病毒啟動子CMV、SV40、Ela、MLP、LTR等。細胞啟動子如絨毛蛋白基因的啟動子是有利的，因為它們使得表達具有組織特異性(對絨毛蛋白而言限於腸部)。
另外，還可以改造表達序列，例如為了適應載體或細胞的具體類別，減小其長度，提高其轉錄啟動子的活性，產生可誘導的啟動子，改善其調控水平，甚至改變其調控性質。這種改造例如可通過體外誘變、引入另外的控制元件或合成序列、或原始控制文件的缺失或取代來實現。使用組織特異性啟動子特別有利，以便將PIL的表達定向於單一的組織中。
另外，當核酸序列不含表達序列時，可在表達載體中這種核酸序列的下遊將其引入。
為了製備本發明的載體，首先應鑑定例如希望治療的疾病中有關的或負責的細胞功能。然後鑑定該功能中涉及的適當細胞元件，然後確定哪一個PIL在其定位、作用、性質等上最適於該元件(抗體、衍生物等)。所選出的PIL的相應核酸序列可通過分子生物學技術(化學合成、克隆、酶修飾等)獲得，並按實施例中描述的方法插入適當的載體中。
本發明的另一目的涉及含有至少一種上述定義的核酸序列或載體的藥物組合物。
例如注射給人或動物後，本發明的序列可用於誘導PIL的細胞內表達，以影響所確定的細胞功能。特別是該序列可按WO 90/11092中描述的技術以裸DNA形式注射。也可以複合物的形式給藥，例如與DEAE—葡聚糖(Pagano等，J.virol.1(1967)891)，與核蛋白(Kaneda等，Science 243(1989)375)，與脂類(Felgner等，PNAS 84(1987)7413)的複合物，或以脂質體的形式施用(Fraley等，J.Biol.Chem.255(1980)10431)等。
在本發明的一個優選實施方案中，將如上所定義的核酸序列引入載體中。使用這種載體實際上有利於穿入細胞、增加對酶的耐性和提高穩定性和細胞內表達水平。本發明的載體既可以是質粒的也可以是病毒的。但優選使用病毒載體。
因此在一優選實施方案中，本發明涉及插入在病毒載體中的如上所定義的核酸序列。本發明還涉及在其基因組中插入了至少一種編碼PIL的核酸序列的所有重組病毒。
如上所述，有不同的病毒可用作轉移並在體內表達本發明基因的載體。例如，可舉出逆轉錄病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺相關病毒、腺病毒、痘苗病毒等。
本發明的重組病毒最好是缺陷病毒。「缺陷病毒」這一術語指在靶細胞中不能複製的病毒。一般地講，用於本發明範圍的缺陷病毒的基因組缺少至少一種所述病毒在所染細胞中複製所必需的序列。這些區域可被消除(全部或部分)，或使其非功能化，或被其它序列(特別是本發明的核酸序列)取代。該缺陷病毒優選仍保留其基因組中病毒顆粒包衣所必需的序列。
文獻中已描述了源自逆轉錄病毒、腺相關病毒、HSV病毒(單純皰疹病毒)或腺病毒的缺陷重組病毒。.
使用插入在缺陷型重組腺病毒中的本發明核酸序列是特別有利的。
實際上存在不同的腺病毒血清型，其結構和特性有些不同，但對人是非病原性的，特別是對非免疫低下的對象。另外，這些病毒不整合在所感染細胞的基因組中，並可插入外源DNA的大片段。在不同的血清型中，本發明範圍內優選使用2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。對腺病毒Ad5而言，複製必需序列為E1A和E1B區。
另外，根據本發明編碼胞內抗體的基因較短，這一點使得可以有利地在同一載體中同時引入編碼胞內抗體的多種基因，這些胞內抗體針對宿主細胞的一個或多個元件的不同區域。本發明的一個具體實施方案是含有編碼針對不同表位的細胞內結合蛋白的至少兩種核酸序列的載體，特別是病毒載體。
可通過缺陷病毒載體與帶有以上定義的核酸序列的質粒之間的同源重組來製備本發明的缺陷重組病毒(Levrero等，Gene 101(1991)195；Graham，EMBO J.3(12)(1984)2917)。所述病毒和質粒共轉染到適當的細胞系中後發生同源重組。所用細胞系優選應(i)可被所述元件轉化，和(ii)含有能夠補充病毒基因組缺陷部分的序列，優選以整合形式補充以避免重組的危險。作為製備缺陷重組腺病毒可用的細胞系實例，可提及人胚胎腎細胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1977)59)，它特別含有整合在其基因組中的腺病毒Ad5基因組左側部分(12％)。作為可用於製備缺陷逆轉錄病毒的細胞系實例，可提及CRIP細胞系(Danos和Mulligan，PNAS 85(1988)6460)。
然後病毒增殖並按分子生物學經典技術回收和純化。
本發明還涉及含有如上所定義的至少一種缺陷重組病毒的藥物組合物。
可適當配製本發明的藥物組合物，以通過表皮、口服、胃腸外、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、眼內等途徑給藥。
藝選地，在本發明藥物組合物中含有注射劑配方可接受的藥用載體。特別是無菌、等滲的鹽水溶液(磷酸一鈉、磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或幹組合物，特別是凍幹品，它通過加入無菌水或生理血清能形成注射溶液。
用於給藥的核酸(序列或載體)的劑量可與不同參數相適應，特別是所用給藥方法、有關的疾病、要表達的基因、還有要求的治療時間。一般地，本發明的重組病毒被配製成104—1014pfu/ml，優選106—1010pfu/ml的劑量，並以此形式給藥。pfu(空斑形成單位)相當於病毒溶液的感染能力，通過感染適當的細胞培養物，一般5天後測量被感染細胞的空斑數目。病毒溶液滴度pfu的測定技術在文獻中有充分的說明。
本發明的目的還在於含有如上定義的核酸序列的所有重組細胞。
含在載體中或不在載體中的本發明序列及含有它們的藥物組合物可用於許多疾病的治療。例如它們可用於在體內所有類型組織中轉移並表達基因。另外還可以根據所治療疾病進行靶向治療(向具體組織水平的轉移特別由載體的選擇決定，而表達由具體啟動子的選擇決定)。本發明的序列或載體有利地用於在人或動物體內產生胞內蛋白，這些蛋白能夠特異性地作用於各種細胞功能，例如細胞增殖、代謝物的合成、蛋白合成、DNA的複製和/或轉錄等。因此本發明使得可以特異、局部和有效地治療許多細胞功能障礙，這些細胞功能障礙造成不同疾病，尤其是癌、病毒或細菌疾病，或更廣義地講，所有其中可鑑定出細胞介質的疾病。用於治療與細胞增殖相關的疾病在一特別有利的方案中，本發明的核酸序列含有編碼PIL的基因，該PIL能夠作用於並影響細胞增殖中相關因子的活性。細胞增殖要調動各種因子，如膜受體(G蛋白)、癌基因、酶(蛋白激酶、法尼基轉移酶、磷酸脂酶等)、核苷(ATP、AMP、GDP、DTP等)，活化因子[鳥苷(GRF、GAP等)交換因子、轉錄因子等]等。能夠結合併中和這種因子的本發明PIL的細胞內表達，使得能控制細胞增殖的進程。在細胞增殖逃出天然調控機制，導致例如出現腫瘤的情形下，這一點是特別有益的。實際上許多因子(瘤基因的基因產物和在這些產物效果的信號化中相關的因子)已與細胞增殖的失調現象相關。例如，90％的胰腺癌具有在第十二個密碼子上突變的癌基因Ki—ras(Almoguera等.，Cell 53(1988)549)。同樣，已證明結腸腺癌和甲狀腺癌(50％)中，或在肺癌和髓細胞性白血病(30％，Bos，J.L.Cancer Res，49(1989)4682)中存在突變的ras基因。現已鑑定出許多其它癌基因(myc，fos，jun，ras，myb，erb，等)，其突變形式似與細胞增殖的失調有關。
表達能夠結合這些細胞因子(優選它們的致癌形式)的PIL，從而減弱或抑制其作用，這提供了一種治療癌症新途徑的可能性。
在一特別有意義的方案中，本發明涉及含有包括細胞內抗體編碼基因的核酸序列的載體，所述細胞內抗體能夠與癌基因的表達產物或與癌基因信號化途徑中相關的因子相作用。
在目標癌基因中，本發明意義上可舉出癌基因ras，fos，jun，myc，myb和erb。
在癌基因信號化途徑中相關的因子中，可特別舉出膜受體—可定向於其分子內區段—[G蛋白，激酶(例如酪氨酸激酶)，磷酸化酶，法尼基轉移酶]，核苷交換因子(GAP、GRF因子等)等。
更優選地，本發明涉及含有編碼胞內抗體的核酸序列的載體，特別是病毒載體，該胞內抗體針對癌基因或癌基因信號化途徑中相關的因子，由相當於抗體輕鏈可變區的結合位點的肽與相當於抗體重鏈可變區結合位點的肽通過肽接頭連接而成。
更具體講，本發明涉及表達針對ras依賴性信號化途徑之因子的胞內抗體的缺陷重組病毒。
如實施例中所示，轉化癌細胞後抗P21(ras基因表達產物)、抗GAP或抗P53胞內抗體的表達使得表型回復。用於治療病毒疾病本發明核酸序列也可以是能夠作用於病原性病毒(HIV、乳頭瘤病毒等)感染周期的胞內抗體的編碼序列。
更具體講，在HIV病毒的例子中，實際可得的抗病毒藥或在後期臨床試驗中的抗病毒藥，不能阻斷病毒的增殖，而僅阻仰疾病的發展。這主要是因為對這些抗病毒藥的耐性株的出現。有效免疫接種的發展也遇到了許多障礙HIV的遺傳變異使得不能確定一穩定的抗原結構，以提供對抗存在的不同菌株的體液或細胞免疫反應。象在抗病毒藥的情況中病毒通過點突變耐受選擇壓力一樣，迄今為止嘗試的免疫接種試驗中，HIV似乎逃逸免疫系統。
本發明構成一種治療HIV感染的新途徑，即通過表達PIL(特別是細胞內抗體)在其複製周期中封閉病毒。本發明特別解決了疫苗和抗病毒藥途徑中遇到的遺傳變異問題。在經典的免疫接種中，已證明免疫反應主要發生在可變區。而使用本發明的細胞內抗體可以選擇不僅保守而且對一種病毒蛋白功能必不可少的表位。優選地，細胞內抗體是針對長度足以阻止通過點突變偏移產生耐性和適應性的病毒的表位。另外，編碼本發明胞內抗體的基因長度較小，可以用同一基因治療載體有利地定向於(單一或多種蛋白)的多個區域。
tat和rev這兩種主要病毒調控蛋白是實施本發明最重要的靶標。實際上，這兩種蛋白是病毒複製必不可少的。而且，針對tat或rev信使RNA的反義信使RNA或核酶的表達阻止病毒複製。這些蛋白的作用機制有相當多的文獻依據tat是轉錄的反式激活因子，而rev保證複製周期早期和晚期間的轉換。這兩種蛋白固定在病毒信使RNA上時顯示其活性，並且已相當明確地限定了這種固定所需的肽區域，這對其功能是必不可少的。另外，已證明它們在RNA上的固定位點(tat為TAR區，rev為RRE區)的過度表達(Surexepression)，抑制其對病毒表達的功能。
在這些條件下，本發明的一個特別有利的方案是使用編碼這樣的胞內抗體的DNA序列，該胞內抗體針對tat或rev蛋白並能夠中和它們的活性。有利的是，這種抗體針對tat或rev的負責其與RNA固定的區域。
針對這些表位的本發明細胞內抗體可按實施例中描述的方法製備。特別是，從單克隆抗體T—B(12)(Hybridolab)開始，經遺傳改造可得到抗tat抗體。
其功能易於被胞內抗體抑制的HIV複製中重要的另一靶蛋白，是核殼體蛋白NCP7。實際上，該蛋白在逆轉錄(早期)中，在整合中，和在晚期中，但更重要的是在衣殼化中起重要作用。這種多重功能的原因是它具有活性酶結構作用。據描述它是一種雜交酶，它使得病毒核酸複合在逆轉錄期間形成RNA/DNA和DNA/DNA，及在衣殼化時形成RNA/RNA和RNA/tRNA—lys3。NCP7顯示對感染性病毒的產生是必需的。
通過針對NCP 7的胞內抗體的細胞質粒表達進行基因治療，在病毒RNA二聚化和衣殼化中抑制NCP7的功能，這也構成了本發明的一個具體實施方案。
按照實施例中描述的方法可製備針對能中和這種蛋白的表位的本發明胞內抗體。
其它病毒元件也可以作為本發明基因治療的目標，特別是CD4分子上的固定位點(例如包膜的糖蛋白(gp120/41))，包膜的多聚化區，gp120/gp41的裂解位點，蛋白酶，整合酶，更廣義地講，包括所有病毒蛋白。當包膜呈天然形式時，這些區段一般是不可接近的。因此，它們的免疫原性很弱，利用它們進行免疫接種是不可能的。本發明使得可以定向於這些病毒元件，因此具有很好的治療前景。另外，如上所述，編碼本發明胞內抗體的基因較小，可以有利地在同一載體中同時表達多種胞內抗體，這些抗體針對一種或多種這些靶標的不同區域。
本發明的核酸序列還可以是以下PIL的編碼序列，這些PIL能夠作用於和影響代謝物合成中、蛋白合成中或DNA複製和/或轉錄中相關因子的活性。
通過以下實施例將更全面地描述本發明，這些實施例應看作說明性的而非限制性的。


圖1(A)ScFv—ras的限制性酶切圖譜。(B)ScFv—Gap的限制性酶切圖譜。(C)本發明胞內抗體的瞬時表達對癌基因ras或Her2轉化能力的中和作用。py＝對照細胞；ScFv＝僅用psv2.ScFv.ras轉染的細胞；VAL＝用表達致癌性ras的載體Ha—ras Val12轉染的細胞；VAL＋ScFv＝用psv2.ScFv.ras質粒和Ha—ras Val12共轉染的細胞；HER2＝用表達致癌性Her 2的載體轉染的細胞；HER2＋ScFv＝用PSV 2.ScFv.ras質粒和Her 2共轉染的細胞。分子生物學的一般技術用於分子生物學中的常規方法如質粒DNA的製備性提取、質粒DNA的氯化銫梯度離心、瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、電洗脫純化DNA片段、苯酚或苯酚—氯仿抽提蛋白質、在含鹽介質中用乙醇或異丙醇沉澱DNA、在大腸桿菌中的轉化等都是本領域技術人員所熟知的，並在文獻中有充分的描述[Maniatis T.等，「Molecular Cloning，a Laboratory Manual」，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Har-bor，N.Y.，1982；Ausubel F.M.等(eds)，「Current Protocols in MolecularBiololgy」，John Wiley Sons，New York，1987]。
pBR322，pUC型質粒和M13系噬菌體是從市場上購得的(Bethesda Research Laborataries)。
關於連接，先將DNA片段用瓊脂糖或丙烯醯胺電泳按其大小分離，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，用乙醇沉澱，然後按照供應商的推薦方法在噬菌體T4的DNA連接酶(Biolabs)存在下孵育。
按照供應商的說明，用大腸桿菌的DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)對凸起的5』末端補平。按照製造商的推薦方法，在噬菌體T4的DNA聚合酶(Biolabs)存在下對凸起的3』末端進行破壞。凸起的5』末端經核酸酶S1仔細處理進行破壞。
利用合成的寡聚脫氧核苷酸的體外定向突變是用Amersham提供的試劑盒按Taylor等開發的方法[Nucleic Acids Res.13(1985)8749—8764]來進行的。
用所謂的PCR技術對DNA片段的酶擴增[Polymerase—cat—a-lvzed Chain Reaction，Saiki R.K.等，Science 230(1985)1350—1354；Mullis K.B和Faloona F.A，Meth.Enzym.155(1987)355—350]可用「DNA thermal cycler」(Perkin Elmer Cetus)按製造商的說明進行。
用A mersham銷售的檢測盒根據Sanger等研製的方法驗證核苷酸序列。
實施例1抗ras胞內抗體的編碼DNA序列的克隆和表達本實施例描述編碼細胞內結合蛋白的核酸序列的克隆和表達，該胞內結合蛋白再現單克隆抗體Y13—259的特性。Y13—259抗體是針對Ras蛋白的(ref.ATCC CRL 1742)(J.Virol.43,294—304，1982)，是向細胞中注射一次即可中和致癌性Ras蛋白功能的抗體[Smith和Coll，(1986)Nature，320,540—843；Kung等.，Exp.Cell.Res.(1986)162,363—371]。
1.1.DNA序列的製備已按美國專利4,946,778中描述的技術製備了編碼胞內抗體(ScFv片段)的DNA序列。然後將該序列置於哺乳動物細胞中功能性啟動子的控制之下。
按Chirguin S.H.等[Biochemistry 18,5294(1979)]描述的技術，從分泌Y13—259抗體的雜交瘤細胞培養物中分離了RNA polyA。藉助於從隨機的六核苷酸形成的引物，這些RNA用於一種逆轉錄反應中。所得cDNA作為兩種PCR反應的基質—一種是用鼠VH的特異引物擴增Y13—259的重鏈(VH)可變區片段，—第二種是用鼠序列衍生的10個引物的混合物得到VL片段。
這樣得到340pb和325pb的兩個片段，然後用一接頭將其組裝起來，該接頭能將VH cDNA正確地置於VL cDNA的5』。該接頭編碼15個胺基酸，由三個(Gly)4Ser重複片段組成[Orlandi，R等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86,3833—3837(1979)]。此胞內抗體的序示於SEQ ID NO.1中(第28—270殘基)。該序列提供足夠的VH—VL融合體的釋放度，以使其按平行方向組裝，從而保證對抗原的適當親和力。
然後將融合核酸序列VH—接頭—VL插入一噬菌粒中，該噬菌粒能使胞內抗體(ScFv片段)在噬菌體M13的表面表達(圖1A)。這種表達使得容易鑑別和選擇正確識別抗原的細胞內抗體。
1.2經改造的胞內抗體的功能評價通過限制性酶切從噬菌粒分離編碼抗Ras改性胞內抗體的DNA序列(VH—接頭—VL)，然後插入SV2載體中，並處在SV40的早期雙增強子啟動子的控制之下(Schweighofler等，Science，256,825—827，1992)，以測試其拮抗致癌性Ras作用的能力。這樣得到的質粒稱為psv2.ScFv.ras。按以下幾個試驗進行功能評價。
a)在哺乳動物細胞中的瞬時轉染為了評價在哺乳動物細胞中的瞬時轉染，將質粒psv2.ScFv.ras按照Schweighoffer等[Science，256,825—827(1992)]描述的方法與能使Ha—ras Val 12基因表達的載體共轉染至NIH 3T3細胞中。用從啟動子控制下的報導基因「氯黴素乙醯轉移酶(CAT)」得到的酶活性，記錄了所研究的信號化途徑的活化狀態，其中啟動子含有與同時共轉染的Ras作用呈「反式」的相應核苷酸元件(RRE)這些RRE元件是由雜合啟動子雜交瘤的TK增強子構成(Wasylyk和同事，EMBO，J.7，2475，1988)。
所得結果示於圖1C中。分析所得CAT活性，說明了從Y13—259抗體製備的改性胞內抗體拮致癌性Ras活性的能力。
與允許具有酪氨酸激酶活性的癌基因—癌基因HER2(II型人表皮生長因子)—表達的質粒共轉染的質粒psv2.ScFv.ras，也在質粒「CTA」試驗中阻斷此癌基因的活性(圖1)。
b)被轉化細胞的病灶形成癌細胞具有形成轉化病灶的特性，特別是表達癌基因Ras的成纖維細胞NIH 3T3(Barlat等，Oncogene(1993)，B，215—218)。
如在以上試驗中那樣，NIH 3T3細胞在含10％胎牛血清的Dul-bcao改良的Eagle培養基(DMEM)中，於37℃含5％CO2的潮溼環境中培養。然後這些細胞按陽離子脂質轉染技術(Schweighoffer等，Science，256，825—827，1992)，用致癌性RasHa—ras Val12、psv2.ScFv.ras質粒(參見以上a)項)和過量10倍的新黴素抗性基因共轉染。每個平皿轉染相同量的總DNA。
轉染24小時後，來自每個100mm佩特裡平皿的轉染細胞以1比10的比例分入存在0.4mg/ml(培養基)G418(GIBCO/BRL)的相同培養基中，並培養。培養14天後，計算每μg轉染DNA所得轉化病灶的數目。
所得結果示於下表中。它們代表四次獨立實驗的平均值。
表在抗ras胞內抗體存在下Ha—ras Val 12對NIH 3T3細胞的轉化

所得結果清楚表明抗ras胞內抗體大大抑制癌基因ras的轉化能力。
另外，從a)中所得結果來看，Y13—159抗體的ScFv片段表達也必然阻止其它有助於細胞Ras蛋白活化的癌基因如HER1、HER2的轉化。
應認識到，本領域技術人員在本申請中所描述結果的基礎上，可用編碼針對其它細胞元件的胞內抗體(如ScFv片段)之核酸序列重複本發明。這些胞內抗體可從已知對抗這些細胞元件的抗體製得，或通過鑑定要中和的抗原、藉助該抗原或其優選表位進行免疫，然後從所得抗體、從其mRNA或從其雜交瘤製備胞內抗體。在細胞轉化過程中涉及的其它元件也可以作為靶標。例如，按照同樣方法從雜交瘤M38、M8、M70、M90和M30(ATCC HB 9158)製備編碼抗ras的胞內結合抗體的其它DNA序列，其中所述雜交瘤的抗體分別針對Ha—Ras蛋白的1—23、24—69、90—106、107—130和131—152位殘基。而且，如上所述，可有利地製備同時帶有編碼不同胞內抗體的多種序列的載體，以提供優異的中和活性。實施例2編碼抗GAP胞內抗體的DNA序列的克隆和表達本實施例描述編碼下述胞內結合蛋白的核酸序列的克隆和表達，該胞內結合蛋白再現抗GAP蛋白之單克隆抗體的特性。
GAP蛋白(GTP酶活化蛋白)與ras依賴性信號化途徑相關。它與ras蛋白以催化方式相作用，並且體外測得正常P21蛋白的GTP水解速度提高100—200倍。不同的工作已表明，約1044個胺基酸的此蛋白中催化區處於羧基末端區(702—1044殘基)，還表明該區負責GAP蛋白與ras蛋白的相互作用(參見WO91/02749)。
現已證明針對GAP蛋白所謂「SH3」區的單克隆抗體中和非洲蟾蜍(Xenope)卵中致癌Ras蛋白的功能(Duchesne等，Science，259，525—528，1993)。
按1.1中描述的方法，可合成一種編碼相當於此抗體之胞內抗體(ScFv片段)的DNA序列(SEQ ID NO.2，11—250殘基，圖IB)。插入載體中的這種序列可以抑制腫瘤細胞中癌基因ras的轉化能力。
另外，申請人還更精確地鑑定了該抗體識別的表位。然後人工合成了這些表位，並可用於產生能用於實施本發明的新中和性抗體。
a)更精確地鑑定通過「表位掃描」技術進行了鑑定。該技術是基於給定抗體可與5—15個胺基酸的肽相作用這一原理的。據此，通過製備一整套5—15個胺基酸的覆蓋肽(相當於所研究抗原的全部序列)，可獲得順序表位的鑑定。該技術已用於確定GAP「SH3」區的功能性表位。為此，通過合成所有2種胺基酸的十肽進行順序覆蓋，研究了該區域的全部。
—覆蓋肽的合成化學合成了覆蓋圖1片段之全部的35種肽。用固相Fmoc/叔丁基方法在獨立的兩種載體上進行雙份合成(Cambridge Research Bio-chemicals的試劑盒)。
—顯示功能性表位用與過氧化物酶偶聯的兔抗鼠抗體進行ELISA實驗，揭示了Ac200抗體識別的功能性表位。使用的產色酶底物是連氮—雙—(3—乙基苯並噻唑啉磺酸)(ABTS)。
所得結果表明該抗體識別的表位如下—PVEDRRRVRAI—EISF—EDGWM可按本領域技術人員的常規技術使用這些表位，以產生中和ras作用的抗體。然後這些抗體或產生它們的雜交瘤，按以上描述的方法用於產生本發明的核酸序列和載體。實施例3從用Ki—Ras的高變區肽(2A和2B)免疫的小鼠脾提取mRNA，製備編碼抗Ki—ras胞內抗體的核酸序列本實施例描述通過鑑定要中和的抗原、用此抗原或其優選表位免疫、然後從所得抗體、其mRNA或雜交瘤製備核酸序列的方法，製備編碼本發明胞內抗體(如ScFv片段)的核酸序列。
該實施例說明可將本發明應用於所有抗原或所希望的表位，既使在針對所述抗原或表位的單克隆抗體不可得的情況下也可應用本發明。
本實例中的靶抗原是Ki—ras蛋白。更準確地講，用於免疫的抗原是相當於Ki—ras蛋白末端25和24個胺基酸的肽，即如下2A和2B
—2A肽QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM—2B肽KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM按免疫學常規技術用這些肽免疫小鼠後，取出脾臟，從mRNA製備cDNA。然後克隆編碼可變區的cDNA，這樣就構建了表達ScFv的噬菌體文庫，這些ScFv相當於所用小鼠匯總的全部。然後利用與柱和微滴定板的親和性，通過連續選擇步驟鑑定並分離識別2A和2B肽的胞內抗體(ScFv片段)。
然後按照實施例1中描述的方法對這些ScFv進行功能測試。
本實施例中提出的這種策略能有利地選擇癌基因Ki—Ras的特異性胞內抗體，而不會影響其它Ras原癌基因。因此這種工具的選擇性不僅是細胞水平的(因為在Ras轉化細胞中轉導途徑的去偶(de-couplage))而且是分子水平的。實施例4製備編碼抗—突變p53的胞內抗體的核酸序列本實例描述針對p53突變蛋白的胞內抗體(如ScFv片段)的編碼核酸序列的製備。這些胞內抗體是從針對所述p53突變蛋白的不同單克隆抗體獲得的。
在大量腫瘤細胞中p53蛋白的編碼基因發生了變化(Caron deFronmentel和Soussi，Genes，4，1—15，1992)。通過單克隆抗體可以檢測到這種構象變化(Milner和Cook，Virology，154，21—30，1986；Milner，Nature，310，143—145，1984)。
pAB240抗體識別p53蛋白的突變形式。
突變p53的特異抗體或與這種突變P53蛋白特異性相互作用的蛋白的ScFv片段在細胞內表達，能在帶有突變p53的腫瘤中產生有益的效果。
實施例5抗乳頭瘤病毒的胞內抗體的編碼DNA序列的克隆和表達本實例描述編碼抗人乳頭瘤病毒(HPV)蛋白的胞內抗體(ScFv片段)之DNA序列的克隆和表達。
靶病毒蛋白為E6蛋白。該蛋白是由HPV16和18病毒產生的，這兩種病毒與90％的婦女宮頸癌有關，並在癌前上皮損傷中得以鑑定(Riou等，Lancet 335(1990)117)。E6基因產物大大減小HPV陽性細胞中野生p53的量(一種抗癌基因)導致腫瘤形成(Wrede等，Mol.Carcinog.4(1991)171)。在其它腫瘤中，以不同的機制抑制p53突變(參見實例4)或與諸如MDM2的蛋白結合。
文獻中已描述了E6蛋白的序列(Hawley—Nelson等，EMBO J.8(1989)3905；Munger等，J.Virol.63(1989)4417)。可用「表位掃描」(參見實施例2)鑑定該蛋白特定區域，然後用於按實施例3中描述的方法免疫小鼠。然後按前述方法製備抗人乳頭瘤病毒(HPV)E6蛋白的胞內抗體(ScFv片段)的編碼DNA序列。體內表達後通過下列方式顯示該序列的實用性—提高表達E6的細胞中野生p53的比率，—HPV轉化的細胞形態回復，—阻斷E6對p53的反式激活作用，和—抑制E6對角化細胞和人成纖維細胞的轉化。實施例6從用tat、rev和NCP7蛋白活性區的肽免疫的小鼠脾提取mRNA，製備抗HIV胞內抗體的編碼核酸序列。
本實施例描述通過鑑定要中和的抗原、用此抗原或其優選表位免疫、然後從所得抗體、其mRNA或雜交瘤製備核酸序列的方法，製備編碼本發明胞內抗體(如ScFv片段)的核酸序列。
本實施例說明可將本發明應用於所有抗原或所希望的表位，既使在針對所述抗原或表位的單克隆抗體不可得的情況下也可應用本發明。
本實例中的靶抗原是HIV病毒的tat、rev和NCP7蛋白。更準確地講，用於免疫的抗原是下列6，9和16個胺基酸的肽，相當於這些蛋白負責與mRNA相互作用的區域(tat和rev)或負責RNA二聚化的區域(NCP7)—tat肽RKKRRQRRR—rev肽RQARRNRRRRWRERQR—NCP7肽RAPRKK按免疫學常規技術用這些肽免疫小鼠後，取出脾臟，從mRNA製備cDNA。然後克隆編碼可變區的cDNA，這樣就構建了表達ScFv的噬菌體文庫，這些ScFv相當於小鼠匯總的全部。然後利用與柱和微滴定板的親和性，通過連續選擇步驟鑑定並分離識別tat、rev和NCP7肽的胞內抗體(ScFv片段)。
然後測試這些ScFv阻斷HIV病毒的感染周期的能力。
SEQ ID NO1TCA AGG AGA CAG TCT ATA AGA AAT ACC TAT TCG ACG GCA GCC GCT GGA 48Ser Arg Arg Gln Ser Ile Arg Asn Thr Tyr Ser Thr Ala Ala Ala Gly1 5 10 15TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCT CAG GTG AAA CTG CAG 96Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Gln20 25 30CAG TCA GGA GCA GGC TTA GTG CAG CCT GGA AGG TCC CTG AAA CTC TCC 144Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser35 40 45TGT GTA GTC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAT GGA ATG AAC TGG ATT 192Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ash Tyr Gly Met Asn Trp Ile50 55 60CGC CAG ACT CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG GTT GCA TAC ATT AGT AGT 240Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser65 70 75 80GGT AGC AGT TAC CTC TAC TAT GCA GAA ACG GTG AAG GGC CGA TTC ACC 288Gly Ser Ser Tyr Leu Tyr Tyr Ala Glu Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr85 90 95ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG ACC AGT 336Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser100 105 110CTG AGG TCT GAA GAC ACT GCC TTG TAT TAC TGT GCA AGA CAT GAG GGT 384Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly115 120 125ACG GGT ACC GAC TTC TTT GAT TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC 432Thr Gly Thr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr130 135 140GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC 480Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly145 150 155 160GGA TCG GAC GTT GAG CTC ACC CAG TCT CCA CAT TCC CTG TCT GCA TCT 528Gly Ser Asp Val Glu Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser165 170 175CTG GGA GAA ACT GTC TCC ATC GAA TGT CTA GCA AGT GAG GGC ATT TCC 576Leu Gly Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser180 185 190AAT TAT TTA GCG TGG TAT CAG CAG AAG CCA GGG AAA TCT CCT CAG CTC 624Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu195 200 205CTG ATC TAT TAT GCA AGT AGC TTG CAG GAT GGG GTC CCA TCA CGG TTC 672Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe210 215 220AGT GGC AGT GGA TCT GGC ACA CAG TTT TCT CTC AAG ATC AGC AAC ATG 720Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met225 230 235240CAA CCT GAA GAT GAA GGG GTT TAT TAC TGT CAA CAG GCT TAC AAG TAT 768Gln Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Lys Tyr245 250 255CCT TCC ACG TTT GGA GCT GGC ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG GCG GCC 816Pro Ser Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala260 265 270GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT TAA TAA GAA TTC 864Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn * * Glu Phe275 280 285ACT GGCThr Gly 870290SEQ ID NO2TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTC CAA CTG CAG GAG 48Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu1 5 10 15TCA GGA CCT GGC CTA GGG CAG CCC GCA CAG AGC ATT TCC ATA ACC TGC 96Ser Gly Pro Gly Leu Gly Gln Pro Ala Gln Ser Ile Ser Ile Thr Cys20 25 30ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA AGT AGC TAT GGT GTA CAC TGG GTT CGC 144Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg35 40 45CAG TCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG AGA GGT 192Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Arg Gly50 55 60GGA GGC ACA GAC TAC AAT GCA GCC TTC ATG TCC AGA CTG AGC ATC ACC 240Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr65 70 75 80AAG GAC AAC TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT AAA TTG AAC AGT CTG CAA 288Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln85 90 95CCT GAT GAC ACT GCC ATG TAC TAC TGT GCC AAA AGG GGT GGC CCG GGG 336Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Gly Gly Pro Gly100 105 110TAT TTC GAT GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT 384Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly115 120 125GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT AGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT 432Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile130 135 140GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GCA TCT GTG GGA GAA ACT 480Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr145 150 155 160GTC ACC ATG ACA TGT CGA GCA AGT GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA GCA 528Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala165 170 175TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAG TCT CCT CAG CTC CTG GTC TAT GCT 576Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala180 185 190GCA ACA AAA CCA GGA AAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA 624Ala Thr Lys Pro Gly Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly195 200 205TCA GGC ACA CAA TTT TCT CTG AAG ATC AAC AGC CTG CAG CCT GAA GAT 672Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp210 215 220CTT GGG AAC TAT TAC TGT CTA CAT TTT TAT GGG ACT CCG TAT AGG TTC 720Leu Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu His Phe Tyr Gly Thr Pro Tyr Arg Phe225 230 235 240GGC GGG GGC ACC AAG CTG GAA ACG AAA CGG GCG GCC GCA GAA CAA AAA 768Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys245 250 255CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT TAA TAA GAA TTC ACT GGC 810Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn * * Glu Phe Thr Gly260 265 270
權利要求
1.含有一種細胞內結合蛋白(PIL)之編碼基因的核酸序列，所述編碼基因受一種在哺乳動物細胞中有功能的啟動子控制。
2.根據權利要求1的核酸序列，其特徵在於它編碼作用於細胞增殖、代謝物合成、蛋白合成、DNA複製和/或轉錄、或病毒感染周期的細胞內結合蛋白。
3.根據權利要求1或2的核酸序列，其特徵在於細胞內結合蛋白是細胞內抗體或片段和/或這種抗體的衍生物。
4.根據權利要求3的核酸序列，其特徵在於細胞內結合蛋白是抗體的Fab或F(ab)』2片段。
5.根據權利要求3的核酸序列，其特徵在於細胞內結合蛋白是一種肽，它至少含有通過一肽接頭連接的相當於抗體輕鏈可變區結合位點的肽和相當於抗體重鏈可變區結合位點的肽。
6.根據權利要求1—6之一的核酸序列，其特徵在於在哺乳動物細胞中有功能的啟動子選自病毒啟動子、細胞啟動子或人工啟動子。
7.根據權利要求1—6之一的核酸序列，其特徵在於它結合在載體中。
8.根據權利要求7的核酸序列，其特徵在於它結合在病毒載體中。
9.在其基因組中含有權利要求1—8之一的核酸序列的缺陷重組病毒。
10.根據權利要求9的缺陷重組病毒，其特徵在於它選自逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、痘苗病毒和HSV病毒。
11.缺陷重組病毒，其特徵在於在其基因組中含有一種核酸序列，該核酸序列至少含有編碼細胞內抗體或片段和/或這種抗體的衍生物的基因。
12.根據權利要求11的缺陷重組病毒，其特徵在於細胞內抗體是一種肽，它至少含有通過一種肽接頭連接的相當於抗體輕鏈可變區結合位點的肽和相當於抗體重鏈可變區結合位點的肽。
13.根據權利要求11或12的缺陷重組病毒，其特徵在於細胞內抗體是一種針對細胞增殖中相關靶細胞的元件的抗體。
14.根據權利要求13的缺陷重組病毒，其特徵在於細胞內抗體是針對癌基因或針對癌基因信號化途徑之因子的抗體。
15.根據權利要求14的缺陷重組病毒，其特徵在於癌基因選自myc、myb、ras、fos、jun和erb癌基因。
16.根據權利要求11—15的缺陷重組病毒，其特徵在於它選自逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、痘苗病毒和HSV病毒。
17.含有至少兩種根據權利要求1的核酸序列的載體，特別是病毒載體，其中核酸序列編碼抗一利或多種抗原的不同表位的細胞內結合蛋白。
18.含有至少一種根據權利要求1—8之一的核酸序列或根據權利要求9—17之一的重組病毒的藥物組合物。
19.根據權利要求18的藥物組合物，其特徵在於它含有脂質體形式、與核蛋白、脂類或葡聚糖的複合物形式、或天然形式的權利要求1—8之一的至少一種核酸序列。
20.根據權利要求19的藥物組合物，其特徵在於它含有至少一種根據權利要求5的核酸序列。
21.根據權利要求18的藥物組合物，其特徵在於它含有至少一種根據權利要求12的重組病毒。
22.根據權利要求21的藥物組合物，其特徵在於重組病毒選自腺病毒、逆轉錄病毒、或腺相關病毒。
23.權利要求1的核酸序列在製備用於治療癌症的藥物組合物中的用途。
24.權利要求1的核酸序列在製備用於治療病毒感染的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及核酸序列，含有它們的載體，及其治療用途，特別是基因治療用途。更具體講，本發明涉及含有細胞內結合蛋白(PIL)編碼基因的核酸序列，和它們的基因治療應用，它們結合或不結合在適當的表達載體中。
文檔編號A61K38/00GK1126491SQ9419244
公開日1996年7月10日 申請日期1994年6月15日 優先權日1993年6月16日
發明者F·施維格霍夫爾, B·託科奎 申請人:羅納-布朗克·羅萊爾股份有限公司