番紅花的組織培養快速繁殖方法

2023-08-10 02:37:46

專利名稱：：番紅花的組織培養快速繁殖方法
技術領域：
：本發明涉及植物的組織培養及繁殖方法，具體涉及番紅花的組織培養快速繁殖方法。
背景技術：
：番紅花(CrocussativusL.)又名藏紅花、西紅花，系鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬多年生草本植物。原產南歐各國及伊朗等地，後經印度轉入西藏再傳入中國，引種栽培成功，故又名藏紅花或西紅花。由於番紅花只是柱頭入藥，產量極低，採收耗時費力；同時種源少，適宜栽培地區有限、條件苛刻等因素致使其價格昂貴，在被列為珍稀名貴中藥材，並被譽為"植物黃金"。番紅花的雌蕊柱頭是名貴中藥，具有活血化瘀、涼血解毒、解鬱安神之功效，是傳統的婦科、傷科良藥。臨床上還主要用於胃病、調經、麻疹、發熱、肝脾腫大等的治療。尤其是近年來在治療心腦血管疾病方面取得了較好的療效。由於番紅花不能進行有性生殖，只能通過球莖進行無性繁殖，且栽培條件下其球莖退化現象嚴重，導致種質資源嚴重缺乏。中國自引種以來，栽培番紅花產量一直較低，遠遠不能滿足人們的需要。近年來組織培養技術在藥用植物上得到了廣泛的應用，這為繁殖能力較差的名貴中藥藥用資源的保存和生產提供了新的途徑。利用生物技術、組織培養的方法進行種苗生產，在很多植物上已成為工廠化的商品生產，並帶來了豐厚的經濟效益。因此，採用組織培養的方法，進行番紅花愈傷組織誘導、叢生芽的誘導以及球莖的再生，是探索快速、大量、持續地獲得有效新生球莖的途徑。利用組織培養的方法建立優系番紅花的繁殖體系，進行種苗的工廠化育苗生產，具有快速大量繁殖優系品種的優勢，可以解決番紅花的種質資源質量問題。為了探索擴大種源的途徑，採用組織培養技術進行了番紅花愈傷組織及小球莖誘導進行研究，以期為其種質資源的保存與利用奠定一定的基礎。
發明內容本發明所要解決的技術問題在於，研究建立番紅花無菌快繁體系，並提高增殖率，適宜大規模生產優質種苗。本發明提供一種番紅花組織培養快速繁殖方法。本發明利用組織培養的方法，進行了番紅花愈傷組織及小球莖誘導，建立優系番紅花的繁殖體系，進行種苗的工廠化育苗生產，快速大量繁殖優系品種。本發明所述方法包括下列步驟(1)外植體滅菌將球莖用水洗淨，除去皮膜，置於超淨工作檯上消毒接種；先於70%酒精中漂洗30-40秒，再用0.1%HgCl2消毒8-10分鐘，最後用無菌水衝洗45次，徹底洗去殘餘的HgCl^將消毒後的球莖切成1-1.5cm接種於培養基上；(2)愈傷組織誘導將經過消毒滅菌後的上述球莖在無菌環境中接種於誘導培養基MS+0.5mg/LNAA+5.0mg/L6-BA培養基上中，培養20天收穫愈傷組織；(3)叢生芽誘導培養將愈傷組織接種到MS+0.5mg/LNAA+2.Omg/L6-BA培養基上，20天後在黑暗條件(24h無光照)下，2(TC培養，可誘導出大量叢生芽；(4)不定芽繼代培養將叢生芽切割成單個芽後轉接到MS+0.5mg/LNAA+2.Omg/L6-BA培養基上，在黑暗條件下，20士2t:培養，15天後芽長到2-3cm;(5)球莖誘導培養當芽高2-3cm時轉接到MS+0.5mg/LNAA+3.Omg/L6-BA培養基，在光照條件(光照時間12h/d，光照強度150020001x)下誘導出球莖。本發明方法所述培養基MS、NAA和6-BA均可從市售得到。本發明方法基於下列試驗研究，其結果如下(一)方法(1)外植體滅菌將球莖用水洗淨，除去皮膜，置於超淨工作檯上消毒接種；先於70%酒精中漂洗30-40秒，再用0.1%HgCl2消毒8-10分鐘，最後用無菌水衝洗45次，徹底洗去殘餘的HgCl^將消毒後的球莖切成1-1.5cm接種於培養基上；(2)愈傷組織誘導將經過消毒滅菌後的上述球莖在無菌環境中接種於誘導培養基MS+0.5mg/LNAA+5.Omg/L6-BA培養基上中，在黑暗條件(24h無光照)下培養；考察了MS、B5、White三種不同培養基對番紅花愈傷組織誘導率的影響，不同植物生長調節劑和光照條件對番紅花愈傷組織誘導和生長的影響。(3)叢生芽誘導培養將愈傷組織接種到不同濃度激素配比的MS培養基上，用於誘導叢生芽；考察光照和溫度條件對誘導叢生芽的影響。(4)不定芽繼代培養將叢生芽切割後轉接到不同濃度激素配比的MS培養基中，進行芽增殖實驗。考察光照和溫度條件對不定芽增殖的影響。(5)球莖誘導培養當芽高2-3cm時進行球莖誘導實驗。將叢生苗轉接到不同濃度激素配比的MS培養基中，分別在光照和黑暗條件下誘導球莖。(二)結果1.外植體滅菌滅菌時間短，外植體邊緣褐化程度輕，但汙染率較高；滅菌時間太長，汙染率較低，但外植體會被灼燒，大多數不能形成愈傷組織。經步驟1方法滅菌的番紅花球莖消毒效果好，能形成愈傷組織。2.愈傷組織誘導MS為適宜的誘導愈傷組織培養基(見表1)，不同濃度激素配比中，以MS+0.5mg/LNAA(萘乙酸)+5.Omg/L6_BA(6-苄氨基腺嘌呤)為宜(見表2)。黑暗條件下(24h無光照)有利於愈傷組織的生長(見表3)。表1不同培養基對愈傷組織誘導的影響tableseeoriginaldocumentpage4表2不同激素配比對愈傷組織生長的影響tableseeoriginaldocumentpage5表3光照條件對愈傷組織誘導的影響tableseeoriginaldocumentpage53.叢生芽誘導培養經過30天的培養，部分培養基中愈傷組織分化成芽。其中，以MS+O.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA培養基長芽的時間較短，且生長速度較快。愈傷組織分化出小芽，幼芽數逐漸增多形成芽叢。進行了光照條件對叢生芽的誘導，結果表明黑暗條件下可誘導出大量叢生芽，而光照條件不利於愈傷組織分化成芽。溫度過高不利於誘導叢生芽，適宜溫度為20±2°C。4.不定芽繼代培養在2.0mg/L6-BA(6_節氨基腺嘌呤)的MS培養基上，改變NAA的濃度，對幼芽的繼代增殖影響較大。不加NAA(萘乙酸)時，形成的叢芽數較少，但所形成的幼芽節間較長，且容易再次繼代。NAA濃度大於1.Omg/L時，形成的叢芽數較多，且芽較瘦弱不利於再次繼代，NAA濃度越大，所形成的幼芽越短，苗高也逐漸降低，基部形成的愈傷組織塊逐漸增大。其中仍以MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6_BA培養基芽增殖效果為好。進行了光照條件對叢生芽的增殖，結果表明黑暗條件叢生芽能夠增殖，而光照條件不利於叢生芽增殖。溫度過高不利於叢生芽增殖，適宜溫度為20士2t:。5.球莖誘導培養將叢生苗轉接到不同濃度激素配比的MS培養基中，MS+O.5mg/LNAA+3.0mg/L6-BA培養基誘導出球莖所需時間短，且球莖生長快。黑暗條件下不能誘導出球莖，40天後光照條件下不定芽的小球莖誘導率可達65.2%。影響番紅花快繁的因素激素濃度組織培養成敗的關鍵在於培養的條件，其中生長素和細胞分裂素的濃度是其中極為重要的因素。光照條件在番紅花愈傷組織誘導、叢生芽誘導和芽增殖培養都應在黑暗條件下進行，誘導球莖應在光照條件下進行。溫度影響番紅花每年11月到次年4月生長，5月到10月休眠。在組培中，溫度過高，苗的長勢差，並伴有褐化發生。2(TC左右時，苗生長旺盛。3(TC以上時，苗會褐化死亡，這與番紅花田間生長習性相一致，栽培番紅花亦表現為5月進入枯萎休眠狀態。具體實施例方式下面根據實施例對本發明進一步詳細說明實施例1(1)以當年生番紅花的球莖為外植體，將球莖於自來水中衝洗乾淨，除去皮膜，置於超淨工作檯上消毒接種。先於70%酒精中漂洗30s，再用0.1%HgCl2消毒8-10min，最後用無菌水衝洗5次，徹底洗去殘餘的HgCl2。(2)將消毒後的球莖切成lcm3大小，接種於MS+0.5mg/LNAA+5.0mg/L6-BA培養基上，在黑暗條件(24小時無光照)下培養20天可收穫愈傷組織。愈傷組織可在此條件下長期繼代，不褐化。(3)將愈傷組織轉接到MS+0.5mg/LNAA+2.Omg/L6-BA培養基上，20天後在黑暗條件下，20°C培養，可誘導出大量叢生芽。(4)將叢生芽切剖成單個芽後轉接到MS+0.5mg/LNAA+2.Omg/L6-BA培養基上，在黑暗條件(24小時無光照)下，2(TC培養，15天後芽長到2cm。(5)轉接到MS+0.5mg/LNAA+3.Omg/L6-BA培養基，在光照條件(光照時間12小時/天，光照強度15001x)下誘導出球莖。權利要求一種番紅花組織培養快速繁殖方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)外植體滅菌將球莖用水洗淨，除去皮膜，置於超淨工作檯上消毒接種；先於70％酒精中漂洗30-40秒，再用0.1％HgCl2消毒8-10分鐘，最後用無菌水衝洗4～5次，徹底洗去殘餘的HgCl2，將消毒後的球莖切成1-1.5cm3，接種於培養基上；(2)愈傷組織誘導將經過消毒滅菌後的上述球莖在無菌環境中接種於誘導培養基MS+0.5mg/LNAA+5.0mg/L6-BA培養基上中，培養20天收穫愈傷組織；(3)叢生芽誘導培養將愈傷組織接種到MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA培養基上，20天在黑暗條件下，20℃培養20天，誘導出叢生芽；(4)不定芽繼代培養將叢生芽切割成單個芽後轉接到MS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA培養基上，在黑暗條件24小時無光照下，20±2℃培養，15天後芽長到2-3cm；(5)球莖誘導培養當芽高2-3cm時轉接到MS+0.5mg/LNAA+3.0mg/L6-BA培養基，在光照條件下誘導出球莖。2.根據權利要求1所述的一種番紅花組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述步驟(2)、(3)和(4)的黑暗條件為24小時無光照。3.根據權利要求1所述的一種番紅花組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述步驟(5)的光照條件為光照時間12h/d，光照強度150020001x。全文摘要本發明公開了一種番紅花組織培養快速繁殖方法，該方法包括外植體滅菌、愈傷組織誘導、叢生芽誘導培養、不定芽繼代培養和球莖誘導培養等步驟，最後誘導出球莖。本發明利用組織培養的方法，進行番紅花愈傷組織及小球莖誘導，建立優系番紅花的繁殖體系，進行種苗的工廠化育苗生產，能快速大量繁殖優系品種。文檔編號C12N5/04GK101720667SQ20081020102公開日2010年6月9日申請日期2008年10月10日優先權日2008年10月10日發明者宋嬿,楊弘,汪洋,秦路平申請人:上海華宇藥業有限公司