秀珍菇液體菌種、菌絲體及半連續製備工藝的製作方法

2023-08-10 00:20:11

本發明涉及菌種培養領域，具體而言，涉及一種秀珍菇液體菌種、菌絲體及半連續製備工藝。

背景技術：

食用菌作為一種重要的生物資源，不僅味道鮮美、低脂肪、低能量，還富含膳食纖維、維生素和蛋白質等營養素，正發展成為繼動物性食品、植物性食品之外的第三類食品，即菌物性食品。此外，食用菌還可以提高人體免疫功能、防治多種慢性病，在抗衰老等方面也具有顯著的功效。在眾多食用菌中，秀珍菇(Pleurotus geesteranus)是側耳科側耳屬的一種，俗稱環柄香菇。秀珍菇中含有許多營養成分，如胺基酸、礦物質等，還有豐富的蛋白質，而且脂肪的量較低，經過烹飪的秀珍菇風味獨特，十分可口。食用秀珍菇對我們的身體也是具有相當多的益處，因為它能夠改善我們自身的免疫力，也可以對人們所擔心的血脂及膽固醇起到一定的降低作用，倍受廣大消費者喜愛。秀珍菇具有很好的發展潛力和經濟效益，而且具有非常好的國內市場和出口前景，因此市場需求量越來越大。以前小作坊式的固體培養方式已經遠遠不能滿足秀珍菇產業快速發展的趨勢，大規模機械化的生產已是必然，因此採用現代生物工程技術的液體深層發酵培養越來越受到重視。液體深層發酵是採用生物培養(發酵)設備，通過液體深層培養(發酵)的方式生產食用菌菌球，作為食用菌栽培的種子，或作為有效成分提取分離及深加工的原料。液體深層發酵培養的液體菌種具有固體菌種不可比擬的優勢：制種快、活力強、純度高、防汙染、縮短栽培周期。

另外，根據生產過程中發酵連續度的不同以及對微生物培養情況的不同，可以將液體深層發酵分為三種類型：連續發酵、分批發酵以及補料分批發酵。其中，補料分批發酵是在整個分批發酵的過程中，向發酵罐或者是發酵瓶中有間斷性的添加新鮮培養基，但是不會將用過的發酵液連續地倒出，因此最終發酵液的含量會增加。補料分批發酵是處於連續發酵與分批發酵中間的一類發酵方式，對比分批發酵，補料分批發酵能夠減少發酵液的粘度以及底物的濃度，也能提升微生物利用營養因素及氧氣的能力，同時可以緩解底物的遏制作用，最終使微生物的產量有較大的提升。但是目前補料分批發酵多應用在酶製劑、有機酸以及抗生素等微生物產品的製備，很少應用於培養食用菌的液體菌種。究其原因，是因為目前的補料分批發酵培養食用菌雖然可在一定程度上提交產量，但是由於工序太過繁瑣，導致成本高，很難推廣使用。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種秀珍菇液體菌種的製備方法，秀珍菇液體菌種的產量很高、成本低，易於推廣使用。

本發明的另一目的在於提供一種秀珍菇液體菌種，其成活率高，質量好，易於保藏。

本發明的另一目的在於提供一種秀珍菇菌絲體，可作為秀珍菇有效成分提取分離及深加工的原料。

本發明的實施例是這樣實現的：

一種秀珍菇液體菌種的半連續製備工藝，其包括以下步驟：

將秀珍菇母種經過活化發酵培養，得到秀珍菇菌種；

將秀珍菇菌种放入發酵培養基中進行培養3-5天，得到培養菌液，將培養菌液按重量分為N等份，N＝4-6，在每等份培養菌液中加入新鮮的發酵培養基，使添加發酵培養基後的每等份培養菌液的重量與培養菌液總重量相等，繼續培養2-4天，得到秀珍菇液體菌種。

在本發明較佳的實施例中，上述發酵培養基的製備工藝為：

按重量份數計，稱取30-50份可溶性澱粉，35-65份酵母膏放入800-1200份水中煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；

在濾液中加入1-2份KCl，0.004-0.006份維生素B1，分裝後，於120-122℃高溫滅菌15-25min。

在本發明較佳的實施例中，上述秀珍菇菌種和培養菌液培養方式為：於20-30℃，轉速120-160r/min的條件下搖床培養。

在本發明較佳的實施例中，上述秀珍菇菌種的加入量為發酵培養基質量的8-12％。

在本發明較佳的實施例中，上述將秀珍菇母種進行活化發酵培養的方法是：

將秀珍菇母種活化後，轉接到斜面培養基上，放入26-30℃的恆溫培養箱中培養，得到斜面菌種；

將斜面菌種接入液體培養基中，斜面菌種的加入量為液體培養基的3-6g/L，於25-29℃，轉速170-230r/min的條件下搖床培養5-7天。

在本發明較佳的實施例中，上述斜面培養基的製備工藝為：

按重量份數計，稱取30-50份去皮馬鈴薯，加入160-240份水，煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；

向濾液添加3-5份蔗糖，3-5份瓊脂粉，補水至總重量為160-240份，混勻融化後進行分裝，於120-122℃高溫滅菌15-25min。

在本發明較佳的實施例中，上述液體培養基的製備工藝為：

按重量份數計，稱取30-50份去皮馬鈴薯，加入160-240份水，煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；

向濾液添加3-5份蔗糖，補水至總重量為160-240份，混勻融化後進行分裝，於120-122℃高溫滅菌15-25min。

一種秀珍菇液體菌種，採用上述的半連續製備工藝製得。

在本發明較佳的實施例中，上述秀珍菇液體菌種的保藏溫度為0-5℃。

一種秀珍菇菌絲體，將上述的秀珍菇液體菌種經過微濾膜過濾去除濾液得到。

本發明實施例的有益效果是：本發明實施例將秀珍菇母種經過活化發酵培養，得到秀珍菇菌種，然後將秀珍菇菌种放入發酵培養基中進行培養3-5天，得到培養菌液，將培養菌液按重量分為N等份，在每等份培養菌液中加入新鮮的發酵培養基，使每等份添加發酵培養基後的培養菌液的重量與培養菌液總重量相等，繼續培養2-4天，得到秀珍菇液體菌種。本發明實施例間隔相同時間，倒出之前發酵液的一部分，然後增添同等體積的新鮮發酵液發酵，秀珍菇液體菌種的產量很高、成本低，易於推廣使用；而且製得的秀珍菇液體菌種成活率高，質量好，易於保藏；進一步得到的秀珍菇菌絲體，可作為秀珍菇有效成分提取分離及深加工的原料。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

下面對本發明實施例的秀珍菇液體菌種、菌絲體及半連續製備工藝進行具體說明。

本發明實施例提供一種秀珍菇液體菌種的半連續製備工藝，其包括以下步驟：

S1、將秀珍菇母種經過活化發酵培養，得到秀珍菇菌種，具體方法如下：

S1A、將秀珍菇母種活化後，轉接到斜面培養基上，放入26-30℃，優選28℃的恆溫培養箱中培養，得到斜面菌種。

其中，斜面培養基的製備工藝為：按重量份數計，稱取30-50份去皮馬鈴薯，加入160-240份水，煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；向濾液添加3-5份蔗糖，3-5份瓊脂粉，補水至總重量為160-240份，混勻融化後進行分裝，於120-122℃高溫滅菌15-25min。優選地，按重量份數計，稱取40份去皮馬鈴薯，加入200份水，煮20min，用4層紗布過濾，得濾液；向濾液添加4份蔗糖，4份瓊脂粉，補水至總重量為200份，混勻融化後進行分裝，於121℃高溫滅菌20min，即得。

S1B、將斜面菌種接入液體培養基中，斜面菌種的加入量為液體培養基的3-6g/L，於25-29℃，轉速170-230r/min的條件下搖床培養5-7天。優選地，斜面菌種的加入量為液體培養基的4.5g/L，於27℃，轉速200r/min的條件下搖床培養6天。

其中，液體培養基的製備工藝為：按重量份數計，稱取30-50份去皮馬鈴薯，加入160-240份水，煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；向濾液添加3-5份蔗糖，補水至總重量為160-240份，混勻融化後進行分裝，於120-122℃高溫滅菌15-25min。優選地，按重量份數計，稱取40份去皮馬鈴薯，加入200份水，煮20min，用4層紗布過濾，得濾液；向濾液添加4份蔗糖，補水至總重量為200份，混勻融化後進行分裝，於121℃高溫滅菌20min，即得。

S2、將秀珍菇菌种放入發酵培養基中進行培養3-5天，優選培養4天，其中，秀珍菇菌種的加入量為發酵培養基重量的8-12％，優選為10％，培養是於20-30℃，轉速120-160r/min的條件下搖床培養，優選於25℃，轉速140r/min的條件下搖床培養，得到培養菌液。

將培養菌液按重量分為N等份，在每等份培養菌液中加入新鮮的發酵培養基，直至添加發酵培養基後的每等份培養菌液的重量與培養菌液總重量相等，繼續培養2-4天，其中，N＝4-6，N優選為5，即在每等份培養菌液中加入的發酵培養基佔總重量的80％(補料量為80％)，優選再繼續培養3天，培養條件與之前的培養條件相同，於20-30℃，轉速120-160r/min的條件下搖床培養，培養結束後，吸取其中的液體發酵培養基，得到秀珍菇液體菌種。

秀珍菇菌种放入發酵培養基中進行培養時，總發酵時間過短，菌種得不到有效增值，但是總發酵時間太長，培養基中的能量消耗完畢後，菌種會自我消耗，得到秀珍菇液體菌種的數量和質量都會下降，因此，總發酵時間優選為6-8天，7天最佳。

其中，發酵培養基的製備工藝為：按重量份數計，稱取30-50份可溶性澱粉，35-65份酵母膏放入800-1200份水中煮15-25min，用3-5層紗布過濾，得濾液；在濾液中加入1-2份KCl，0.004-0.006份維生素B1，分裝後，於120-122℃高溫滅菌15-25min。優選地，按重量份數計，稱取40份可溶性澱粉，50份酵母膏放入1000份水中煮20min，用4層紗布過濾，得濾液；在濾液中加入1.5份KCl，0.005份維生素B1，分裝後，於121℃高溫滅菌20min，即得。

本發明實施例還提供一種秀珍菇液體菌種，是採用上述的半連續製備工藝製得。

該秀珍菇液體菌種保藏的較佳溫度為0-5℃。另外，該秀珍菇液體菌種可於6-15℃下保藏12天，於16-20℃下保藏8天，於21-25℃下保藏4天，保藏後的秀珍菇液體菌種質量優。

本發明實施例還提供一種秀珍菇菌絲體，是將上述的秀珍菇液體菌種經過微濾膜過濾去除濾液，收集濾渣，即得秀珍菇菌絲體。

以下結合實施例對本發明的特徵和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

本實施例提供一種秀珍菇液體菌種，按以下過程製備：

製備斜面培養基(200mL)：稱去皮馬鈴薯40g，加入200mL水，煮20min，然後用4層紗布過濾，向得到的濾液中添加蔗糖與瓊脂粉各4g，補水至200mL，混勻融化後進行分裝，置於121℃高溫下滅菌20min。製備液體培養基(200mL)：不加瓊脂，其他操作與製備斜面培養基相同。對上述斜面培養基和液體培養基滅菌後，分別將斜面培養基和液體培養基放入恆溫培養箱培養2d，觀察沒有雜菌，說明沒有被汙染。

製備秀珍菇發酵培養基：稱可溶性澱粉40g，酵母膏50g放入1000mL水中煮20min，4層紗布過濾，得濾液，加1.5gKCl，5mg維生素B1，pH自然，分裝後，於121℃高溫滅菌20min。

將秀珍菇母種活化後，轉接到斜面培養基上，放入28℃恆溫培養箱中培養，得到斜面菌種；從培養好的斜面菌種上取1/5接入液體培養基中，斜面菌種的加入量為液體培養基的4.5g/L，於27℃，轉速200r/min的條件下搖床培養6天，得到秀珍菇菌種。

將秀珍菇液體菌种放入發酵培養基培養4天，秀珍菇菌種的加入量為發酵培養基重量的10％，於25℃，轉速140r/min的條件下搖床培養，得到培養菌液；將培養菌液分為5等份，每等份培養菌液的重量為培養菌液總重量的20％，在每等份培養菌液中分別加入培養菌液總重量80％的發酵培養基，每等份添加發酵培養基後的培養菌液的重量與培養菌液總重量相等，繼續培養3天，吸取收集其中的液體發酵培養基，得到秀珍菇液體菌種。

實施例2

本實施例提供一種秀珍菇液體菌種，按以下過程製備：

製備斜面培養基(200mL)：稱去皮馬鈴薯30g，加入160mL水，煮15min，然後用3層紗布過濾，向得到的濾液中添加蔗糖與瓊脂粉各3g，補水至200mL，混勻融化後進行分裝，置於120℃高溫下滅菌15min。製備液體培養基(200mL)：不加瓊脂，其他操作與製備斜面培養基相同。

製備秀珍菇發酵培養基：稱可溶性澱粉30g，酵母膏35g放入800mL水中煮15min，3層紗布過濾，得濾液，加1gKCl，4mg維生素B1，分裝後，於120℃高溫滅菌15min。

將秀珍菇母種活化後，轉接到斜面培養基上，放入26℃恆溫培養箱中培養，得到斜面菌種；取斜面菌種上接入液體培養基中，斜面菌種的加入量為液體培養基的3g/L，於25℃，轉速170r/min的條件下搖床培養5天，得到秀珍菇菌種。

將秀珍菇液體菌种放入發酵培養基培養3天，秀珍菇菌種的加入量為發酵培養基重量的8％，於20℃，轉速120r/min的條件下搖床培養，得到培養菌液；將培養菌液分為4等份，每等份培養菌液的重量為培養菌液總重量的25％，在每等份培養菌液中分別加入培養菌液總重量75％的發酵培養基，每等份添加發酵培養基後的培養菌液的重量與培養菌液總重量相等，繼續培養4天，吸取收集其中的液體發酵培養基，得到秀珍菇液體菌種。

實施例3

本實施例提供一種秀珍菇液體菌種，按以下過程製備：

製備斜面培養基(200mL)：稱去皮馬鈴薯50g，加入240mL水，煮25min，然後用5層紗布過濾，向得到的濾液中添加蔗糖與瓊脂粉各5g，補水至200mL，混勻融化後進行分裝，置於122℃高溫下滅菌25min。製備液體培養基(200mL)：不加瓊脂，其他操作與製備斜面培養基相同。

製備秀珍菇發酵培養基：稱可溶性澱粉50g，酵母膏65g放入1200mL水中煮25min，5層紗布過濾，得濾液，加2gKCl，6mg維生素B1，分裝後，於122℃高溫滅菌25min。

將秀珍菇母種活化後，轉接到斜面培養基上，放入30℃恆溫培養箱中培養，得到斜面菌種；取斜面菌種接入液體培養基中，斜面菌種的加入量為液體培養基的6g/L，於29℃，轉速230r/min的條件下搖床培養7天，得到秀珍菇菌種。

將秀珍菇液體菌种放入發酵培養基培養5天，秀珍菇菌種的加入量為發酵培養基重量的12％，於30℃，轉速160r/min的條件下搖床培養，得到培養菌液；將培養菌液分為6等份，每等份培養菌液的重量為培養菌液總重量的15％，在每等份培養菌液中分別加入培養菌液總重量85％的發酵培養基，每等份添加發酵培養基後的培養菌液的重量與培養菌液總重量相等，繼續培養2天，吸取收集其中的液體發酵培養基，得到秀珍菇液體菌種。

對比例

本實施例提供一種秀珍菇液體菌種，按分批發酵製備工藝製備，具體過程如下：

按照與實施例1中相同的方法製備斜面培養基、液體培養基和秀珍菇發酵培養基，並按照與實施例1中相同的方法，將秀珍菇母種經過活化發酵培養，得到秀珍菇菌種。

將秀珍菇菌種分為5等份，在每等份中加入發酵培養基，直至每等份添加發酵培養基後的秀珍菇菌種的重量與秀珍菇菌種總重量相等，於25℃，轉速140r/min的條件下搖床培養7天，吸取收集其中的液體發酵培養基，得到秀珍菇液體菌種。

以下對實施例1-3中採用半連續製備工藝製得的秀珍菇液體菌種和對比例中採用分批發酵製備工藝製得的秀珍菇液體菌種進行檢測。在指標測定之前，先進行鏡檢，觀察液體菌種是否被汙染雜菌，若沒有則進行下一步。檢測項目如下：

1、菌絲球數量

吸取10mL液體發酵培養基，將其倒入平皿中，在其下方墊方格紙，然後計菌球數。

2、採用DNS法測定還原糖

首先在15mL的試管中加入不同濃度的葡糖糖標準溶液，以0.2為一個濃度，每隔0.2再取四個濃度，一共取5個，對照管是不含葡萄糖，取完溶液後，都要將它們補到1.0mL，之後再加相同體積的DNS試劑，然後煮沸2min，待溶液的溫度降下來之後，補水至試管的最大體積。最後，測540nm波長下的吸光值，繪製葡萄糖標準曲線。

取1.0mL液體發酵培養基，然後稀釋為100mL，使含糖量為0.1-1.0mg/mL。吸取1mL稀釋液，按照上述的測定步驟，測出稀釋液的吸光度，然後對照葡萄糖標準曲線查出還原糖含量。

3、氨基氮的測定

先取3個一樣大小的錐形瓶，然後編號。將5mL水和2mL液體發酵培養基同時加入1、2號瓶內，混勻。將7mL水加入3號瓶中。然後在3個錐形瓶中分別滴加滴酚酞指示劑，混勻後再加入2mL的甲醛溶液，再次將其混勻，接著用0.02mol/L標準氫氧化鈉溶液進行滴定，使溶液呈微紅色。氨基氮含量＝100×[(V樣品-V空白)×NNaOH×14.008]/2，單位是mg/100mL。

4、pH值的測定

先校正pH計，校正之後取適量的液體發酵培養基，然後進行測量。

5、菌絲球乾重

用濾紙收集50mL液體發酵培養基中的菌絲球，並清洗3次，將其置於處理好的平皿上，然後烘0.5h，再稱量菌絲球重量，然後接著烘乾，直至恆重。

6、澱粉酶活性的測定

澱粉酶活性測定時先取5mL的液體發酵培養基，然後以3000r/min離心10min，倒出上清液，放入50mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，製成澱粉酶原液。吸取澱粉酶原液5mL，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為澱粉酶稀釋液。接下來取一定量澱粉酶稀釋液將其放在40℃、pH6.0的條件下，使其在一定的作用時間裡把澱粉轉化為還原糖，然後與DNS試劑作用，在540nm波長下進行比色測定，查圖得出還原糖的生成量，進一步計算澱粉酶活性。澱粉酶活性＝C×VT/(w×VS×t)，單位是u/mL。式中：C—從標準曲線上查得的麥芽糖含量(mg)；w—吸取的發酵液(w＝5ml)；VT—澱粉酶總體積(VT＝500mL)；VS—反應所用的澱粉酶體積(VS＝1mL)；t—反應時間(t＝5min)。得到麥芽糖標準曲線。

7、蛋白酶活性的測定

蛋白酶活性測定時先取5mL的液體發酵培養基，然後以12000r/min離心5min，倒出上清液。在實驗中以1％酪蛋白為底物，它是以緩衝溶液為溶劑的。我們將一定量的酶液放入其中，然後在37℃水浴中讓它們有10分鐘的反應時間，再加入5％的TCA，將其與水浴之前添加5％的TCA相比，測量它們在280nm波長下的OD值。蛋白酶活性＝ΔA×1000/(t×VS)，單位是u/mL。式中：ΔA—樣品與空白吸光度差值；t—酶作用時間(t＝10min)；VS—反應中酶的體積，mL。

8、纖維素酶活性的測定

首先要繪製標準曲線，以0.2mL為一個梯度，一共取5個值，將它們置於25mL的試管，並補水至1.0mL，接著添加3mL的DNS試劑，煮沸10min，等溫度降低至室溫，補水至25mL，測量它們在550nm波長下的OD值，繪製葡萄糖標曲。

先吸取1mL液體發酵培養基稀釋至100mL，從稀釋的液體發酵培養基中取出1mL於25mL的刻度試管中，再加入3mL0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液，50℃水浴0.5h，取出後立即煮沸10min，為了使酶失去活性。取出冷卻後加入顯色液3mL，再煮沸10min，冷卻定容至25mL，混勻後，在550nm波長下測OD值。空白管測定是將1mL稀釋液放入沸水浴中5min，待之冷卻後，其它操作同樣品管的測定。纖維素酶活性＝100×C/(t×VS)，單位是u/mL。式中：C—從標準曲線上查得的葡萄糖含量(mg)；t—酶作用時間(t＝30min)；VS—反應中酶的體積(VS＝1mL)。

檢測結果：

一、不同製備工藝對秀珍菇液體菌種產量的影響。

表1不同製備工藝生產秀珍菇液體菌種

從上表可知，本發明實施例1-3中按照半連續製備工藝製得的秀珍菇液體菌種的菌絲球數量較多，菌絲乾重比較高，而且經檢測得出，其中的澱粉酶及蛋白酶的活力較好，尤其是實施例2製得的秀珍菇液體菌種的菌絲球數量最多，菌絲乾重最高，其中的澱粉酶及蛋白酶的活力最好。

二、不同製備工藝對秀珍菇液體菌種質量的影響。

本發明實施例1-3中採用半連續製備工藝製得的秀珍菇液體菌種和對比例採用分批發酵製備工藝製得的秀珍菇液體菌種，它們的pH在整個發酵過程中都是趨於平穩，而且還原糖含量都先升高後減少，這是因為培養前期發酵培養基中的澱粉酶及纖維素酶等份解培養基，產生了還原糖，但是碳源的利用少於還原糖的生成，所以產生該趨勢。在對比例中，氨基氮含量在持續減少，因為菌絲球生長消耗了氮源，而補料後氨基氮含量有所上升，這是因為加入了氮源，之後也成下降趨勢，但是本發明實施例1-3測得的氨基氮含量比分批發酵略高，表明分批發酵時，氮源利用地更好，而且澱粉酶活力和纖維素酶活力都高於對比例，蛋白酶活力比對比例略高。綜合其它指標，可以看出，按照本發明實施例的半連續製備工藝製得的秀珍菇液體菌種的質量更好。

三、秀珍菇液體菌種保藏結果。

1、秀珍菇液體菌種平皿復活試驗

以下是0-5℃下保藏2d的半連續發酵和分批發酵秀珍菇液體菌種的平皿復活結果。

表2秀珍菇平皿復活結果(h)

2、秀珍菇液體菌種成活率試驗

表3秀珍菇成活率(％)

由上表可以發現：延長保藏的時間，菌種的萌發時間也會相應延長，兩種發酵方法製備的液體菌種在0-5℃下保藏12天後菌種都能存活，這表明以此溫度保藏液體菌種，菌種的質量基本沒有降低，隨著溫度的升高，同一保藏時間下的菌種會延遲萌發期，成活率有所下降。當溫度一定，增加菌種的保藏時間，萌發時間也會往後推遲，成活率下降。當菌種成活後，有汙染情況，這表明菌種在該保藏時間下可能已經被汙染。另外，我們發現纖維素酶活力的變化基本與保藏時間呈負相關，同時保藏溫度越高，纖維素酶活力下降得更快，這就說明了菌種的質量也下降得更快。

綜上所述，本發明實施例的秀珍菇液體菌種的製備方法，秀珍菇液體菌種的產量很高、成本低，易於推廣使用；而且製得的秀珍菇液體菌種成活率高，質量好，易於保藏；進一步得到的秀珍菇菌絲體，可作為秀珍菇有效成分提取分離及深加工的原料。

以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述並非旨在限制要求保護的本發明的範圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。