一種含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物、製備方法及應用的製作方法

2023-08-10 02:37:36 2

專利名稱：一種含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物、製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物製備方法，本發明還包括本發明的提取物在鎮痛方面的應用。
背景技術：
吳茱萸鹼(evodiamine, EV0)和吳茱萸次鹼(rutaecarpine, RUT)是中藥吳茱萸的主要活性成分，其具有降壓、舒血管、抗過敏、抗炎、鎮痛等作用。EVO和RUT的VR1激動作用，可促進神經遞質(CGRP、P物質等)的合成和釋放，試驗證實高劑量的EVO能使小鼠離體迴腸神經元脫敏發揮鎮痛作用，推測EVO的鎮痛機制可能與辣椒素類似，通過與外周感覺神經傳入纖維上的VR1結合，激活與之偶聯的膜離子通道，使Ca2+通道開放，胞質中Ca2+濃度升高，興奮感覺神經，促進神經元及其纖維釋放神經遞質，進而使其從外周和中樞神經細胞中逐漸耗竭排空，阻斷疼痛的傳導，從而發揮鎮痛作用。除了上述的鎮痛機制，EVO與RUT還能下調環氧合酶_2 (C0X-2)的表達或者抑制C0X-2的活性，抑制炎性介質的釋放，緩解炎性疼痛。因此，EVO與RUT可能是ー類針對多靶點的鎮痛藥物。中國專利CN 1931271A專利提供了一種吳茱萸提取物及其製備方法、藥物組合物和用途，但其製備方法不包含且不能推斷出本發明提取物的製備方法。

發明內容
本發明提供ー種含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物製備方法。本發明還發現本發明的含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物具有鎮痛作用，為此，本發明提供ー種含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼提取物的醫藥新用途。本發明的含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物中吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼比例在
1-10 :1-5範圍內。上述比例優選提取物中吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的比例為I. 3 1-1.8 I。本發明的含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物純度在50%以上。本發明提取物從天然藥物例如芸香科植物吳茱萸、疏毛吳茱萸和石虎等或其炮製品中提取獲得。EVO和RUT是ー類極度難溶的化合物，幾乎不溶於水和多數有機溶剤，ロ服吸收困難，我們的研究表明灌胃給予SD大鼠500mg kg—1的EVO単體，血藥濃度峰值(Cmax)為49. 0± 19. Ong !!!じ1，生物利用度僅為0.1% o灌胃給予SD大鼠40mgぜ的RUT単體，血藥濃度值低於最低檢測限(2ng じ1)。而在Wistar品系的大鼠(自發性高血壓大鼠)連續18天灌胃給予40mg *kg_1的RUT單體,最後一次給藥後30min的血藥濃度僅為2. 4±3ng じ1。因而，尋找更有效的EVO和RUT給藥形式具有重要意義。本研究室發現特定比例的提取物較化學合成単體能明顯改善EVO和RUT的吸收，増加二者的生物利用度，且呈現純度依賴性。本發明的提取物優選製備方法如下
A、藥材提取將吳茱萸屬原料(藥材或炮製品)用こ醇溶液(含體積百分含量(下同)60% -90%的こ醇)、こ醇、甲醇等有機溶劑提取，得到提取液。B、分段水 沉將上述提取液或濃縮後的提取液加入水後使醇的濃度下降並不低於33%，後離心取沉澱；C、精製將B所得的沉澱用醇重結晶，離心收集沉澱乾燥後，即得不同純度的吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的組合物。本發明的提取物可用於鎮痛，治療的疼痛包括糖尿病性神經疼痛、腰背痛、慢性肌肉骨骼痛、骨關節炎或類風溼性關節炎等，但不限於此。本發明提取物的製備方法エ藝簡單可控，成本低；可通過控制エ藝因素製備不同純度提取物；生產過程無汙染，具有良好的生產和開發價值。


圖I是不同劑量吳茱萸提取物乳膏對不同時相小鼠舔後足累計時間的影響(均數土標準差，n = 8)，*P < 0. 05 ;#P < 0. Olv. s 空白基質組；圖2是大鼠ロ服三種純度吳茱萸提取物後EVO的藥時曲線(均數土標準差，n =6)；圖3是大鼠ロ服三種純度吳茱萸提取物後RUT的藥時曲線(均數土標準差，n =6)；圖4是大鼠ロ服六種比例混合物後EVO的藥時曲線(均數土標準差，n = 6)；圖5是大鼠ロ服六種比例混合物後RUT的藥時曲線(均數土標準差，n = 6)；
具體實施例方式以下通過實施例進ー步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例I吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼提取物的製備A、提取(A)將吳茱萸屬原料(芸香科植物吳茱萸的乾燥近成熟果實)按原料與60%こ醇溶液的體積分數比為I : 10-12向原料中加入60%こ醇溶液，然後將兩者的混合物熱至70-100°C，保溫3小時後，濾渣取液。(B)按所述吳茱萸屬原料與60%こ醇溶液的體積分數比為I : 8-10向A步(A)濾出的渣中加入60%こ醇溶液，並將兩者混合物加熱至70-100°C，保溫3小時後，濾渣取液。(C)按所述吳茱萸屬原料與60%こ醇溶液的體積分數比為I : 8-10向A步⑶濾出的渣中加入60%こ醇溶液，並將兩者混合物加熱至70-100°C，保溫3小時後，濾渣取液。將分別通過所述各A步(A)、(B)、(C)製取的液體混合一起後減壓濃縮，直至其中重量與所述原料重量之比為I : 1-10為止。B、分段水沉濃縮後的提取物離心收集沉澱，按沉澱與90%こ醇重量比為I : 15-20向沉澱中加90%こ醇溶解，再次提取。將提取液離心棄去沉澱，按上清液與水的體積分數比為I 0.5向上清液中加入水稀釋こ醇液，使こ醇終濃度為60%，離心棄去沉澱；按上清液與水的體積分數比為I : 0. 3向上清液中加入水稀釋こ醇液，使こ醇終濃度為45%，離心取沉澱(a);按上清液與水的體積分數比為I : 0. 3向上清液中加入水稀釋こ醇液，使こ醇終濃度為33%，離心取沉澱(b);按上清液與水的體積分數比為I : 0.3向上清液中加入水稀釋こ醇液，使こ醇終濃度為25%，離心取沉澱(c)。C、精製將B所得的沉澱(a，b，c)分別用1_10倍量的甲醇重結晶，離心收集沉澱乾燥後，即得三種純度的吳茱萸提取物，高、中、低純度分別為80%、49%和16%，EV0和RUT的比例為 I. 3 I。
實施例2不同純度提取物的大鼠體內藥代動力學比較將實施例I方法獲得的高、中、低純度吳茱萸提取物分別混懸於0. 5% CMC-Na溶液中，製成混懸液。18隻健康SD大鼠，實驗前禁食12h，不禁水，灌胃給予高、中、低純度吳茱萸提取物混懸液，劑量為40mg kg-1 (EVO)，3Img kg-1 (RUT)。分別在灌胃後0. 25,0. 5、0. 75、1、1. 5、2、2. 5、3、4h於眼眶後靜脈叢取血0. 5ml，置於肝素抗凝的塑料離心管中，血樣即刻採用液液萃取法處理，進樣分析，結果見圖2、3。高純度組中EVO的Cmax是中純度組的2. I倍，低純度組的3. 8倍，而高純度組中RUT的Cmax是中純度組的2. 3倍，低純度組的9. 4倍。統計分析後，三組EVO和RUT的Cmax差異有統計學意義(P < 0. 01)。EVO和RUT的AUCch4也隨純度的提高而升高，低純度組明顯低於高、中純度組(P < 0. 01)。提示提取物中雜質可能延緩或阻礙EVO和RUT的吸收，其阻礙作用強弱與雜質含量可能存在依賴關係。提取物的純度與其體內吸收的情況成正比，純度越高，吸收越好，進而藥效越強。實施例3不同比例EVO和RUT的大鼠體內藥代動力學比較為證實EVO和RUT比例對藥物體內吸收的影響，將EVO和RUT的化學合成品以20 I、10 1、5 I、I I、I 5的比例混合，並分別混懸於0. 5% CMC-Naこ醇溶液中，製成混懸液。30隻健康SD大鼠，實驗前禁食12h，不禁水，灌胃給予上述混懸液。分別在灌胃後0. 25,0. 5,0. 75、I、I. 5、2、2. 5、3、4h於眼眶後靜脈叢取血0. 5ml，置於肝素抗凝的塑料離心管中，血樣即刻採用液液萃取法處理，進樣分析，結果見圖4、5。採用CMC-Naこ醇溶液增加藥物的吸收以體現EVO和RUT比例對大鼠在體吸收的影響。試驗結果顯示，EV0/RUT比例在10 : I I : 5之間的吸收強於20 : I或I : 10，推測原因可能為適宜的比例有助於EVO和RUT以無定形的晶型存在，而無定型藥物常具有較高的溶解度和生物利用度。10 : I I : 5的EV0/RUT比例接近天然藥物中兩者的天然比例。本發明的提取物具有鎮痛作用，以下通過實驗數據證明本發明的醫藥用途。實驗採用常規手段，含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的組合物使用本發明實施例I方法得到。藥理學試驗觀察了本組合物治療三種不同原因引起的疼痛模型的藥理學效應。(I)吳茱萸提取物用於治療福馬林誘導的小鼠疼痛本實驗取昆明小鼠，雌雄各半，隨機分為空白基質組、扶他林乳膠陽性對照組、辣椒鹼軟膏陽性對照組、受試藥(吳茱萸提取物乳膏)低、中、高劑量乳膏組6個組，右後足均勻塗布上述藥物，給藥120min後各鼠右後足筋膜下注射2. 5%福馬林生理鹽水溶液20yL，觀察I相(0-5min)，II相(20_35min)小鼠舔後足累積時間作為評估治療疼痛指標，比較各組間差異。實驗選用扶他林乳膠和辣椒鹼軟膏兩種陽性藥，其中，扶他林乳膠(諾華製藥，I. 16%)通過抑制COX的活性發揮解熱鎮痛作用，而辣椒鹼軟膏(長春普華製藥，0. 025% )則能激動辣椒素受體使感覺神經脫敏來發揮鎮痛作用，兩種市售藥物的鎮痛機制與受試藥相同，因而選擇上述兩種市售外用製劑作為陽性對照。其中低、中、高劑量乳膏選用本發明的組合物製備方法，獲得的提取物吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼比例為I. 8 1，含量為71.0%。低、中、高劑量乳膏含藥量分別為0. 1^.0.2%和 0. 4%。實驗數據採用SPSS17. 0統計分析軟體，以獨立樣本t檢驗方法進行分析，結果見圖I。
結果顯示，與空白基質對照組比較，0. 1% -0.4%的吳茱萸提取物乳膏及0.025%辣椒鹼軟膏陽性組小鼠在給藥後5min內舔後足累計時間顯著減少，提示藥物對福馬林所致的C型纖維過度放電引起的疼痛有良好的改善作用。高劑量乳膏與扶他林乳膠還能顯著降低20-35min內舔後足累計時間，表明提取物乳膏還對炎性疼痛有效。總言之受試藥對該模型兩相疼痛均有顯著治療作用，並且其效應具有劑量依賴性。(2)吳茱萸提取物用於熱刺激疼痛模型治療取雌性昆明小鼠，隨機分成空白基質組、扶他林乳膠陽性對照組、辣椒鹼軟膏陽性對照組、受試藥低、中、高劑量乳膏組6個組，置於55±0. 5°C恆溫池中，以小鼠舔後足為疼痛反應指標，記錄產生反應的潛伏期。選取基礎痛閾在5-25s之間的小鼠(從將小鼠置於熱板上至小鼠開始舔後足的時間作為基礎痛閾)，右腳均勻塗布相同量的上述藥物，測量用藥後不同時間點小鼠痛閾，比較各組間差異。其中低、中、高劑量乳膏選用本發明的組合物製備方法，獲得的提取物吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼比例為I. 8 1，含量為71.0%。低、中、高劑量乳膏含藥量分別為0. 1^.0.2%和 0. 4%。實驗數據採用SPSS17. 0統計分析軟體，以獨立樣本t檢驗方法進行分析，結果見表I。表I不同劑量吳茱萸提取物乳膏對熱刺激痛閾值的影響(均數土標準差，n = 6)
權利要求
1.一種含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物，該提取物中吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的比例在1-10 1-5範圍內。
2.根據權利要求I所述的提取物，其特徵在於吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的比例為I.3 1—1.8 I。
3.根據權利要求I或者2所述的提取物，其特徵在於含茱萸鹼和吳茱萸次鹼的純度在50%以上。
4.製備權利要求I至3所述提取物的方法， A、藥材提取 將吳茱萸屬原料用體積百分濃度為60% -90%乙醇溶液、乙醇或甲醇溶劑提取，得到提取液； B、分段水沉 將上述提取液或濃縮後的提取液中加入水使醇的濃度降低但大於33%，離心後取沉澱； C、精製 將B所得的沉澱用醇重結晶，離心收集沉澱乾燥後，即得含吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的組合物。
5.權利要求I至3所述的組合物在製備治療鎮痛藥物中的應用。
6.根據權利要求5所說的用途，其特徵在於所說的鎮痛是包括糖尿病性神經疼痛、腰背痛、慢性肌肉骨骼痛、骨關節炎或類風溼性關節炎疼痛。
全文摘要
本發明涉及一種含有吳茱萸鹼EVO和吳茱萸次鹼RUT的提取物、製備方法，本發明還包括本發明提取物的醫藥用途。本發明提供的含有吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的提取物中吳茱萸鹼和吳茱萸次鹼的比例在1-10∶1-5範圍內。本發明發現特定比例的提取物較化學合成單體能明顯改善EVO和RUT的吸收，增加二者的生物利用度，且呈現純度依賴性。本發明的提取物可用於鎮痛。
文檔編號A61K36/756GK102755425SQ20111011116
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月29日 優先權日2011年4月29日
發明者丁勁松, 周應軍, 徐世希, 羅芳梅, 胡長平, 陳菲 申請人:長沙晶易醫藥科技有限公司