與動物毛髮選擇性結合的抗體和用於動物的基於抗體的藥物遞送系統的製作方法

2023-08-09 22:52:21 3

專利名稱：與動物毛髮選擇性結合的抗體和用於動物的基於抗體的藥物遞送系統的製作方法
與動物毛髮選擇性結合的抗體和用於動物的基於抗體的藥
物遞送系統本發明提供與動物毛髮選擇性結合的抗體和其中可將特定製劑引導(directed to)至動物毛髮的基於抗體的藥物遞送系統。這是由以下需求驅動的增加動物的外寄生 物治療的有效治療時期、降低這些藥物的毒性並改進其釋放概況(profile)。選擇兩種單克隆抗體，其對犬的毛髮表面顯示出高度結合性。重要的是，沒有檢測 到對人、馬或貓的毛髮的結合。本文呈現的數據證明，所選的抗體適合於設計將藥物引導至 動物毛髮的遞送系統。
背景技術：
在很久以前本領域技術人員已經知道抗體與毛髮結構的附著(attachment)或連 接以及那些抗體在與毛髮治療活性物質或含有毛髮治療活性物質的顆粒連接中的有益用 途。Widder (美國專利3，987，161)描述了包含抗體的毛髮護理產品，所述抗體含有從動物 獲得的血清，所述動物在其身體被注射哺乳動物(優選人)毛髮的水性懸浮液時能夠在血 液中形成抗體。Igarashi等人(美國專利5，597，386)描述了攜帶毛髮染料或含有著色物 質的聚合物顆粒(例如聚苯乙烯顆粒)的抗毛髮抗體，因此使著色活性物質與人的毛髮結 合，以便獲得毛髮治療中的益處。該抗體被描述為抗角蛋白抗體，其是通過向哺乳動物肌肉 內注射角蛋白聚合物並通過牛初乳收穫抗體而獲得的，其中通過人毛髮結構的水解和分解 而獲得角蛋白。攜帶染料的顆粒被描述為大分子載體。Koyama等人(美國專利6，123，934) 描述了含有與毛髮結合的抗體的化妝品組合物以及使用該抗體將乙烯基單體的聚合物或 共聚物的膠乳顆粒與毛髮結構連接。製劑可以含有陽離子聚合物或其它成分，以改善或修 復毛髮結構。在該發明中，通過注射水解的人毛髮或人毛髮顆粒(通過將完整的毛髮纖維 結構磨碎而得到)來免疫家禽，從而獲得抗體。在所有這些發明中，使用人的毛髮結構進行 免疫，並獲得與角蛋白結合的多克隆抗體。一般來講，已經知道可以通過用生物抗原結構來 免疫哺乳動物或鳥類以產生抗體，然後可將抗體用於將與那些抗體直接或間接連接的有益 活性物質引導至需要的區域，例如癌細胞。Paluzzi和合作者(2004)已經使用來自羊絨(cashmere)的II型角蛋白作為抗原 來產生物種特異性的單克隆抗體。通過二維免疫印跡測試所選擇抗體與分離自羊絨和羊毛 的角蛋白的免疫反應性。檢測到幾個定量和定性差異，這使得在與其它動物纖維比較時，能 夠特異性地鑑別羊絨。但是，所選則的單克隆抗體與所有樣品結合，在所測試物種之間僅觀 察到信號強度和蛋白模式上的微小差異。重要的是，抗體與所提取的角蛋白I型和II型蛋 白結合一沒有證明其與毛髮表面結合。在獸醫領域，人們可以通過使用含有有益試劑的顆粒而從那些發明中獲益，並且 通過使用與動物毛髮或動物皮膚結合的抗體將那些試劑靶向毛髮角蛋白結構或皮膚結構。 當人們考慮選擇使用這些顆粒作為在延長的時期內(即幾周、一個月甚至一年)釋放那些 藥物的物體，這是特別有用的，從而保護動物抵抗有害動物(即，昆蟲例如蚤和蜱)，或者 利用其它有益效應，例如抵制有害昆蟲或在這個長時期內治療皮膚疾病。按一次性施用制
3備為此目的而設計的典型製劑，其顯示出幾個小時至大約四周的有益效應。使用載體系統 (例如聚合物顆粒)可以提供顯著延長這個時期的選擇。使用抗體將那些顆粒與毛髮連接 可以提供一個選擇，以提供活性物質與毛髮的連接，該連接持續足夠長的時間以允許藥物 載體在需要的時期內與毛髮或皮膚結合(stick)。需要合適的製劑。可用於將那些製劑應 用至動物的應用系統是例如，噴霧劑或所謂的點式(spot-on)或擦式(wipe-on)製劑，其 使製劑與動物皮膚或毛皮接觸。感興趣的活性物質可以是例如擬除蟲菊酯或一般性殺蟲 劑，以及全身性藥物或行為調節藥劑。以上專利中描述的方法可提供獲得此類藥物遞送系統的途徑。但是，由於那些發 明中描述的抗體以及通過所描述的方法所獲得的抗體與毛髮角蛋白結構結合，因此出現一 個主要的缺點不論是何種物種，經由噴霧劑或點式製劑將製劑施用於動物時，會產生強烈 且持久的與哺乳動物毛髮(即角蛋白結構)的結合。因此，人類施用者也可能由於那些攜 帶藥物的系統與體毛或頭髮偶然結合而接受活性物質的劑量。同樣，有可能由於撫摸動物 而使那些攜帶藥物的活性物質轉移至人體，這有時可能會使寵物主人暴露於有侵襲性的活 性物質，例如擬除蟲菊酯。為了施用安全原因，如果人們可以獲得允許選擇性靶向某些動物 物種的毛髮或皮膚的抗體，則將是一個大的優點。如果獸醫必需在畜舍(多個物種飼養於 其中，並且只有一個物種表現待治療的疾病，或者僅必需保護一個物種免遭物種特異性害 蟲(侵害))中使用那些製劑，則獲得此類抗體製劑也具有相當大的優點。如果人們使用以上描述的現有技術方法，以獲得針對動物毛髮的抗體，則本領域 技術人員將會預期獲得與角蛋白結構結合的抗體。角蛋白普遍存在於所有哺乳動物中，不 同物種間的蛋白序列是十分保守的。因此，抗角蛋白抗體將普遍結合至哺乳動物毛髮。在本發明中，令人驚奇地發現可以獲得物種特異性的毛髮結合抗體，其僅與物種 特異性動物毛髮表面結構結合，而不與人的毛髮表面或不同於用其毛髮進行免疫的那個物 種的物種的毛髮表面結合。顯而易見地，存在可被那些抗體靶向的物種特異性抗原結構。包 含那些抗體以及與那些抗體(作為分子實體或填充入含有藥物的顆粒中)連接的藥物的攜 帶藥物的製劑能夠避免以上描述的缺點。本發明實施方式的描述本發明提供了與動物的毛髮表面選擇性結合的抗體。此類抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體或重組抗體，例如全長抗體(full-size antibody)、二聚體分泌性 IgA (dimeric secretory IgA)、多聚體 IgM(multimeric IgM)及 其片段，例如F(ab』 )2片段、Fab片段、Fv片段、單鏈Fv抗體(scFv)、雙特異性scFv、雙抗 體、三鏈抗體、四鏈抗體、單結構域抗體(dingle domain antibody) (dAb)、minobody或分子 識別單元(MRU)，其源自雜交瘤細胞、合成的、半合成的、原態的(naive)和免疫活性的噬菌 體庫或核糖體展示庫，或通過產生全合成設計抗體。本發明的抗體與犬、貓、牛、綿羊、山羊、駱駝、羊駝(Iama)和/或馬的毛髮表面結 構選擇性結合。本發明進一步提供靶向單獨動物物種的包含抗體的藥物遞送系統，所述抗體能夠 與所述單獨動物物種的毛髮表面選擇性結合。所述包含抗體的遞送系統結合或附著於固體顆粒的表面，從而使這些顆粒與動物 的毛髮表面結構選擇性結合。
本發明的藥物遞送系統按如下方式包含與單獨物種的動物毛髮選擇性結合的抗 體的製劑和含有活性成分的顆粒在第一步中抗體與所述單獨動物物種的毛髮選擇性結 合，在第二步中顆粒與偶聯於動物毛髮的抗體結合。本發明的藥物遞送系統進一步按如下方式包含與合適的間隔體(spacer)/介 質(mediator)/中間偶聯劑連接的或化學結合的動物毛髮結合性抗體(hair binding antibody)的製劑和顆粒的製劑在第一步中攜帶抗體的間隔體/介質/偶聯劑通過所述 抗體與動物毛髮選擇性結合，在第二步中顆粒通過與所述間隔體/介質/偶聯劑結合而連 接於動物毛髮。本發明進一步提供藥物遞送系統，其按如下方式包含動物毛髮結合性抗體的製劑 和合適的間隔體/介質/中間偶聯劑連接或附著於其表面的顆粒的製劑在第一步中抗體 與動物毛髮選擇性結合，在第二步中攜帶間隔體/介質/偶聯劑的顆粒通過與所述抗體結 合而連接於動物毛髮。本發明的藥物遞送系統按如下方式包含與動物毛髮選擇性結合的抗體以及顆粒 抗體和顆粒可以存在於對動物施用的單一製劑中；或可以存在於兩種不同的製劑(I)和 (II)中，在緊鄰對動物施用前將其混合；或者可以按如下方式存在於兩種不同的製劑(I) 和(II)中在第一步中對動物施用製劑(I)，稍後在第二步中對動物施用製劑(II)。藥物遞送系統包含顆粒，其可以含有或可以不含以下物質對動物有益的活性成 分或藥劑，即藥物；殺蟲劑；毛髮或皮膚護理劑；保護經處理的動物免受有害害蟲動物(例 如昆蟲)侵襲的驅除劑(Impellent agent)；氣味改變劑(smell modifying agents)；或改 變經處理的動物或其它未經處理，但與被施用該處理的動物相互作用的個體動物的行為的 藥劑。顆粒可含有對動物有益的活性成分或藥劑，其濃度適合於它的治療或有益目的， 即 0. 01% -99. 9%o本發明的藥物遞送系統是這樣的系統其中顆粒本身含有對動物有益的活性成分 或藥劑，即藥物；殺蟲劑；毛髮或皮膚護理劑；保護經處理的動物免受有害害蟲動物侵襲的 驅除劑；氣味改變劑；或改變經處理的動物或其它未經處理，但與被施用該處理的動物相 互作用的個體動物的行為的藥劑。顆粒的直徑可以是0.001 μ 至10 μ m，優選為0. 1 μ m至2 μ m。在對動物施用單一治療後，本發明的藥物遞送系統允許保護所述動物抵抗疾病， 持續治療動物疾病，或者允許動物從持續延長時期(即從幾個小時至365天)的所述活性 物質效應中受益。本發明的藥物遞送系統進一步按如下方式包含與動物毛髮選擇性結合的抗體的 製劑和對動物有益的藥劑有益試劑按如下方式直接或通過間隔體/介質/偶聯劑與所述 抗體連接/偶聯/結合所述活性物質與所述抗體或間隔體/介質/偶聯劑的連接被動物 毛皮(fur)或皮膚的環境條件所中斷(broken)，從而釋放活性物質或活性物質的一部分或 活性物質_抗體結構的一部分，以實現其對動物的有益效應。藥物遞送系統按如下方式起作用在延長的時期內，活性物質與抗體或間隔體/ 介質/偶聯試劑的結合被隨機中斷，從而允許保護所述動物抵抗疾病，持續治療動物疾病， 或者允許動物從持續延長時期(即從幾個小時至365天)的所述活性物質效應中受益。
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本文描述的藥物遞送系統包含與動物毛髮特異性結合的抗體或所述抗體的製劑， 其中所述抗體以合適的結合強度，按如下方式與動物毛髮結合與動物毛髮結合的抗體量 以及附著於所述抗體的活性成分的量保持足夠大，以在延長的時期內，甚至在動物毛皮與 水接觸幾次之後(例如通過洗澡或淋雨)或在用含有表面活性劑的溶液洗滌動物之後，維 持所需的有益效應。即使將其於4°C保存在含有水和至多50%的與水混溶的有機溶劑的溶液之中，持 續長達24小時的時期，本發明的抗體能夠保持其與動物毛髮選擇性結合的能力和特異性。即使將其配製或保存在含有其它毛髮處理化合物(即，表面活性劑，非離子、陰離 子或陽離子聚合物和與水混溶的醇，其濃度為毛髮護理製劑中通常所施用的濃度)的水溶 液中，抗體仍能夠保持其與動物毛髮選擇性結合的能力和特異性。在優選的實施方式中，藥物遞送系統包含本發明抗體，所述抗體另外直接或通過 合適的間隔體/介質/中間體偶聯試劑結合或附著於固體顆粒表面，從而使這些顆粒與動 物毛髮選擇性結合。


圖1顯示了抗體B7. 3和B18-4. 3在人和犬的毛髮上的結合。使用微量滴定板過 濾ELISA使單克隆抗體與各種犬的品種的毛髮和人的毛髮結合(5ng抗體在Img毛髮/孔 上)。使用與辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠Fc和ABTS底物進行檢測。所有樣品重複 分析三次，計算標準差。WHT=西高地梗犬(Westhighland terrier) 圖2是兩種抗體B7. 3和B18-4. 3的SDS-PAGE的免疫印跡。抗體B7. 3顯示預期 的重鏈和輕鏈尺寸，而抗體B18-4. 3具有兩個較短的重鏈片段，這是由B18-4. 3的重鏈基因 中的突變所引起的。圖3顯示了加載至具有抗生物素蛋白表面的珠粒(beads)上的生物素化的 B18-4.3的流式細胞計量術圖像。紅線(第二個峰)顯示了由與B18-4.3結合的山羊抗小 鼠藻紅蛋白所引起的位移(shift)，這表明抗體與珠粒結合。圖4顯示了螢光珠粒通過抗體B18-4. 3與犬的毛髮結合。a :0. 8 μ m鏈黴抗生物 素蛋白表面修飾的珠粒(與FITC偶聯)通過生物素化的B18-4. 3與西高地梗犬的毛髮結 合。b =Iym偶聯了中性抗生物素蛋白(neutravidin)的螢光球(fluosphere)通過生物素 化的B18-4.3與比格犬(Beagle)的毛髮結合，所述毛髮經過以下預處理在60°C下，用含 有300mM KBr的Tris-緩衝液(pH 8. 8)進行洗滌。圖5顯示了毛髮的共焦顯微鏡分析。抗體B18-4.3主要與毛髮薄片(hairflakes) 的邊緣結合。通過山羊抗小鼠Alexa488進行檢測。圖6顯示了通過抗體B7. 3和B18-4. 3識別的抗原結構的分析。用含有300mM KBr的Tris-緩衝液(pH 8.8)洗滌西高地梗犬的毛髮，通過丙酮沉澱將該洗滌級分(wash fraction)濃縮。通過免疫印跡分析經富集的毛髮表面蛋白(eHSP)。通過一抗B7. 3或 B18-4. 3，然後通過山羊抗小鼠AP標記的二抗並用NBT/BCIP染色來檢測抗原。圖7a和b顯示了毛髮特異性抗體B7. 3和B18-4. 3與犬、貓、馬和人的毛髮的結合。圖8證明了具備(equipped)抗體的微粒與犬毛髮的充分結合，與之對比的是與人 毛髮的差的結合。
圖9顯示了表面連接了犬毛髮特異性抗體B18-4. 3和B7. 3的混合物且含有螢光 染料的聚苯乙烯微粒，其與比格犬毛髮結合。含有染料的微粒用作結合指示劑，其與相同類 型的含有殺蟎劑的微粒一起施用。進行該實驗，以便顯示物種特異性的毛髮結合抗體以及 具備抗體的微粒作為控釋藥物載體，以保護犬抵抗蜱的示例性應用。施用之後立刻獲取圖 像，圖像顯示了對應於用蜱侵擾犬以後2天，微粒在一些毛髮樣品上的結合。圖10顯示了施用製劑7天以後微粒與犬毛髮的結合。圖Ila和b顯示了施用製劑14天以後微粒與犬毛髮的結合。圖12a、b和c顯示了即使在施用42天以後，仍然可以在犬毛髮上見到微粒，這證 明了抗體介導的微粒與犬毛髮的結合的持續性。圖13顯示了即使在對犬毛髮施用製劑63天以後，仍然可以在毛髮表面見到微粒。I·秘盼·_種禾_華通過將小鼠免疫然後使用雜交瘤技術來產生動物毛髮特異性抗體。使用勻漿器將 切自比格犬的毛髮切碎。切碎的(shredded)毛髮長度大約為200 μ m。用切碎的比格犬毛髮將兩隻小鼠免疫。將最多80 μ g毛髮樣品(=20 μ L切碎的 毛髮)與40 μ L GERBU佐劑和50 μ L Ix PBS混合，並用於免疫。在10月11日、10月25 日、11月3日和11月28日將小鼠免疫四次，在12月2日將小鼠殺死。分離脾細胞並與骨 髓瘤細胞融合，以產生雜交瘤。將遞增稀釋液中的細胞吸移(pipetting)至96孔微量滴定 板中以進行有限稀釋。為了篩選產生毛髮特異性抗體的雜交瘤克隆，建立新的ELISA方案 (setup)。將部分裂解的毛髮(在室溫下置於Shindai反應劑中10分鐘，然後進行勻漿並 重懸浮於碳酸鹽緩衝液中)包被至低結合性96孔微量滴定板上。加入雜交瘤細胞培養上 清液之後，使用與辣根過氧化物酶(HPRO)偶聯的山羊抗小鼠(GAM) 二抗檢測特異性抗體的 結合。鑑定出總共23個與毛髮樣品結合的多克隆雜交瘤克隆(B1-23)。但是，由於包被的 是部分裂解的毛髮，所以選擇與存在於毛髮內部的抗原結合的抗體以及與毛髮表面上的抗 原結合的抗體兩者。為了鑑定識別毛髮表面上的結構的結合者，使用基於Eppendorf的ELISA測試來 自單克隆雜交瘤系的抗體。用1滴膠水(glue)將20-50根人或動物毛髮固定於Eppendorf 管的底部，用PBS中的2% (w/v)BSA將非特異性結合位點封閉。將雜交瘤上清液或IOyg 純化的單克隆抗體轉移至管中並在室溫下孵育30分鐘。洗滌之後，使用山羊抗小鼠二抗 (以HRPO標記)檢測特異性結合，並在室溫下孵育20分鐘。最後，使用2，2』-連氮基-雙 3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸(ABTS)反應劑(作為HRPO的底物)顯現結合。30秒後在OD 405處測定顯色。通過基於Eppendorf的ELISA鑑定出兩種單克隆抗體。將這些抗體(命名為B7. 3 和B18-4. 3，其顯示出對動物毛髮表面的特異性結合)純化並關於其對不同毛髮樣品的特 異性進行表徵。單克隆抗體的純化通過蛋白G或者通過超濾沉澱從雜交瘤培養上清液中純化單克隆抗體B7. 3和 B18-4.3。純化蛋白的產率為0. 1至1. lmg/mL。純化的抗體用於後續分析。單克隆抗體的表徵抗體結合~基於Eppendorf的ELISA
為了定性確認純化的單克隆抗體B7. 3和B18-4. 3與毛髮表面的結合，使用了基於 Eppendorf 的 ELISA。抗體 B7. 3 和 B18-4. 3 與約克夏梗犬(Yorkshire terrier)的毛髮特 異性結合。重要的是，沒有檢測到與人毛髮的結合。使用以下毛髮樣品進行了另外幾個基於Eppendorf的ELISA 人、馬、貓、雪納瑞犬 /拉布拉多犬混種(Schnauzer/Labrador mix)、澳大利亞牧羊犬、洗滌前和洗滌後的貴賓犬 (Poodle) (3個樣品)、洗滌前和洗滌後的約克夏梗犬(4個樣品)、洗滌前和洗滌後的西高地 梗犬(2個樣品)。表1中列出了基於Eppendorf的ELISA的總結。數據顯示，兩種單克隆抗體均與來 自五個犬物種的毛髮表面特異性結合。當使用人、馬或貓的毛髮時，沒有觀察到結合，這證 明所選則的抗體對於犬毛髮具有強烈的特異性。似乎單克隆抗體B18-4.3比B7.3具有更 強的針對犬毛髮的結合活性。在不同的毛髮樣品之間存在一些微小的變化。在進行ELISA 之前對毛髮的處理降低了所有測試抗體的結合活性，但是仍然存在結合的抗體。表1 基於Eppendorf的ELISA測試結果。-=無結合，+ =低結合(0D 1 3)，* =洗滌後。
抗體人馬貓雪納瑞/ 拉布拉 多大澳大利 亞牧羊 犬責賓犬約克夏梗犬西高地 梗犬123123412B7.3++++ *++ +*++ A*+ *++ *+ *+ *++++ + **B18-4.3++++++-H- +*-H-+ **++ + **-H-++ + ■k*+ + *++ *++ + **++ + **抗體結合和功能件(functionality)建立了另一種ELISA，以能夠定量比較兩種抗體B7. 3和B18-4. 3與毛髮的結合。 將犬的毛髮切成2-5mm長的小段並溶於PBS(5mg/ml)中。將200 μ 1的這種懸浮液吸移入 96孔微量滴定過濾板(Multiscreen HTS，膜孔徑1. 2 μ m，Millipore)的每個孔中。通過離 心將緩衝液和底物進行交換，以致在這些程序中微量滴定過濾板中的毛髮不會減少。在預備實驗中將與Img毛髮(=孔)結合的最大抗體量確定為5-lOng (取決於犬 的品種和抗體)。因此，多數實驗以2. 5或5ng/孔進行。為了檢查兩種抗體與各種犬品種的毛髮的結合，用以下犬的的毛髮進行了微量滴 定過濾板ELISA 西高地梗犬、德國牧羊犬(來自腹部的毛髮)、約克夏梗犬混種、愛爾蘭塞 特犬(Irish setter)、德國硬毛梗犬(Germanwired-hair terrier)、豐公獅犬(Chow-chow) > 貴賓犬、小明斯特蘭德犬(smallMimsterlander)、比格犬、德國牧羊犬(來自背部區域的 毛髮)、霍夫瓦爾特犬(Hovawart)、西施犬(Shih_tzu)、狐狸犬(Spitz)、邊境柯利牧羊犬 (Border collie)、拉布拉多犬、Mongrel (來自背部的毛髮)> Mongrel (來自腹部的毛髮)、 伯瑞犬(Briard)、澳大利亞牧羊犬。在該測試中還包括人的毛髮。獲得的所有數值相對於
8西高地梗犬進行校正(圖1)。還使用共焦顯微鏡，通過免疫螢光成像來證明純化的抗體與毛髮表面的結合。例 如，抗體B7. 3顯示出與約克夏梗犬毛髮的強烈結合。當僅應用ALEXA564標記的山羊抗小 鼠二抗時，沒有觀察到螢光，這證明了 B7. 3對於毛髮表面的特異性。在應用抗體前，用丙酮 處理毛髮，導致螢光信號減少。當用溫和的去汙劑洗滌毛髮樣品時也觀察到相似的結果。抗體的完整件、穩定件和功能件為了證實抗體重鏈和輕鏈的完整性，通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳對純化的蛋白 進行分析。抗體B7. 3具有預期大小的完整的重鏈和輕鏈，而抗體B18-4. 3的兩條重鏈帶均 比全長重鏈小(大約44和47kDa，而不是55kDa)(圖2)。這些突變的重鏈之一是C2結構 域末端處的移碼突變的結果，移碼突變產生早熟的終止密碼子(premature stop codon) 0 另一條突變的重鏈的起源仍然未知。沒有觀察到B7. 3和B18-4. 3重鏈的降解產物，這證明 了純化抗體的完整性。為了分析穩定性，使用基於Eppendorf的ELISA在異丙醇的存在下進行單克隆抗 體的結合試驗。在30% (ν/ν)異丙醇的存在下，經4個月的時期，在4°C下，單克隆抗體Β7. 3 顯示出穩定的結合。於4°C將抗體保存在40%或50% (ν/ν)異丙醇中時，仍然存在與犬毛 發的結合，這證明了該蛋白的高度穩定性。此外，在22°C下，在20% (ν/ν)異丙醇的存在下， 抗體Β7. 3是穩定的。Β18-4. 3的穩定性更佳。在40% (ν/ν)異丙醇的存在下，該單克隆抗體在4°C下儲 存4個月時間後，顯示出與毛髮的穩定結合。另夕卜，在含有6 % (v/v)Luviskol VA 64W(BASF)、5 % (v/v)LuviquatPQ IlPN (BASF) ,0. 3 % (v/v) Pluracare E400 PEG-8 (BASF) ,0. 2 % (v/v) Q2-5220 樹月旨(Dow Corning)和15% (v/v)異丙醇的製劑溶液中測試了單克隆抗體的穩定性和功能性。在4°C 下，在製劑中儲存3天之後，使用基於Eppendorf的ELISA測試了抗體的結合，其表明，B7. 3 和B18-4. 3在製劑中具有高度穩定性。抗體結合能力(capacity)為了確定最大結合能力，使用確定數目的約克夏梗犬毛髮(20根，每根長20mm)， 以基於Eppendorf的ELISA對B18-4. 3的稀釋液進行測試。每個Eppendorf管中的毛髮表 面積對應於3. 15mm2。根據ELISA，2. 5-5. Ong的抗體B18-4. 3與3. 15mm2的毛髮表面結合。抗體的生物素化為了分析結合伴侶(binding partners)對抗體功能性的影響，使純化的單克隆 抗體生物素化，然後與抗生物素蛋白珠粒結合，通過FACS分析進行證實(圖3)。使用基於 Eppendorf的ELISA分析與犬毛髮的結合。通過與HRPO偶聯的抗生物素蛋白檢測生物素化 的抗體B7. 3和B18-4. 3的結合，其證明生物素化和結合伴侶不影響抗體的功能性。抗體與珠粒的融合為了分析與珠粒偶聯的單克隆抗體的結合，用含有0. 5% (v/v)吐溫20的Ix PBS 預處理來自西高地梗犬的毛髮，以除去汙染物和非緊密固定的抗原結構。然後，施用生物素 化的抗體B18-4. 3(0. 8mg/mL)，並使用鏈黴抗生物素蛋白包被的FITC螢光珠粒(Kisker)檢 測結合的抗體。珠粒尺寸為0.8 μ m。此外，將生物素化的抗體B18-4. 3偶聯至鏈黴抗生物 素蛋白包被的FITC螢光珠粒，將複合物施用到毛髮樣品，以分析結合(圖4a)。
實驗顯示，即使在60°C下，用含有300mM KBr的Tris-緩衝液(pH 8. 8)將毛髮洗 滌預處理，加載於Iym偶聯了中性抗生物素蛋白的螢光球(fluosphere) (Invitrogen)上 的生物素化的B18-4. 3仍然顯示出對比格犬毛髮的高度結合。這表明了毛髮表面上抗原的 高度穩定性(圖4b)。在2 μ m珠粒的情況下，這種效應較不顯著，這可能表明加入的珠粒被毛髮表面上 存在的幾種抗體結合。重要的是，用ΙΟμπι珠粒進行的實驗是陰性的。由於在洗滌程序過 程中損失珠粒，所以沒有觀察到染色。通過共焦顯微鏡進行的毛髮樣品分析表明，抗體主要與毛髮薄片的邊緣結合(圖 5)。抗體結合位點的鑑定表1中顯示的結果表明，通過使用溫和去汙劑洗滌毛髮樣品可以去除至少一部分 表面抗原。抗原結構的去除導致抗體結合減少。但是，仍然可以檢測到抗體結合，這證明相 當大部分的抗原保持與毛髮表面連接。用含有300mM KBr的Tris-緩衝液(pH 8. 8)洗滌西高地梗犬的毛髮並將此洗滌級 分濃縮時，結果得到富集毛髮表面蛋白(eHSP)的製劑。使用兩種抗體B7. 3或B18-4. 3中的 任一種，通過SDS-PAGE和免疫印跡對這些eHSP進行分析。結果顯示B7. 3與大小為32KDa 和38KDa的結構結合，而B18-4. 3在21KDa、28KDa和40KDa處檢測三條帶(圖6)。因此，兩 種抗體具有不同的特異性。可變抗體鏈的克隆為了得到單克隆抗體的遺傳信息，克隆了決定抗體結合特異性的可變抗體結構 域。進行了以下步驟·從雜交瘤克隆中分離RNA·逆轉錄為cDNA·通過PCR從抗體重鏈和輕鏈擴增可變區·使用剪接重疊延伸(SOE) PCR，通過短的接頭片段將兩個可變結構域融合·將單鏈抗體(scFv)片段克隆進入細菌載體·轉化細菌·分離質粒並測序通過測序證實scFvB7. 3和scFVB18_4基因的完整性。對ScFvB18_4測試其與犬毛髮的結合。通過ELISA證明單獨的scFvB18-4或通過 生物素_抗生物素蛋白與珠粒偶聯的scFvB18-4與毛髮樣品的結合。毛髮特異性抗體B7. 3和B18-4. 3與犬、貓、馬和人毛髮的結合通過ELISA將每個毛髮樣品測量三次。圖表給出樣品的平均值和標準差。平行地 進行兩個ELISA，每個圖表是一個ELISA的結果。當相同的樣品同時出現在兩個圖表(西高 地梗犬、歐洲家貓)中時，使用一個毛髮樣品吸移入兩個ELISA板。每孔吸移入Img毛髮。用PBS中的2% (w/v)奶粉進行封閉1個小時。使用PBS 中的濃度為50ng/ml的B7. 3或B18-4. 3作為一抗，其中每個孔使用100 μ 1抗體溶液。在 室溫下孵育1個小時。二抗是與過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠(抗IgG、IgM和IgA)；將抗 體在PBS中進行1 5000稀釋，每個孔使用100 μ 1。在室溫下孵育1個小時。最後每個孔
10以100 μ 1底物ABTS孵育42分鐘。在405nm處讀取所得的顏色反應。在各個步驟之間用 200μ1的PBS-T將板洗滌兩次。作為對照，將每種毛髮樣品的三個孔用非特異性小鼠抗體 孵育，其它處理如上所述。對於相同的毛髮樣品，從以Β7. 3和Β18-4. 3獲得的結果中減去 每個對照的平均值(圖7)。馬毛髮特異件抗體的產牛通過將小鼠免疫然後使用雜交瘤技術來產生馬毛髮特異性抗體。將來自馬的毛 發用PBS-T洗滌(1計83，吐溫20，0.05%)並使用勻漿器切碎。切碎的毛髮長度大約為 200 μ Hio用洗滌的、切碎的馬毛髮將兩隻小鼠免疫。將最多SOyg毛髮樣品(=20yL切 碎的毛髮)與40 μ L GERBU佐劑和50 μ L Ix PBS混合，並用於免疫。在7月8日、7月22 日、8月5日、8月18日、8月26日和9月8日將小鼠免疫六次，在9月10日將小鼠殺死。 分離脾細胞並與骨髓瘤融合，以產生雜交瘤。用如上所述的ELISA方案篩選產生馬毛髮特 異性抗體的多克隆雜交瘤克隆。將Ix PBS中的切碎的馬毛髮包被至低結合性96孔微量滴 定板上。加入雜交瘤細胞培養上清液之後，使用與辣根過氧化物酶(HPRO)偶聯的山羊抗小 鼠(GAM) 二抗檢測特異性抗體的結合。為了檢測抗體與毛髮的結合，使用ABST底物，孵育 30分鐘後在405nm處測定吸光度。鑑定出總共21個與毛髮樣品結合的多克隆雜交瘤克隆 (HF 1-21)。但是，由於包被的是切碎的毛髮，所以選擇與存在於毛髮內部的抗原結合的抗 體和與毛髮表面上的抗原結合的抗體兩者；培養單個細胞，以進一步產生單克隆。為了鑑定識別毛髮表面上的結構的結合者，使用微量滴定過濾板ELISA(參見抗 體結合和功能性，第10頁)測試來自單克隆雜交瘤系的抗體。將0.3mg馬、犬、貓和人的毛 發加入到微量滴定過濾板上的單獨的孔中，與每個待測試單克隆的100 μ L雜交瘤上清液 平行孵育。如上所述進行測試。通過使用經辣根過氧化物酶(HRPO)標記的二抗和2，2』_連 氮基-雙3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸(ABTS)反應劑(作為HRPO的底物)來顯現結合的 抗體。在室溫下孵育30分鐘後在405nm處測量顯色。可以看到抗體HF 17. 6與馬毛髮的 清晰的特異性結合(相比於犬、貓和人的毛髮)；低信號可能是由於製劑中抗體較少，因為 僅在選擇單克隆2天之後就進行測試，存在很少的產生抗體的細胞。表2:單克隆抗馬毛髮抗體HF 17. 6與四個不同物種毛髮的結合。如上所述進行 ELISA。評價抗體HF17. 6與馬、犬、貓和人的毛髮的結合。給出的數值是用ABTS孵育30分 鍾後在405nm處的吸光度(減去背景)。
貓毛髮特異件抗體的產牛 通過將小鼠免疫然後使用雜交瘤技術來產生貓毛髮特異性抗體。使用勻漿器將切自歐洲短毛貓的毛髮切碎。切碎的毛髮長度大約為200 μ m。用切碎的貓毛髮將兩隻小鼠免疫。將最多80 μ g毛髮樣品(=20 μ L切碎的毛髮) 與40 μ L GERBU佐劑和50 μ L Ix PBS混合，並用於免疫。在7月1日、7月15日、7月29 日、8月12日、8月26日和9月1日將小鼠免疫六次，在9月3日將小鼠殺死。分離脾細胞 並與骨髓瘤融合，以產生雜交瘤。用如上所述的ELISA方案篩選產生貓毛髮特異性抗體的 多克隆雜交瘤克隆。將Ix PBS中的切碎的貓毛髮包被至低結合性96孔微量滴定板上。加 入雜交瘤細胞培養上清液之後，使用與辣根過氧化物酶(HPRO)偶聯的山羊抗小鼠(GAM) 二 抗檢測特異性抗體的結合。為了檢測抗體與毛髮的結合，使用ABST底物，孵育30分鐘後在 405nm處測定吸光度。鑑定出總共73個與毛髮樣品結合的多克隆雜交瘤克隆(C2 1-73) 0 但是，由於包被的是切碎的毛髮，所以選擇與存在於毛髮內部的抗原結合的抗體，以及與毛 發表面上的抗原結合的抗體兩者。為了選擇與貓毛髮特異性結合的抗體，6天之後在人毛髮 上進行相同類型的ELISA。下表中給出的吸光度證明相比於人毛髮，與貓毛髮的優異結合， 這表明在多克隆雜交瘤克隆中產生了貓毛髮特異性抗體。表3 通過ELISA分析多克隆抗貓毛髮的抗體與貓或人的毛髮的結合。如上所述 進行ELISA。孵育30分鐘後測定ABTS的吸光度(未減去背景)。Abs =吸光度。
實施例在下面的部分中，提供了本發明的有用實施方式的例子。其證明通過與犬毛髮選 擇性結合的抗體附著至犬毛皮的含有藥物的微粒如何能夠在延長的時期內保護動物抵抗 有害昆蟲(在本例子中為蜱)而沒有刺激皮膚的副作用。將市售的局部用寄生蟲殺蟲劑製劑施用到動物毛髮的一種常見方法是使用所謂 的「點式」製劑，其中將小體積的含有藥物的溶液鋪展(deployed)至動物的頸部皮膚上，其 具有經常引起對皮膚的嚴重刺激的缺點。抗有害昆蟲的保護時期受到限制，例如在蜱的情況中通常為4周。其它類型的具有分子分散的殺蟎劑的製劑存在同樣的問題。顯示當抗體與微粒的表面偶聯時，保留了抗體的獨特性質——與毛髮發生物種特 異性結合。證明抵抗蜱的效力(殺蟎劑效力>90%)持續至少3至4周。可顯示降至> 70%的效力持續另外4周，這可能是由顆粒的持續釋放特性造成的。同樣描述了將抗體與 微粒表面上的官能團連接的有用方法和對動物毛皮的合適的施用方法。A)含有藥物的微粒的組成及製備顆粒由聚合物製成。由於它們的尺寸介於1-10 μ m，它們在毛皮上不可見。將活性 成分包膠囊(encapsulated)，並通過擴散持續釋放。可以通過顆粒設計(聚合物類型、分子 量、添加劑)在寬範圍內控制釋放。用連接抗體必需的官能團(例如胺或羧基)將顆粒表 面改性。在優選的實施方式中，通過溶劑蒸發技術將顆粒複合(compounded)。因此，活性成 分(在本實施例的情況中為擬除蟲菊酯氯苯氟菊酯(3-[2-氯-2-(4-氯苯基)乙烯基]-2， 2-二甲基環丙烷羧酸氰(4-氟-3-苯氧基苯基)甲酯，CAS Nr. 69770-45-2))和聚合物 (在本例中為聚苯乙烯)溶解於二氯甲烷。將乳化劑(含有與聚苯乙烯相容(混溶)的聚 合物鏈段和用作親水乳化部分(moeity)的羧基基團COOH的共聚物)分散在水中。然後在 Ultra Turrax攪拌器的幫助下將油相分散在水中，用Microfluidizer將混合物勻漿。通過 顯微鏡控制液滴的尺寸。可以將PH設定為鹼性範圍，以便促進乳化。然後將乳液邊攪拌邊 加熱至60°C。在該溫度下蒸發二氯甲烷。乳液變成懸浮液，其中游離COOH提供親水表面。 可以通過粒度儀(mastersizer)控制粒度。通過HPLC分析活性成分的量。在本給定實施 例的情況下，固體聚苯乙烯微粒中氯苯氟菊酯的含量為18%m/m。將這種微粒的製劑編號 定為 7c_6+7_EE。用相同的方式製備加載有螢光染料(在本例中為Uvitex(2，5噻吩二基 (thiophenediyl)雙(5-叔丁基-1，3 苯並噁唑)，CAS No. 7128-64-5，435nm)的微粒。用 染料替換活性成分。這些顆粒的功能是使抗體介導的微粒與毛皮的結合顯現，因為可以容 易地用螢光顯微鏡將它們檢測。在另一個實施方式中，通過浸泡方法加載微粒。向IOml的15%聚苯乙烯微粒分散 體(用表面COOH基團改性)中加入2.4ml含有適量氯苯氟菊酯的二氯甲烷相。然後在環 境室溫下振蕩24小時。然後在減壓(150-50mbar)下蒸發溶劑二氯甲烷。將分散體反覆離 心，並用乙醇/水混合物洗滌沉澱，以去除未包膠囊的和表面結合的氯苯氟菊酯。重新離心 後，將沉澱重新分散於水中並凍幹。編號為BU 163的微粒中含有9% m/m的藥物。B)抗體與微粒表面的連接通過以下方法實現毛髮特異性抗體與藥物遞送顆粒的偶聯通過加入特定量的N-乙基-N』 -(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC ；2mM)將羧 酸根改性顆粒(carboxylate modified particles)活化。然後通過加入N-羥基琥珀醯亞 胺(NHS;5mM)使活化形式穩定。該活化的酯複合物與來自抗體的伯胺和仲胺反應，從而在 顆粒和抗體之間形成共價醯胺鍵合。在微粒類型7c_6+7_EE的情況下，將80ml 2. 18%m/V 溶液與29ml抗體溶液混合，所述抗體溶液中含有69. 6mg抗體混合物(B7. 3/B18-4. 3的比 率=1 1)。用相似的方式使BU 163具備抗體。該方法描述於文獻中(Hermanson, G. T. :Bioconjugate techniques. Academic
13press, San Diego, 1996) 0通過活性成分的光譜檢測給出具備抗體的微粒與犬毛皮特異性結合的證據。將多 孔板部分填充等量(mg)的犬和人的毛髮。孔的底部是孔徑為30-40 μ m的過濾器。然後在 那些含有毛髮的孔中填充含有攜帶抗體的微粒7c_6+7_EE的懸浮液。然後將多孔板離心， 以便通過將上清分散體壓迫通過30-40 μ m孔而去除液體和所有未結合的顆粒。未與毛髮 結合的顆粒因為粒度僅為1-10 μ m而通過過濾器。結合於毛髮上的顆粒保持附著在孔內的 毛髮上。用含有0.05%吐溫20的緩衝液將毛髮洗滌5次。每次洗滌之後，通過離心再次去 除緩衝液。在這之後，向孔中加入乙腈(其溶解藥物，但不溶解毛髮或多孔板的材料)。乙 腈將所有包膠囊的藥物從微顆粒中提取出來。先前通過HPLC證明了活性成分的定量去除。 然後將孔底沒有洞的透明多孔板置於含有毛髮的多孔板下面。其由僅顯示很少UV吸光度 的聚合物製成。將乙腈離心進入透明多孔板的孔中。可以通過268nm處的UV光檢測乙腈 溶液中的活性成分。校準後，UV讀數器能夠檢測存在於孔中的藥物的量，因此間接證明微 粒附著於犬或人的毛髮。與毛髮連接的微粒越多，UV信號越強。這個相關性是線性依賴的 (圖 8)。圖(圖8)證明相當大量的具備抗體的微粒與犬毛髮結合。犬毛髮取自幾個不同 品種(德國牧羊犬、柯利牧羊犬、梗犬(terrier)、狐狸犬(spitz)、雪納瑞-拉布拉多犬混 種、柯利，n = 3)。相反，只有少量的微粒與人毛髮結合(三位不同女性，未處理的未染色的 頭髮，η = 3)，這證明當抗體與微粒表面結合時，保持了抗體的活性毛髮結合結構域的物種 選擇性。還證明抗體與動物毛髮的結合強度足夠強，以經受至少5次緩衝液洗滌循環。儀器=ELISASynergy HT, BioTek ；顯微鏡Biozero BZ-8100E，KeyenceC)作為噴霧製劑，對動物毛皮施用在製劑的一個有用實施方式中，將具備抗體的含有藥物的微粒作為噴霧製劑對動 物毛皮施用。在給出的實施例中，對犬施用6mg包膠囊的氯苯氟菊酯/kg體重。比格犬平均重量 為11kg。由於微粒中藥物濃度為18% m/m，因此對動物施用367mg具備抗體的微粒7c_6+7_ EE (含有66mg氯苯氟菊酯)。取決於顆粒的活性成分濃度和所需的藥物量，這個數值將變 化。對於顆粒BU 163來說，使用733mg，因為藥物含量為9% m/m。將IOOmg螢光顆粒和計 算量的載有藥物的微粒分散於適量的水中。在本實施例情況中，使用30ml水。加入少量表 面活性劑(在本實施例中為0.01%吐溫20)，以促進位劑在有時油膩(fatty)的犬毛髮上 鋪展。將該分散體填充入配備泵式噴霧器頭的普通瓶子中，所述噴霧器頭適合於噴灑顆粒 懸浮液而不阻塞閥門，並且是現成的(ready to use)。在犬毛皮上到處均勻噴灑分散體，允許微粒均勻分布至犬毛髮上。E)體內研究抵抗犬上的蜱(褐犬蜱(Rhipicephalus sanRuineus))的功效本研究的目標是評價兩種不同的噴霧製劑(含有通過抗體與犬毛皮結合的載有 氯苯氟菊酯的微粒)對經褐犬蜱(Rhipicephalus sanguineus)實驗性侵擾的犬的抗蜱功 效(表4)。本研究中使用9隻犬，每組三隻犬，共三組。在整個研究時期，將每隻犬圈養於單 獨的籠子中。
在研究日(SD)-1，肌內注射大約0. lml/kg BW鹽酸氯胺酮 (Ketaminhydrochlorid) (Ketamin 10 % )與大約 0. lml/kg BW 鹽酸賽拉嗪 (Xylazinhydrochlorid) (Xylazin 2% )的組合，使所有的犬鎮靜。在鎮靜過程中所有犬 以胸骨或側面斜躺在地板上，將50隻褐犬蜱(Rhipic印halussanguineus) (25早，25 $ )釋 放到犬的背上。犬睡覺1至1. 5小時，從而防止在蜱能夠附著之前將其除掉。在SD 0，通過對全身表面的充分adspection/觸診來測定蜱侵擾率(但不去除 蜱)頭、耳、頸、側區(lateral areas)、肩胛骨至尾基(base of tail)的背部長條(dorsal strip)、尾和肛門區域、前腿和肩部、後腿、胸至後腿內側的腹部區域、腳。對所有活的附著 的雌性蜱進行計數，基於蜱的數目，將犬隨機分配為三個研究組。蜱計數後第O天進行處理。對照組的犬不進行處理，用作陰性對照組。對兩個處 理組的犬劑量給予IVP (Investigational Veterinary Product) —次。每個IVP體積為 30ml，含有66mg的氯苯氟菊酯作為活性成分。與體重無關，每隻犬均接受總共30ml的量。 在犬站立條件下，將IVP均勻噴灑至每隻犬的全身。表4 用於體內實驗的微顆粒製劑綜述以及關於劑量的信息 n. a.不適用在進行處理的當天(研究日SD 0)，在處理之後2小時和4小時觀察犬的不良事 件(adverse events) 0所有的犬均對處理良好耐受。在SD 2，按照與SD O相同的方式對 蜱進行計數，但是將蜱去除。將蜱鑑定為自由的或附著的、充血的(engorged)或非充血的 (unengorged)、活的或死的蜱。在有規律的間隔內，以相同的方式對每隻犬進行重新侵擾， 48小時後按所述方式進行蜱的計數。所選的間隔為處理後1、3、7和9個周，例如在SD 5、 20、48、和61進行蜱的侵擾，兩天之後在SD 7,22,50和63進行蜱的計數。除了每個蜱計數日(侵擾後48小時)之外，以有規律的間隔獲取每隻犬的IOOmg 毛髮。從犬的全身獲取毛皮樣品肩、背、從尾部開始處、臀部，並通過螢光顯微鏡進行調查。 在施用製劑之後第2、7、14、42和63天獲取毛髮樣品。在蜱計數程序的過程中對所有的犬進行詳細的一般健康情況觀察。特別注意皮膚 刺激。在整個研究過程中沒有觀察到由於處理導致的皮膚刺激。蜱計數用於評價IVP的功效。用按照指南EMEA/CVMP/005/00-Final中描述的推 薦用於控制測試的修改的Abbott公式來計算百分比功效 Nl =用IVP處理的組的幾何平均蜱計數
N2 =對照組的幾何平均蜱計數「蜱計數」定義為「代表處理失敗的蜱」。在測定治療功效的情況下(SD 2)，只有活 蜱被認為是處理失敗，而在測定預防功效的情況下(其餘所有的計數時間點)，活蜱和死的 充血的蜱被認為是處理失敗。如果在處理和每周重新侵擾48小時之後功效達到> 90%，則認為活性成分是高 度有效的。應該經3-4周時期給出功效。表5 計算的功效] 實現了在3-4周時期中顯示超過90%的功效的最低目標(表5)。鑑於顆粒中氯 苯氟菊酯的高濃度，這種施用形式顯然保護動物免受皮膚刺激。處理後(post treatment) 50天以後，降低的功效仍然是顯著的。彡50天的研究 期以後從微粒釋放的氯苯氟菊酯可能不足以在動物皮膚上保持活性水平的氯苯氟菊酯。試 驗的最初幾周期間的更好保護可能是由於某一部分的游離氯苯氟菊酯和早期來自顆粒的 較高擴散率(由於基質內高濃度的氯苯氟菊酯)造成的。通過螢光成像，可以檢測持久附著於犬毛皮的微粒。可顯示，微粒通過抗體結合在 整個實驗期中保持附著於毛髮(圖9至13)。注意，螢光染料標記的顆粒僅用作指示劑，其 僅代表製劑中微粒總數目的20%。隨著時間推移，能夠檢測到的顆粒減少，部分原因是它們 掉落下來，部分原因是螢光染料由於持續暴露於陽光而被漂白。F)得自實施例的結論所描述的實施例證明了本發明的一個非常有用的實施方式適合於長時間內控制 藥物釋放的含有藥物的微粒裝置，其中抗體與動物毛髮(在本例中為犬的毛髮)特異性結 合。本發明的此項應用有多個優點——其允許將寄生蟲殺蟲劑靶向特定的哺乳動物物種，因此當施用製劑時或者當 不同的物種相互作用時(例如玩耍或舔)，顯著降低交叉施用或藥物轉移至例如人或其它 哺乳動物物種的危險。——其允許將藥物引導至動物毛皮，因此避免與皮膚大量接觸，這降低了皮膚刺 激或嚴重皮膚損傷的可能性。——將單一物種特異性抗體通過C00H、NH2或其它基團與不同微粒表面連接並將 微粒鋪展至毛皮，該一般性原則允許為單一製劑選擇各種不同的微粒類型(包含具有不同 釋放概況的不同藥物的不同聚合物)。其允許在分散體中組合不同類型的微粒，因此將在其 它形式上可能化學不相容的藥物組合在單一製劑中。——合適微粒與適當藥物釋放概況的使用允許將藥物功效延長至幾周或幾個月 (取決於顆粒和藥物類型)，因此提供了將常見的局部施用液體殺蟲劑和其它藥物製劑的 功效期顯著延長的可能性。
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——微粒附著於動物毛髮的強度足以克服與水的充分接觸甚至是溫和洗滌，例如 當動物在下雨天氣下閒逛或在池塘中遊泳一段時間。在這種情況下，常規製劑通常需要重 新施用。
權利要求
與動物的毛髮表面選擇性結合的抗體。
2.根據權利要求1所述的抗體，其選自多克隆抗體、單克隆抗體或重組抗體，例如全 長抗體、二聚體分泌性IgA、多聚體IgM及其片段，例如F (ab』)2片段、Fab片段、Fv片段、 單鏈Fv抗體(scFv)、雙特異性scFv、雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、單結構域抗體(dAb)、 minobody或分子識別單元(MRU)。
3.根據權利要求2所述的抗體，其源自雜交瘤細胞；合成的、半合成的、原態的和免疫 活性的噬菌體庫或核糖體展示庫，或通過產生全合成設計抗體。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的抗體，其與一種動物物種的毛髮選擇性結合。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的抗體，其與犬、貓、牛、綿羊、山羊、駱駝、羊駝和/ 或馬的毛髮選擇性結合。
6.藥物遞送系統，其包含權利要求1-5中任一項所述的抗體。
7.藥物遞送系統，其包含權利要求1-6所述的抗體，所述抗體另外結合或附著於固體 顆粒的表面，因此使這些顆粒與動物毛髮選擇性結合。
8.根據權利要求7所述的藥物遞送系統，其按如下方式包含與動物毛髮選擇性結合的 抗體的製劑和含有活性成分的顆粒在第一步中抗體與動物毛髮選擇性結合，在第二步中 顆粒與偶聯於動物毛髮的抗體結合。
9.根據權利要求7所述的藥物遞送系統，其按如下方式包含與合適的間隔體/介質/ 中間偶聯劑連接或化學結合的動物毛髮結合性抗體的製劑和顆粒在第一步中攜帶抗體的 間隔體/介質/偶聯劑通過所述抗體與動物毛髮選擇性結合，在第二步中顆粒通過與所述 間隔體/介質/偶聯劑結合而連接於動物毛髮。
10.根據權利要求7-9中任一項所述的藥物遞送系統，其中顆粒含有以下物質對動物 有益的活性成分或藥劑，即藥物；殺蟲劑；毛髮或皮膚護理劑；保護經處理的動物免受有害 害蟲動物例如昆蟲侵襲的驅除劑；氣味改變劑；或改變經處理的動物或其它未經處理的但 與施加處理的動物相互作用的個體動物的行為的藥劑。
11.根據權利要求4-10中任一項所述的藥物遞送系統，其中顆粒含有對動物有益的活 性成分或藥劑，其濃度適合於它的治療或有益目的，即0. 01% -99. 9%。
12.根據權利要求4-11中任一項所述的藥物遞送系統，其中顆粒的直徑為0.001 μ m至 10 μ m, itizfe^J 0. 1 μ m 2 μ m。
13.權利要求4-12中任一項所述的藥物遞送系統，其中微粒含有擬除蟲菊酯類型的藥 物，將所述顆粒施用於動物毛皮並且經延長的時期遞送擬除蟲菊酯而不引起副作用，即皮 膚刺激。
全文摘要
本發明提供了與動物毛髮選擇性結合的抗體和其中可將特定製劑引導至動物毛髮的基於抗體的藥物遞送系統。這是由以下需求驅動的增加動物的外寄生物治療的有效治療時期、降低這些藥物的毒性並改進其釋放概況。
文檔編號C07K16/18GK101910198SQ200880124208
公開日2010年12月8日 申請日期2008年10月29日 優先權日2007年11月2日
發明者H·欣克爾, H-J·哈曼, R·費希爾, S·O·沃格爾, S·希爾伯格, S·霍夫曼 申請人:拜耳先靈製藥股份公司