一種獲得牡丹單條染色體的方法
2023-08-10 12:14:01
一種獲得牡丹單條染色體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲得牡丹單條染色體的方法，通過顯微切割技術獲得，該方法通過選取減數分裂時期的牡丹細胞，經過樣品液製備、鏡檢、轉膜、壓片分散牡丹染色體等步驟，得到樣品；再用高端雷射顯微切割系統，通過準備收集管、上樣、尋找和選定目標染色體、調節雷射參數、目標染色體劃線、雷射切割進而成功得到牡丹花粉母細胞中完整的單條染色體，且染色體之間沒有相互汙染，為下遊研究做好鋪墊。
【專利說明】-種獲得牡丹單條染色體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於細胞生物學顯微分離【技術領域】，具體涉及一種獲得牡丹單條染色體的 方法，特別涉及一種通過雷射顯微切割分離技術獲得牡丹單條染色體的方法。
【背景技術】
[0002] 染色體顯微切割分離技術是從細胞生物學深入到分子生物學的一項橋梁技術。近 年來，該技術在構建基因高分辨遺傳圖譜和物理圖譜，快速有效的獲得染色體區帶特異性 的序列標籤位點（ST巧及表達序列標籤巧ST)，構建克隆連鎖群，W及在同源基因的定位和 克隆等方面顯示出巨大的優越性。該技術自80年代初問世W來，最大的突破點就是與PCR 技術相結合，之後通過與微克隆、FISH、DNA測序、文庫篩選等分子生物學技術相結合，在文 庫構建、染色體病研究、基因定位與克隆、W及進化遺傳學等方面的研究中取得了令人矚目 的成績，由於該技術具有獨特的直接性和實用性，因此在分子生物學領域顯示出良好的應 用自U景。
[0003] 目前已報導的染色體分離技術主要有玻璃針法、流式細胞法W及雷射顯微切割技 術。染色體顯微分離技術產生於20世紀80年代初，1981年，德國的歐洲分子生物學實驗 室巧MBL)Scalenghe 等（Scalenghe E,Tureo E, Edrom J E, etal, 1981. Microdissection and cloning of DNA from a speci円c region of Drosophila melanogaster Polytene C虹omosomes. Qiromosoma, 82:205-16.)用極細玻璃針（直徑大約為0. lum)成功分離了果 蟲電多線期X染色體第3段的幾個片段，通過蛋白酶消化、酷抽提、EcoRI酶切進行重組克隆了 果蟲電局部染色體區段，之後玻璃針手工切割技術被應用於部分動物局部染色體的分離，在 植物染色體分離方面也有應用，如向日葵，西瓜，菸草，水稻、大豆等染色體的切割分離。玻 璃針法雖然費用成本較低，但是手工操作困難，需要很強的顯微操作技能。
[0004] 流式細胞法是根據染色體發出的英光波長不同從而分離得到各條染色體，該技術 是一項自動分離技術，比手工分離的玻璃針方法更便捷，但是用該法一般不能夠得到單條 染色體，得到的是成百上千條相同或相似的染色體，所W，染色體之間存在很高的汙染可能 性。
[0005] 雷射顯微切割技術即利用全自動雷射顯微切割系統，在顯微鏡下通過雷射對非均 一性樣品進行特定分選、收集。全自動雷射顯微切割系統是DNA、RNA研究及蛋白質組學等 研究工作中的最新技術之一，可W最大程度地避免混合樣本對精細實驗結果造成的細微幹 擾或誤導，從而得到最精確的實驗結果（Leica LMD7000雷射顯微切割中文操作手冊）。該 系統能夠切割病理切片組織、細胞集落、單細胞、染色體W及活細胞等微小樣本。雷射顯微 切割技術比手工操作的玻璃針和主要針對多條染色體分離的流式細胞法更加便捷、更加精 準，且能夠分離單個細胞內的單條或數條染色體。但是，由於雷射顯微作業系統價格昂貴， 所W應用不廣泛。
[0006] 目前，彭仁海等（亞洲棉7號染色體分離及文庫構建，棉花學報，2012,24巧）； 379?385)，楊紅豔（雷射顯微分離楊樹染色體技術研究，北京林業大學，2010)，馬有志等 (小麥染色體的顯微雷射分離，遺傳學報，26 (I) :43-48,1999)，高居榮等（雷射顯微切割技 術切割棉花單條染色體的研究，實驗技術與管理，2009)通過雷射顯微切割獲得了單個細胞 內的數條染色體或單染色體，但是由於各物種染色體的製備、染色體的分離操作到收集各 不相同，現有技術中還沒有牡丹或巧藥科植物染色體顯微分離技術的正式報導。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種獲得牡丹單條染色體的方法，通過雷射顯微切割技術獲 得，該方法中的顯微切割過程由人工和電腦共同控制，採用人工劃線、雷射自動或手動控制 切割，在對染色體無損傷的情況下，即可得到牡丹單條完整染色體。
[0008] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案如下：
[0009] -種獲得牡丹單條染色體的方法，其通過顯微切割技術獲得，包括如下步驟：
[0010] 第一步，樣品製備
[0011] 1)樣品液製備；選取牡丹花蕾上的雄蕊並進行軟化，切取花葯，向花葯上滴加 20?30 y 1卡寶品紅進行染色，並夾碎樣品，去掉組織殘渣，得到樣品液；
[0012] 2)鏡檢；將樣品液在普通光學顯微鏡10?30倍下進行初步觀察，判斷是否有 10% W上的牡丹細胞處於減數分裂後期，如果有10% W上的牡丹細胞處於減數分裂後期， 則繼續下面實驗；如果處於減數分裂後期的牡丹細胞數目小於10%，則重新選取雄蕊；
[0013] 3)轉膜；將樣品液從普通載玻片轉移到覆膜載玻片上，保持覆膜完整；
[0014] 4)壓片；用蓋玻片蓋在覆膜載玻片的樣品液上，垂直敲打蓋玻片，使染色體散開； 壓片、掲掉蓋玻片、室溫瞭幹覆膜載玻片；
[0015] 第二步，顯微切割
[0016] 1)準備收集管；將PCR管固定在雷射顯微切割儀的收集管架上，向PCR管中加入 3?6 y 1 1 % TE溶液；
[0017] 2)上樣；將樣品製備步驟中的步驟5)瞭幹的覆膜載玻片倒置固定於雷射顯微切 割儀的樣品夾中；
[0018] 3)尋找目標染色體：在顯微鏡10?30倍鏡下尋找目標染色體；
[0019] 4)選定目標染色體；切換顯微鏡40?63倍鏡，調出清晰畫面；
[0020] 5)調節雷射參數：
[0021] 6)目標染色體劃線：在軟體採集屏幕中畫出要切割的目標染色體區域；
[0022] 7)雷射切割：自動或手動控制雷射切下所選取的目標染色體，並收集至PCR 管；小也取下PCR管，並蓋嚴，對PCR管進行離也，使溶有染色體的溶液沉入管底，並 於-4(TC?-8(TC保存，備用。
[0023] 進一步，所述的樣品製備過程中的步驟1)所述的牡丹花蕾顏色嫩黃，直徑為12? 16mm，細胞處於減數分裂後期。
[0024] 又，步驟1)所述的軟化及切取花葯過程為，在普通載玻片上滴一滴醋酸，將選取 的雄蕊置於醋酸中軟化，用解剖針切取1?3mm長的花葯。
[00巧]又進一步，所述的樣品製備過程中的步驟3)轉膜，還包括，用少量醋酸清洗殘留 在普通載玻片上的樣品液，將清洗液也轉移到覆膜載玻片上。
[0026] 優選地，在所述的顯微切割過程中，步驟5)調節的雷射參數為；雷射強度power範 圍，15?20 ;雷射孔徑aperture, I?3 ;雷射切割速度speed, 10?15 ;其他參數為機器設 定參數。
[0027] 優選地，為了避免染色體失活，所述的樣品製備過程的操作最好在冰上進行。
[0028] 本發明在樣品製備過程中的轉膜，利用液體的表面張力作用，將樣品液從普通載 玻片轉移到覆膜載玻片上；通過將樣品轉移到覆膜載玻片上，使切割分離下來的染色體通 過覆膜的重力作用掉入PCR管中，從而收集到染色體。
[0029] 瞭幹覆膜載玻片前，掲蓋玻片時容易損失染色體，所W要快速掲片，即從覆膜載玻 片上掲掉普通蓋玻片時要乾淨利落，減少樣品中染色體的損失和損傷；同時，在開始時也要 注意材料的選擇，即選擇較多處於減數分裂後期（減數第一次、第二次分裂後期均可）的細 胞，此時期的牡丹染色體之間自然向細胞兩極分離，再通過人工壓片促使染色體之間更加 分散，進而減少了細胞內染色體之間的重疊程度。
[0030] 在顯微切割的過程中，尋找目標染色體時，由於隔著一層玻璃，可能會造成畫面清 晰度不高，不利於區分染色體，因此本發明在壓片時要將染色體充分散開，能夠清楚的區分 所要切割的染色體邊緣；壓片時避免晃動，防止損傷染色體。
[0031] 在調節雷射參數時，要確保雷射能量能夠切下完整染色體，因此，雷射強度不能過 高，強度過高時會對染色體造成輕微損傷；雷射切割速度適中，切割太慢時會使切割時間延 長，也容易對染色體造成輕微損傷，切割太快則可能切割不完全，使沾有染色體的覆膜不能 掉下來；線寬（即雷射孔徑）要儘量細，防止切到其他染色體。
[00礎有益效果
[0033] 本發明方法在取樣過程中多選擇處於減數分裂時期後期的花粉母細胞，此時期的 牡丹染色體之間自然向細胞兩極分離，再通過人工壓片促使染色體之間更加分散，進而減 少了細胞內染色體之間的重疊程度。人工壓片減少了染色體之間因距離較近而可能造成的 汙染機率，有利於獲得不受汙染的單條染色體。
[0034] 本發明在壓片時將染色體充分散開，易於區分，在進行顯微切割的過程中，尋找目 標染色體時，隔著玻璃得到清晰度較好的畫面，利於區分染色體，獲得完整的單條染色體。 [00巧]利用本發明的方法中顯微切割過程採用人工和計算機共同控制，可W獲得完整的 牡丹單染色體，進而可獲得高純度單條染色體的DNA。
[0036] 本發明的方法也可用於切割巧藥屬其它物種的染色體，由於牡丹染色體本身較 大，所W在40?63倍鏡下即可切割。此技術試用其他染色體時，染色體較小的話，則需調 高顯微鏡倍數。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037] 圖1是本發明實施例1中處於減數第一次分裂後期的細胞。
[003引圖2是本發明實施例1中選定的目標染色體。
[0039] 圖3是本發明實施例1中劃線的目標染色體。
[0040] 圖4是本發明實施例1中對目標染色體雷射切割後的區域。
[0041] 圖5是本發明實施例2中的目標染色體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，1，2，3為 PCR產物。
【具體實施方式】
[0042] W下結合具體實施例和附圖進一步詳細描述本發明的技術方案，需要特別指出的 是，該些描述僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制，各種對本發明做出的顯而 易見的修正和改變也納入本發明的範圍內。
[0043] 實施例1通過顯微切割技術獲得鳳丹單條染色體的方法
[0044] 1.器材和試劑
[0045] 器材；綴子，冰盒，解剖針，載玻片，蓋玻片，培養皿，濾紙，吸水紙，燒杯，酒精燈， PCR管，覆膜載玻片，單面刀片，10 U 1移液槍及槍頭，普通光學顯微鏡，小型離也機，萊卡顯 微切割儀7000。
[004引試劑；卡寶品紅，45%醋酸（體積比），70%酒精（體積比），1% TE溶液（lOmmol/ L Tris-HCUpH 8.0)，Immol/L EDTA(pH 8.0))。
[0047] 2.樣品製備
[004引 1)取出保存在酒精中的顏色嫩黃、直徑在12?16mm之間的牡丹花蕾，用綴子夾出 後撕取一根雄蕊，吸水紙吸去上面的酒精。
[0049] 2)然後在普通載玻片上滴一小滴45%的醋酸，將選取的雄蕊置於醋酸中軟化1? 3s，用解剖針切取一段1?2mm長的花葯，剩下的放入酒精中保存。
[0050] 3)向普通載玻片上的花葯滴加20 Ul左右卡寶品紅，並用綴子夾碎樣品，去掉肉 眼可見的花葯組織殘渣，得到染色後的樣品液。
[0051] 4)將染色後的樣品液在普通光學顯微鏡下進行初步觀察，判斷是否有10% W上 的染色體處於減數分裂後期（參見圖1)，如果有10% W上的牡丹細胞處於減數第一次或第 二次分裂後期，則繼續下面實驗；如果處於減數第一次或第二次分裂後期的細胞數目小於 10%，則重新選取雄蕊。
[0052] 5)利用液體的表面張力作用，將樣品液從普通載玻片上轉移到覆膜載玻片上；用 綴子夾取液體，液體吸附在綴子上，在覆膜上輕輕一點，有少許液體粘在膜上之後，此時綴 子張開，樣品液即轉移到覆膜上，注意不要弄破覆膜。
[0053] 6)將蓋玻片蓋在覆膜載玻片的樣品液上，用解剖針底部垂直敲打蓋玻片，使染色 體散開。
[0054] 7)用大拇指用力壓片，注意手指不要滑動；利用單面刀片從蓋破片一側迅速將蓋 玻片掲掉；室溫瞭幹覆膜載玻片，得到樣品。
[005引 3.顯微切割
[0056] 1)打開萊卡雷射顯微切割儀，過5分鐘之後打開雷射鑰匙，準備好樣品夾及收集 裝置，收集裝置為4個PCR管。
[0057] 。將4個PCR管按A，B，C，D管槽順序做好標記，將PCR管分別固定在收集架上， 每個PCR管中打入加1 1 % TE溶液。
[0058] 3)打開軟體，點擊收集管卸載（unload)圖標，裝上收集架，點擊復位（continue) 選項，收集架退回機器。
[005引4)點擊樣品夾卸載（unload)圖標，將賠幹的覆胺載玻片倒置固定於樣品夾中，並 小也放入，點擊復位（continue)選項，樣品夾退回機器。
[0060] W在顯微鏡20倍鏡下找到目標染色體後，轉換到40倍或63倍鏡，調出清晰畫面。
[0061] 6)點擊雷射菜單（laser menu)圖標下的雷射控制（laser control)命令，調節激 光參數中雷射強度（power)範圍為15?20,孔徑（aperture)為1?3,切割速度（speed) 為10?15,其他參數為機器設定參數。
[0062] 7)選擇收集管A (或B、C、D)，選擇切割（化aw+州t)命令，在軟體採集屏幕裡畫出 要切割的區域，再切下所選取的染色體。參見圖2?圖4,圖2為選定的目標染色體，圖3為 對選定的目標染色體劃線，圖4為雷射切割目標染色體後的結果。
[0063] 如果目標區域有幹擾成分，則可選擇點擊即切割（move+cut)命令，切掉幹擾成分 之後再對目標染色體進行切割。
[0064] 8)小也取下PCR管，並蓋嚴。
[0065] 9)用小型離也機對PCR管進行離也，使溶有染色體的溶液沉入管底，並於-8(TC保 存。
[0066] 實施例2單染色體擴增實驗
[0067] 選取H個實施例1切割下來的牡丹單染色體，利用單細胞全基因組擴增試劑盒進 行擴增，之後進行瓊脂糖凝膠電泳，再用nano化OP (超微量分光光度計）測定DNA濃度。
[0068] 參見圖5,為目標染色體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，左起第二孔為DL2000DNA marker,第3,4,5孔分別為選取的H條單染色體擴增出來的彌散帶，擴增出來的片段長度 為300?2000bp，W 1 % TE溶液做空白對照（CK組），測得DNA濃度如表1所示：
[0069] 表 1 DNA 濃度
[0070]
【權利要求】
1. 一種獲得牡丹單條染色體的方法，其特徵在於，通過雷射顯微切割技術獲得牡丹單 條染色體，包括如下步驟： 第一步，樣品製備 1) 樣品液製備：選取牡丹花蕾上的雄蕊並進行軟化，切取花葯，向花葯上滴加20? 30 yl卡寶品紅進行染色，並夾碎樣品，去掉組織殘渣，得到樣品液； 2) 鏡檢：將樣品液在普通光學顯微鏡10?30倍下進行初步觀察，判斷是否有10%以 上的牡丹細胞處於減數分裂後期，如果有10%以上的牡丹細胞處於減數分裂後期，則繼續 下面實驗；如果處於減數分裂後期的牡丹細胞數目小於10%，則重新選取雄蕊； 3) 轉膜：將樣品液從普通載玻片轉移到覆膜載玻片上，保持覆膜完整； 4) 壓片：用蓋玻片蓋在覆膜載玻片的樣品液上，垂直敲打蓋玻片，使染色體散開；壓 片、揭掉蓋玻片、室溫晾乾覆膜載玻片； 第二步，顯微切割 1) 準備收集管：將PCR管固定在雷射顯微切割儀的收集管架上，向PCR管中加入3? 6 ill 1 % TE 溶液； 2) 上樣：將上述晾乾的覆膜載玻片倒置固定於雷射顯微切割儀的樣品夾中； 3) 尋找目標染色體：在顯微鏡10?30倍鏡下尋找目標染色體； 4) 選定目標染色體：切換顯微鏡40?63倍鏡，調出清晰畫面； 5) 調節雷射參數： 6) 目標染色體劃線：畫出要切割的目標染色體區域； 7) 雷射切割：自動或手動控制雷射切下所選取的目標染色體，並收集至PCR管；小心取 下PCR管，並蓋嚴，對PCR管進行離心，使溶有染色體的溶液沉入管底，並於-40°C?_80°C 保存，備用。
2. 根據權利要求1所述的獲得牡丹單條染色體的方法，其特徵在於，所述的樣品製備 過程中，步驟1)所述牡丹花蕾的顏色嫩黃、直徑為12?16mm。
3. 根據權利要求1所述的獲得牡丹單條染色體的方法，其特徵在於，所述的樣品製備 過程中，步驟1)所述的軟化及切取花葯過程為，在普通載玻片上滴一滴醋酸，將選取的雄 蕊置於醋酸中軟化，用解剖針切取1?3mm長的花葯。
4. 根據權利要求1所述的獲得牡丹單條染色體的方法，其特徵在於，所述的樣品製備 過程中，步驟3)轉膜，還包括，用少量醋酸清洗殘留在普通載玻片上的樣品液，將清洗液也 轉移到覆膜載玻片上。
5. 根據權利要求1所述的獲得牡丹單條染色體的方法，其特徵在於，所述的顯微切割 過程中，步驟5)調節的雷射參數為：雷射強度範圍，15?20 ;雷射孔徑1?3 ;雷射切割速 度10?15 ;其他參數為機器設定參數。
6. 根據權利要求1至4任一項所述的獲得牡丹單條染色體的方法，其特徵在於，樣品制 備操作在〇?4°C進行。
【文檔編號】C12N5/04GK104357375SQ201410648397
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月14日 優先權日:2014年11月14日
【發明者】袁軍輝, 胡永紅, 張林娟 申請人:上海辰山植物園