S100a16基因在製備治療肥胖症藥物中的應用的製作方法

2023-08-10 08:41:26

專利名稱：S100a16基因在製備治療肥胖症藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及S100A16基因在製備治療肥胖症藥物中的應用。
背景技術：
神經組織蛋白SlOO家族是一類廣泛分布於不同組織的EF-hand型酸性可溶性鈣 結合蛋白，其中S即soluble，100表示該蛋白在飽和硫酸氨中的溶解度為100%，SlOO蛋白 含2個與鈣親和力不同的EF螺旋結構，C-末端EF螺旋結構由12個胺基酸組成典型的Ca2+ 結合環，N-末端EF螺旋結構包含14個具有SlOO蛋白特異性的胺基酸。人SlOO蛋白的基因在染色體lq21區，腫瘤在此區的基因常頻繁重組，易引起SlOO 基因表達失控，因此，腫瘤晚期和發生腫瘤轉移時有SlOO異常表達，特別是神經外胚層起 源的腫瘤組織中有異常表達，且與腫瘤分期和預後有相關性。Sioo蛋白在哺乳動物分布有 特異性S100A1主要在神經細胞，骨骼肌細胞，心肌細胞和腎細胞的胞漿；S100A2在肺和腎 細胞的胞漿和核中；S100A3和S100A5的分布尚不明確；S100A4在成纖維細胞，肌上皮細胞 和腫瘤細胞胞漿和胞外液中；S100A12分布與海馬細胞；S100A13在甲狀腺細胞最豐富，特 別是核周區；S100A16分布廣泛，見於多種腫瘤組織。研究顯示SlOO蛋白可通過調節鈣離子及糖基化受體RAGE參與細胞的增生、分化、 遷移凋亡及認知[1]。如整個SlOO家族對神經軸突的生長起調節作用[2]，而S100A7，S100A 13，S100A 14等在腫瘤中差異表達，已被用做腫瘤診斷與預後的標誌基因[3』4]。S100A16基因是我們應用全基因組微陣列晶片技術，篩查代謝性疾病相關基因的 研究中獲得的差異表達新基因，是鈣調蛋白SlOO家族的新成員，除了具有SlOO家族的基 本結構特徵，如是一類較小的Ca2+、Zn2+結合蛋白，含2個與鈣親和力不同的EF螺旋結構， C-末端EF螺旋結構由12個胺基酸組成典型的Ca2+結合環，尚具有以下特異性1、不同於傳統的SlOO蛋白的EF端由14個胺基酸組成，S100A16蛋白的EF端由 15個胺基酸組成loop環；2、在EF端最後位置缺少穀氨酸鹽殘基，這對於協調鈣的位點是非常重要的；所以 提示S100A16基因存在更複雜的調節機制。SlOO家族在細胞的增生、分化、遷移與凋亡，神經軸突的生長與認知形成及腫瘤發 生發展中均發揮著重要角色。關於其新成員S100A16基因與疾病發生發展的研究，由於研 究尚淺，目前尚無明確定論。我們研究小組於2005年起即以其為靶標開展系列研究，初步 闡明了其在代謝性疾病的發生發展中發揮的作用。申請人:早先的研究表明S100A16 mRNA在正常食道、脂肪及結腸組織中高表達，有 研究表明S100A16也高表達在膀胱、肺、甲狀腺、胰腺及卵巢腫瘤中[5]，提示其生物學功能 的多樣性。最新研究表明[1]，細胞內Ca2+濃度可有效調節S100A16蛋白的入核出核信號， 細胞內Ca2+濃度增高，S100A16蛋白主要分布在胞漿，而隨細胞內Ca2+濃度減低，S100A16 蛋白的的核轉運增強並在核中大量積累，並與核仁緊密相關，提示S100A16蛋白在核糖核 蛋白複合體多相過程、基因沉默或細胞分裂中可能起作用。S100A16鈣依賴的異位可能受
3最近描述[6』7]的核漿網狀調節，在核附近終止，負責游離鈣釋放到局部固定的亞核位置。與 SlOO家族其他成員一樣，S100A16缺乏明顯的入核信號肽，其入核可能與S100A11類似，需 要與轉運蛋白反應[6]或者像鈣銅調節那樣可能通過選擇性的促進傳播路徑發生[7]。這些 結果提示S100A16基因在特定的一些組織中，在鈣信號通路調控或其他尚未鑑定的通路調 控下，發揮著重要的生物學功能。但是S100A16在核周的作用及SlOOAie-Ca2+依賴的原因 及功能意義，是否與脂肪細胞分化及胰島素分泌有關需進一步闡明，目前國內外未見報導。相關研究已經表明脂肪合成過程受一系列複雜的轉錄因子調節如C/EBP、PPAR及 ADD/SREBP-lc等的調節[8』9]。脂肪細胞分化的過程受一系列外界因素及細胞內信號傳導 的影響[1°]。目前部分研究表明細胞內鈣離子濃度對於脂肪細胞分化起重要作用，這一過 程比較複雜，細胞內鈣離子濃度的升高，在3T3-L1細胞分化早期可抑制脂肪細胞的合成， 但在分化後期卻又增加脂肪細胞分化成熟的標誌基因的表達[11]。S100A16是否可以通 過Ca2+調節、PPAR γ及C/ΕΒΡα信號通路影響脂肪細胞的分化，S100A16在核周的作用及 SlOOAie-Ca2+依賴的原因及功能意義，是否與脂肪細胞分化進而導致肥胖有關需進一步闡 明，目前國內外未見報導。本專利申請首次證明S100A16對脂肪合成的促進作用，進而促進脂肪的合成，從 而證明S100A16治療肥胖症具有應用價值。參考文獻1.Emmanuel Sturchler, Jos A. Cox, Isabelle Durussel, Mirjam ffeibel, Claus W. Heizmann. S100A16,a Novel Calcium-binding Protein of the EF-hand Superfamily. J Biol Chem. 2006 ；281(50) :38905_38917.2. Huttunen, H. J. , Ku ja-Panula, J. , Sorci, G. , Agneletti, A. L. , Donato, R. , and Rauvala, H. Coregulation of neurite outgrowth and cell survival by amphoterin and SlOOproteins through receptor for advanced glycation end products(RAGE) activation. J Biol Chem. 2000 ；275 (51) 40096-400105.3. Marenholz I, Heizmann Cff. S100A16, a ubiquitously expressed EF-hand protein which is up-regulated in tumors. Biochem Biophys Res Commun. 2004 ；313 237-244.4. Denis A. Smirnov, Daniel R. Zweitzig, Bradley W. Foulk, M. Craig Miller, Gerald V. Doyle,Kenneth J. Pienta,Neal J. Meropol,Louis M. ffeiner, Steven J. Cohen, Jose G. Moreno, Mark C. Connelly, Leon W. M. M. Terstappen, and S. Mark 0' Hara. Global Gene Expression Profiling ofCirculating Tumor Cells. Cancer Res.2005 ；65 (12) 4993-4997.5. Yao R, Lopez-Beltran A, Maclennan GT, Montironi R, Eble JN, Cheng L.Expression of SlOO protein family members in the pathogenesis of bladder tumors. Anticancer Res. 2007 ；27(5A) :3051-3058.6. Sakaguchi, Μ. , Miyazaki, Μ. , Takaishi, Μ. , Sakaguchi, Y. , Makino, Ε., Kataoka, N. , Yamada, H. , Namba, Μ. , and Huh, N. H. S100C/A11 is a key mediator ofCa2+-induced growth inhibition of human epidermal keratinocytes. J Cell Biol. 2003 ； 163 (4) 825-835.
7.Thorogate, R. , and Torok, K.Ca2+-dependent and-independent mechanisms of calmodulin nuclear translocation. J. Cell Sci. 2004 ；117 5923-5936.8. Fajas, L. , Fruchart, J. C. , and Auwerx, J. Transcriptional control of adipogenesis. Current opinion in cell biology. 1998 ； 10 (2) :165_1739. Rosen, E. D. , and Spiegelman, B. M. Molecular regulation of adipogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 2000 ；16 145-171.10. MacDougald OA, Mandrup S. Adipogenesis :forces that tip the scales. Trends Endocrinol Metab. 2002，13(1) :5_11.11. Shi H, Halvorsen YD, Ellis PN, Wilkison WO, Zemel MB. Role of intracellular calcium in human adipocyte differentiation. Physiol Genomics. 2000,3(2) :75_82.

發明內容
技術目的本發明的一個目的是提供S100A16基因製備治療肥胖症藥物中的應用。技術方案S100A16基因在製備治療肥胖症藥物中的應用，通過如下技術方案得到證實一、在細胞水平採用小鼠前脂肪細胞3T3-L1證實S100A16在肥胖中的作用。二、在動物水平採用飲食誘導的肥胖鼠及轉基因證實S100A16在肥胖中的作用。其中S100A16基因的核苷酸序列為Seq NO. 1有益效果1、相關研究已經表明脂肪合成過程受一系列複雜的轉錄因子調節，如C/EBP、 PPAR-gama及ADD/SREBP-lc等的調節。我們的研究結果提示S100A16可能是一個新穎的脂 肪合成促進因子，通過上述轉錄因子調節發揮促進脂肪合成的作用。我們最近的大規模酵 母雙雜交結果顯示，它可與S100A14及熱休克蛋白相互作用。已知S100B、S100A2及S100A4 可與一系列細胞內蛋白作用，尤其是P53，一個腫瘤抑制蛋白同樣也是一個脂肪合成負性調 節因子。S100A4、S100A2通過P53阻斷細胞周期，在脂肪細胞分化過程中阻斷PPAR-gama 腺體的產生進而阻斷脂肪的生成。而S100B作用正好相反，增強P53的作用。S100A16與 S100A4 一樣由3個外顯子組成共同調節一個轉錄單元，S100A16潛在的組織特異性的表達 在不同的轉錄體類似於S100A4。因此，我們通過免疫共沉澱方法證實了 S100A16與S100A4具有相同的作用抑制 P53從而減少P53對脂肪合成的抑制作用，進而促進脂肪的合成，從而證明S100A16治療肥
胖症具有應用價值。本研究結果首次揭示了 S100A16在肥胖及中的作用，作為新的藥物靶點，S100A16 基因在製備治療肥胖胰島素抵抗相關藥物的應用中，包括通過S100A16基因上下遊靶點制 備肥胖相關藥物中申請專利保護。


圖1顯示S100A16蛋白在前脂肪細胞分化過程中的表達及其對細胞增生的影響；
圖IA顯示3T3-L1細胞誘導分化後0，2，4，6，8，10天收集蛋白，採用Western blot 方法測定S100A16蛋白在細胞分化過程中的表達，結果發現S100A16隨著分化過程表達升 高，α-tubulin作為對照；圖IB顯示Western blot分析驗證S100A16高表達及幹擾質粒轉染的效果；Lane 1 正常 3T3-L1 細胞；lane 2 空載體 pcDNA3. 1 質粒；lane 3 :pcDNA3. 1-S100A16-3T3-L1 ； lane 4:shRNA 陰性對 M ； lane 5 :3T3-Ll-S100A16-shRNA_l ； lane 6 3T3-Ll-S100A16-shRNAl-2 ；圖IA及圖IB數據來源於三組獨立試驗；圖IC是對圖IA蛋白表達進行定量分析獲得S100A16表達的灰度分析圖；圖ID是對圖IB蛋白表達進行定量分析獲得S100A16表達的灰度分析圖；圖IE顯示過表達S100A16對細胞增生的影響；圖IF顯示幹擾S100A16對細胞增生的影響；圖IE以及圖IF的結果以均數士標準差的形式表示；< 0. 01或*P < 0. 05與 對照3T3-L1比較；圖2顯示S100A16表達對3T3-L1前脂肪細胞分化功能的影響；其中圖2A顯示3T3-L1細胞轉染S100A16高表達及幹擾質粒後誘導分化，採用油 紅染色觀察脂滴的形成情況，結果發現S100A16高表達可促進3T3-L1細胞分化過程中脂滴 的形成，S100A16幹擾可抑制脂滴的形成；(放大係數200 X (LycraUSA))；圖2B顯示S100A16對三酸甘油酯(TG)形成的影響，結果表明S100A16高表達可 明顯增加對三酸甘油酯(TG)形成的影響；採用分光光度計在波長510nm處測定吸收值計算 TG含量，結果以均數士標準差的形式表示(η = 3)，< 0. 01與相應的對照組比較；圖2C顯示S100A16對3T3-L1細胞分化過程中相關標誌基因的影響；提取3T3-L1 細胞分化不同天數蛋白採用western blot方法檢測標誌基因表達情況，結果提示S100A16 高表達可上調1印tin、adiponectin、aP2的表達；S100A16幹擾後可下調上述基因的表達；圖2D顯示S100A16對3T3-L1細胞分化過程中相關標誌基因的影響，提取3T3-L1 細胞分化不同天數的蛋白採用western blot方法檢測標誌基因表達情況，結果提示 S100A16幹擾可上調ppar-gama，C/EBP-a的表達；S100A16幹擾後可下調上述基因的表達；圖3顯示S100A16對P53蛋白的抑制作用；圖3A顯示3T3-L1、S100A16過表達及S100A16幹擾細胞鋪板48h後收集細胞提取 蛋白，採用免疫共沉澱方法一抗用P53抗體，檢測S100A16是否通過與P53結合發揮其生物 學功能；結果顯示S100A16過表達明顯抑制P53蛋白的作用，S100A16幹擾可促進P53蛋白 作用；圖3B顯示3T3-L1，S100A16過表達及S100A16幹擾細胞鋪板48h後收集細胞提 取蛋白，western blot方法檢測S100A16表達水平，結果顯示與親本細胞3T3-L1相比較， S100A16過表達細胞株S100A16蛋白高表達，S100A16幹擾細胞株中S100A16表達下調，說 明實驗中成功構建了 S100A16過表達及S100A16幹擾細胞株；圖3C顯示3T3-L1、S100A16過表達及S100A16幹擾細胞鋪12孔板，18h後轉染 p53-luCiferase質粒，72h後檢測螢光強度，結果顯示與親本細胞3T3-L1相比較，S100A16 過表達細胞株中螢光量降低，而S100A16幹擾細胞株中螢光值上調，說明在S100A16過表達細胞株中，S100A16與p53結合降低其活性，而在S100A16幹擾細胞株中，釋放p53，導致其 活性上調；圖4顯示S100A16在正常及飲食誘導的肥胖及ob/ob鼠脂肪組織中的表達，從16 周大小的C57BL/6J野生鼠及12周大小的高脂飲食餵養的肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪組織提取 蛋白，採用Western blot方法分析S100A16在上述三種組織的表達，結果提示S100A16在 高脂飲食餵養的肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪組織中高表達。α -tubulin作為對照。
具體實施例方式實施例1本實施例中參考實驗指南第三冊(第15章在大腸桿菌中表達克隆化基因；第16 章哺乳動物培養細胞中導入克隆化基因；附錄1分子克隆中使用的緩衝液和試劑的配製； 附錄8分子克隆中的常用技術)，現代實用細胞與分子生物學實驗技術(第一章細胞培養方 法；第八章細胞形態與細胞化學定量分析技術)。一、在細胞水平採用小鼠前脂肪細胞3T3-L1證實S100A16在肥胖胰島素抵抗中的作用。①構建S100A16過表達及RNA幹擾慢病毒質粒轉染3T3-L1細胞，進行三聯刺激誘 導分化，通過油紅染色及TG測定觀察S100A16對3T3-L1細胞分化過程中脂滴形成的影響。②採用Real time PCR及Western blot檢測上述細胞分化過程中L印tin， Adiponectin, LPL, PPAR-gamma等標誌基因的變化，探討S100A16對3T3-L1細胞分化過程 中標誌基因的影響。具體方法如下1、採用經典的3T3-L1細胞誘導分化模型研究S100A16對3T3-L1細胞分化功能的 影響3T3-L1細胞(正常及S100A16過表達及RNA幹擾轉染後)培養在DMEM培養液中 (10%胎牛血清)，5% C02、37°C培養箱。當細胞生長至完全融合後兩天(dayO)加入0. 5mM 3-isobutyl-l-methyxan-thine (MIX), lug/ml 胰島素及 IuM 地塞米松(Sigma, USA)誘導分 化。48h後(day2)換用僅含lug/ml胰島素的完全培養基，以後每兩天換液直到第八天細胞 完全分化成熟。提取分化不同天數的細胞RNA及蛋白用於相關指標檢測。結果發現S100A16隨著分化過程表達升高，在細胞分化到第四天S100A16的表達 已經為未分化的2倍，到了分化後期第10天為5倍，說明S100A16明顯促進3T3-L1前脂肪 細胞的分化。其中圖1中所示(1A)3T3-L1細胞誘導分化後0，2，4，6，8，10天收集蛋白，採 用Western blot方法測定S100A16蛋白在細胞分化過程中的表達，結果發現S100A16隨著 分化過程表達升高，提示S100A16可能是肥胖相關的新的標誌基因。α -tubulin作為對照。 (IB)Western blot分析驗證S100A16高表達及幹擾質粒轉染效果。.Lane 1:正常3T3-L1 細胞；lane 2 空載體 pcDNA3. 1 質粒；lane 3 :pcDNA3. 1-S100A16-3T3-L1 ； lane 4 :shRNA 陰性對照；lane5 及 lane 6，3T3-Ll-S100A16-shRNA_l 及 3T3-Ll-S100A16-shRNAl_2 ； (1C & 1D)對(A & B)蛋白表達進行定量分析獲得S100A16表達的灰度分析圖(數據來源於三組 獨立試驗)。2、採用油紅染色及TG含量的測定觀察S100A16對3T3-L1細胞分化功能的影響
對不同分化時間的細胞進行油紅染色，即細胞經10%緩衝福馬林(pH 7. 4)固 定30min後，用DPBS洗滌三次，加入60%異丙醇與油紅0染料應用液孵育5min，吸棄液體 用自來水衝洗乾淨，倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況；採用TG測定試劑盒通過分光光度計 測定OD值(510nM)定量分析TG的含量。結果顯示S100A16高表達可促進3T3-L1細胞分化過程中脂滴的形成；S100A16 高表達可明顯增加三酸甘油酯(TG)形成的影響；脂肪合成受一系列轉錄調節因子的影 響，包括C/ΕΒΡα，C/EBP β , C/EBP δ , PPARy等，S100A16過表達明顯促進脂滴的形成 提示S100A16可促進脂肪合成，但是如何促進脂肪合成的需要做進一步研究。附圖2中 (2A)3T3-L1細胞轉染S100A16高表達及幹擾質粒後誘導分化，採用油紅染色觀察脂滴形成 情況。結果發現S100A16高表達可促進3T3-L1細胞分化過程中脂滴的形成，S100A16幹擾 可抑制脂滴的形成。(放大係數200 X (Lycra USA))。(2B) S100A16對三酸甘油酯(TG)形 成的影響，結果發現S100A16高表達可明顯增加三酸甘油酯(TG)形成的影響。採用分光 光度計在波長510nm處測定吸收值計算TG含量。結果以均數士標準差表示(η = 3)，**Ρ < 0.01與相應的對照組比較。3、採用細胞增殖實驗觀察S100A16對3T3-L1細胞增殖的影響採用WST-I assay kit (Roche)進行細胞增殖實驗。將細胞鋪在96孔板中(細胞 密度為IX IO3/孔)在5% CO2 37°C孵箱分別孵育12，24，36，48，60，72小時後，加入10 μ 1 WST-I mixture輕輕混合，再放置孵箱孵育4小時，在450nm波長處測定吸收值。S100A16表達升高後明顯促進3T3-L1細胞的增生，培養24小時後細胞增長數已經 為開始的1.4倍，培養72小時後細胞增長數已經為開始的近1.7倍。相反，S100A16表達 幹擾後明顯抑制3T3-L1細胞的增生，培養24小時後細胞增長已經開始被抑制，培養72小 時後細胞增長數已經抑制近80%。如附圖1中(IE &1F)S100A16對細胞增生的影響。結果 以均數士標準差表示。< 0. 01或*P < 0. 05與對照3T3-L1比較。4、採用Real-time PCR及Western Blot檢測相關指標以評價S100A16對脂肪細 胞分化、胰島素抵抗功能的影響。根據說明書提取細胞與組織的RNA，紫外分光光度計進行RNA定量及純度分析後， 反轉錄cDNA為模板，以相關肥胖及胰島素抵抗標誌基因為引物，擴增PCR產物，檢測PPAR γ 及 C/EBP α、Adiponectin、LPL, FAS, aP2, Pref-I、Resistin、Leptin 等糖脂代謝基因的變 化。同樣根據說明書提取細胞與組織的蛋白，測定濃度，用相關抗體檢測目的蛋白的表達。結果如附圖2中(2C & 2D)S100A16對3T3-L1細胞分化過程中相關標誌基因的影 響。提取3T3-L1細胞分化不同天數蛋白採用western blot方法檢測標誌基因表達情況，結 果提示 S100A16 高表達可上調 adiponectin, leptin, aP2, ^ ppar-gama, C/EBP-a 的表達。5、採用免疫共沉澱方法觀察S100A16蛋白與P53蛋白相互作用3T3-L1，空載及S100A16過表達細胞分別種IOcm板，48h後收集細胞，加入200ul 細胞裂解緩衝液(含蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30min，12000rpm，4°C離心，取上清，加入 S100A16抗體(1 500)，4°C緩慢搖晃孵育過夜。取10 μ 1 protein A瓊脂糖珠預處理，將 預處理過的protein A瓊脂糖珠加入到上述和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4°C緩慢搖 晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。免疫沉澱反應後，在4°C以3，OOOrpm速 度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用Iml裂解緩衝液洗3_4次；最後加入15μ1的2XSDS上樣緩衝液，沸水煮5分鐘，用western blot檢測，一抗用 P53抗體(1 500)，檢測S100A16是否通過與P53結合發揮其生物學功能。同時可用P53 抗體進行免疫共沉澱，用S100A16抗體進行Western blot檢測，反過來進一步證明兩者的 相互作用。結果顯示如附圖3中A. 3T3-L1，S100A16過表達及S100A16幹擾細胞鋪板48h後收集細胞 提取蛋白，採用免疫共沉澱方法一抗用P53抗體，檢測S100A16是否通過與P53結合發揮其 生物學功能。結果顯示S100A16過表達明顯抑制P53蛋白的作用，S100A16幹擾可促進P53
蛋白作用。如附圖3中B. 3T3-L1，S100A16過表達及S100A16幹擾細胞鋪板48h後收集細胞 提取蛋白，western blot方法檢測S100A16表達水平。結果顯示與親本細胞3T3-L1相比 較，S100A16過表達細胞株S100A16蛋白高表達，S100A16幹擾細胞株中S100A16表達下調， 說明實驗中成功構建了 S100A16過表達及S100A16幹擾細胞株。如附圖3中C. 3T3-L1，S100A16過表達及S100A16幹擾細胞鋪12孔板，18h後轉染 p53-luciferase質粒，72h後檢測螢光強度。結果顯示與親本細胞3T3-L1相比較，S100A16 過表達細胞株中螢光量降低，而S100A16幹擾細胞株中螢光值上調，說明在S100A16過表達 細胞株中，S100A16與p53結合降低其活性，而在S100A16幹擾細胞株中，釋放p53，導致其
活性上調。二、在動物水平採用飲食誘導的肥胖鼠及轉基因證實S100A16在肥胖胰島素抵抗 中的作用。飲食誘導肥胖鼠模型的建立雄性SD大鼠30隻(購自江蘇省實驗動物中心)，分 籠飼養，1隻/籠，體重90 120克。飼以基礎飼料、自由攝水進食物，環境溫度21°C -23°C，大 鼠適應環境一周後，稱量體重，分為兩組，一組繼續餵養基礎飼料，另外一組(diet-induced obesity ；DI0)改餵高脂飼料(實驗動物飼料購置南京協同動物飼料公司。飼料配方基礎 飼料營養成分配比，碳水化合物65%，脂肪20%，蛋白質15% ；高脂飼料營養配比，碳水化 合物20%，脂肪60%，蛋白質20%)，每天記錄體重、體長及尾長，兩周後高脂組的體重明顯 增加，繼續餵養六周。處死前禁食12小時，腹腔注射1 %戊巴比妥鈉麻醉，稱體重，打開心臟 取血5-10毫升，分離血清，-70°C凍存備用，同時稱內臟脂肪重量，取內脂、皮脂、骨骼肌、腦 等組織-70°C凍存備用。ob/ob鼠模型購自南京大學模式動物中心，常規飼養，處死後取脂 肪組織提取蛋白檢測S100A16基因的表達。分離高脂飼料餵養的小鼠及正常對照鼠的脂肪組織，檢測S100A16在上述組織中 的表達，併購買1印tin受體缺陷的自發性肥胖模型鼠ob/ob檢測S100A16基因在ob/ob鼠 脂肪組織中的表達。結果如附圖4中從16周大小的C57BL/6J野生鼠及12周大小的高脂飲食餵養的 肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪組織提取蛋白，採用Western blot方法分析S100A16在上述三種 組織的表達，結果提示S100A16在高脂飲食餵養的肥胖鼠及ob/ob鼠脂肪組織中高表達。 α -tubulin作為對照。上述具體實施方式
不以任何形式限制本發明的技術方案，凡是採用等同替換或等 效變換的方式所獲得的技術方案均落在本發明的保護範圍。
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權利要求
S100A16基因在製備治療肥胖症藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及S100A16基因及其相關通路在代謝性疾病藥物研發中的應用，提供與肥胖相關的一個新基因，為肥胖的分子機制研究提供基礎，通過細胞及動物模型的構建首次揭示S100A16在肥胖中的重要作用，通過S100A16相互作用蛋白及信號通路上下遊基因的研究，為肥胖症新藥的研發提供理論基礎及可行性依據可用於作為新的藥物靶點。
文檔編號A61P3/04GK101890172SQ201010218759
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月2日 優先權日2010年7月2日
發明者劉雲 申請人:劉雲