固定化酶的製造方法

2023-08-10 12:50:41 2

專利名稱：固定化酶的製造方法
技術領域：
本發明涉及製造固定化酶的方法。
背景技術：
甘油和脂肪酸作為原料進行酯化反應時，為了有效地使用酶，而使用在無機或 有機的載體上固定有脂質分解酶的固定化酶。然而，隨著該固定化酶在反應中的長期 使用，其活性降低，因此必須其活性降低到某一程度的時侯進行回收，更換新的固定化酶。作為對回收的已用過的固定化酶進行有效利用的方法，有通過用鹼完全除去附 著在固定化酶上的蛋白質等，並重複利用載體的方法(專利文獻1)。另外，有通過使 用溶劑或溶劑和磷脂來對酯交換反應和酯轉移反應中已使用的活性降低的固定化脂肪酶 進行溼潤處理，控制參與反應的水分，從而使殘留的脂肪酶重新活化的方法(專利文獻 2)。但是，上述現有技術中，使用鹼除去酶的方法限定了固定化載體，不能應用在 使用其它固定化載體的酶中。另外，使用溶劑或溶劑和磷脂對活性降低的固定化酶進行溼潤處理的方法，其 並不是使因部分脂肪酶的脫附而造成活性降低的固定化酶再生的方法，終歸只是再活化 殘留的脂肪酶的方法。專利文獻專利文獻1 日本特開平1-187086號公報專利文獻2:日本特開平9-56379號公報

發明內容
本發明提供一種固定化脂質分解酶的製造方法，將酯化反應中使用過的固定化 脂質分解酶和溶劑混合，進行洗淨使得相對於100質量份的固定化載體，固定化脂質分 解酶中的油分殘留量為50質量份以下，接著，使其接觸鹼溶液，然後回收固定化載體， 使脂質分解酶吸附在該固定化載體上。
具體實施例方式本發明涉及提供 製造固定化脂質分解酶的方法，有效利用已在酯化反應中使用 過的固定化酶的固定化載體，製造與使用前具有相同性能的固定化脂質分解酶。這裡，已明確在使用固定化脂質分解酶來製造甘油二酯(以下，記為「DAG」) 的情況下，使用由上述現有技術再生的固定化酶的話，含DAG油脂的DAG純度降低。 因此，本發明人對於DAG純度降低的原因進行了各種研究討論，發現原因在於，在再生 的固定化酶中殘留有活性已降低的酶。具體而言，是因為即使脂質分解活性降低，轉移 活性也仍有殘留，因此經過從1，3-DAG向1，2-DAG的重排，生成甘油三酯(以下，記為「TAG」)，降低了 DAG的純度。本發明人進一步研究討論發現如果用溶劑洗淨固 定化酶後，通過鹼溶液處理的話，可以將活性已降低的酶從用於酯化反應後的固定化載 體上幾乎完全脫附。而且發現在此之後，通過使新的脂質分解酶吸附在回收的固定化 載體上，可以製造作為目標產物的固定化脂質分解酶。根據本發明，可以有效利用在酯化反應中已使用過的固定化酶的固定化載體， 製造與使用前具有相同性能的固定化脂質分解酶。而且，如果採用通過本發明的方法制 造得到的固定化脂質分解酶，可以製造DAG純度高的含DAG油脂。作為本發明的製造方法的對象固定化酶(已使用過的固定化酶)是在酯化反應中 使用的、脂質分解活性降低的固定化脂質分解酶。作為酯化反應，例如可以列舉出下文 所示的甘油與脂肪 酸或與其低級烷基酯的酯化反應。作為本發明的製造方法的對象固定化酶中的固定化載體，可以列舉出硅藻土 (celite)、硅藻土、高嶺石、矽膠、分子篩、多孔質玻璃、活性碳、碳酸鈣、陶瓷等無機 載體，陶瓷粉末、聚乙烯醇、聚丙烯、殼聚糖、離子交換樹脂、疏水性吸附樹脂、螯合 樹脂、合成吸附樹脂等有機高分子等；特別優選離子交換樹脂。作為離子交換樹脂，優選多孔質陰離子交換樹脂。這樣的多孔質載體由於具有 大的表面積，因而酶的吸附量大。樹脂的粒徑優選為100 1000 μ m，細孔徑優選為 10 150nm。對於陰離子交換樹脂，在專利文獻1中記載了由於載體的疏水性而吸附強，酶 難以從該載體脫附，因而，難以使由於使用而失活的酶脫附，重複利用載體。對此， 本發明發現如果用溶劑洗淨固定化酶後，用鹼溶液處理，即使在疏水性吸附酶的載體 中，酶也容易脫附，並且吸附新的酶，因此可以重複利用載體。在本發明中，作為陰離子交換樹脂的材質，可以列舉出苯酚-甲醛類、聚苯乙 烯類、丙烯醯胺類、二乙烯基苯類等；特別是從良好地發揮本發明效果的觀點出發，優 選酚醛樹脂(例如，Rohmand Hass Co.製造的Duolite A-568)。在本發明中，作為脂質分解酶可以列舉出脂肪酶。脂肪酶的種類可以任意選 擇，但從製造DAG純度高的含DAG油脂的觀點出發，優選1，3位選擇性脂肪酶。脂肪酶，當然可以使用來源於動物、植物的脂肪酶，也可以使用來源於微生物 的市售脂肪酶。作為來源於微生物的脂肪酶，可以列舉出來源於根黴(Rhizopus)屬、曲 黴(Aspergillus)屬、毛黴(Mucor)屬、根毛黴(Rhizomucor)屬、假單胞菌(Pseudomonas) 屬、地黴(Geotrichum)屬、青黴(Penicillium)屬、假絲酵母(Cimdida)屬等的脂肪酶。作為用於洗淨已用過的固定化酶的溶劑，可以列舉出正己烷、丙酮、氯仿、乙 醇、甲醇、乙酸乙酯、乙腈、乙酸、戊烷、辛烷等；從酶的油分除去性的觀點出發，優 選正己烷、丙酮、乙醇；特別從酶的油分除去性和溶劑除去性的觀點出發，優選正己 焼。洗淨方法可以列舉出間歇式混合、連續式接觸等，從操作性的觀點出發，優選 間歇式混合。洗淨後，優選通過過濾·減壓蒸餾溶劑等方法從固定化酶中除去溶劑。洗淨後的油分附著量變少，在鹼處理工序中降低油分和鹼的皂化，操作性變 好，從該觀點出發，以相對於100質量份的固定化載體(以下，單獨用「份」表示)， 洗淨後固定化脂質分解酶中的油分殘留量為50份以下的方式進行洗淨。從同樣的觀點出發，洗淨後的 固定化脂質分解酶中的油分殘留量更優選為1 50份；從同樣的觀點和處 理成本的觀點出發，特別優選為10 40份。洗淨操作可以只進行一次，也可以重複多 次。相對於固定化載體質量，測定殘留的油分質量，用下述計算式(1)求得相對於 100份固定化載體的質量比作為油分殘留量。油分殘留量=(a-b)/bX100(a:固定化酶質量，b:固定化載體質量) (1)通過溶劑洗淨後，使固定化酶與鹼溶液接觸，使酶從已用過的固定化酶脫附。 作為在本發明中的鹼溶液中使用的鹼，例如可以列舉出氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈣、 碳酸鉀等；從已用過的酶的除去性的觀點出發，優選氫氧化鈉。與鹼溶液的接觸方法可以列舉出間歇式混合、連續式接觸等；從操作性的觀點 出發，優選間歇式混合。接觸方法可以列舉出靜置、攪拌、振蕩等。從有效發揮製得的固定化酶的活性，防止DAG純度降低的觀點出發，用於使酶 從已用過的固定化酶中脫附的鹼溶液的溫度優選為0 70°C，更優選為30 65°C，特別 優選為40 60°C。另外，這裡「DAG純度」是指在DAG和TAG中的DAG的質量％ (以下，單獨用「％」表示)，用式0八0/江八0+0八0)\100表示。另外，從有效發揮製得的固定化酶的活性，防止DAG純度降低的觀點出發，鹼 溶液的濃度優選為0.25 2當量濃度，特別優選為0.8 1.5當量濃度。從有效發揮製得的固定化酶的活性，防止DAG純度降低的觀點出發，固定化酶 與鹼溶液的接觸時間優選為2 48小時，特別優選為20 30小時。使固定化酶與鹼溶液接觸後，優選通過水洗、pH處理等除去鹼。在固定新的脂質分解酶的情況下，可以在固定化載體上直接吸附酶，但為了成 為能表現出高活性的吸附狀態，優選在吸附酶前預先用脂溶性脂肪酸或其衍生物處理固 定化載體。作為脂溶性脂肪酸或其衍生物與固定化載體的接觸方法，可以在水或有機溶 劑中直接添加上述物質；但為了使分散性良好，也可以使脂溶性脂肪酸或其衍生物暫且 在有機溶劑中分散、溶解，然後加入已分散在水中的載體。作為該有機溶劑，可以列舉 出氯仿、己烷、乙醇等。脂溶性脂肪酸或其衍生物的使用質量，相對於100份的固定化 載體，優選為1 500份，特別優選為10 200份。接觸溫度優選為0 100°C，特別 優選為20 60°C。接觸時間優選為5分鐘 5小時左右。將該處理完成的載體過濾回 收，也可以乾燥。乾燥溫度優選為室溫 100°C，也可以進行減壓乾燥。預先處理載體的脂溶性脂肪酸或其衍生物中，作為脂溶性脂肪酸，可以列舉出 碳原子數為4 24，優選碳原子數為8 18的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的、具有或不 具有羥基的脂肪酸。具體而言，可以列舉出癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、亞油酸、 α-亞麻酸、蓖麻油酸、異硬脂酸等。作為上述脂溶性脂肪酸的衍生物，可以列舉出上述 脂溶性脂肪酸與一元醇或多元醇、或者與糖類的酯、磷脂以及在這些酯上加成了環氧乙 烷的物質等。具體而言，可以列舉出上述脂肪酸的甲酯、乙酯、單甘油酯、二甘油酯、 它們的環氧乙烷加成物、聚甘油酯、失水山梨醇酯、蔗糖酯等。從固定在載體上的工序 方面考慮，優選上述脂溶性脂肪酸及其衍生物在常溫(20°C)下都是液狀。作為上述脂溶 性脂肪酸及其衍生物，也可以並用上述2種以上，也可以使用油菜籽脂肪酸、大豆脂肪 酸等天然來源的脂肪酸。
進行酶固定化的溫度可以根據酶的特性決定，優選不引起酶失活的0 60°C， 特別優選為5 40°C。另外，固定化時使用的酶溶液的pH值只要在不引起酶變性的範圍 內即可，可以根據溫度相同時酶的特性決定，但優選pH值為3 9。為了維持該pH值 使用緩衝液，作為緩衝液，可以列舉出醋酸緩衝液、磷酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液等。從固定化效率的觀點出發，上述酶溶液中的酶濃度優選為酶的飽和溶解度以 下、且充分的濃度。另外，根據需要，作為酶溶液，也可以使用離心分離除去不溶部分 後的上清液、或者通過超濾精製得到的溶液等。另外，相對於100份固定化載體，使用 的酶量優選為5 1000份，特別優選為10 500份。從提高固定化酶的活性的觀點、以及酶成本的觀點出發，酶在固定化載體上的 吸附率越高越優選。酶吸附率優選為50%以上，更優選為80%，特別優選為92%，特別 更優選為94 99%。另外，這裡「酶吸附率」是指相對於酶吸附前的酶溶液的活性， 酶吸附後的酶溶液(除去固定化酶的部分)的活性的殘留率。在本發明中，優選在將脂質分解酶在固定化載體上吸附固定化後，不進行乾燥，通過一邊使其與脂溶性脂肪酸、脂肪酸三甘油酯或脂肪酸偏甘油酯等接觸，一邊進 行脫水，來調整殘留水分量。從保存穩定性的觀點出發，相對於100份固定化載體，殘留水分量優選調整為 1 50份，特別優選調整為1 30份。作為用於調整殘留水分量的脂溶性脂肪酸，優選菜籽油、大豆油、葵花籽油等 植物來源的液狀油脂，或沙丁魚油、金槍魚油、鰹魚油等從魚油中生成的脂肪酸。另 夕卜，使用的脂肪酸、脂肪酸三甘油酯或脂肪酸偏甘油酯在採用了根據本發明的方法製得 的固定化酶的實際酯化反應中，優選選擇作為油相基質。從製成與固定化酶充分接觸，並且避免過量使用而造成的浪費，以及提高流動 性、提高脫水效率的觀點出發，相對於100份固定化載體，用於調整殘留水分量的脂肪 酸、脂肪酸三甘油酯或脂肪酸偏甘油酯的量優選為20 3000份，更優選為100 1000 份。如果使用通過本發明方法得到的固定化酶(以下，稱為「本發明的固定化酶」) 製造DAG，則可以製備含高純度DAG的油脂(DAG+TAG中DAG的比率高)。從生理 功能的觀點出發，含DAG油脂的DAG純度優選為50%以上，進一步優選為65%以上， 特別優選為80 100%，特別更優選為93 98%。另外，含DAG油脂中的TAG含量 優選為20%以下，更優選為10%以下，特別優選為5%以下，特別更優選為4%以下。另外，如果使用本發明的固定化酶製造DAG，可以得到與使用通過使酶吸附在 未使用的固定化載體上得到的固定化酶(以下，稱為「新固定化酶」)製造DAG時，大 致相等的DAG純度的含DAG油脂。使用本發明的固定化酶時的DAG純度與使用新固定 化酶時的DAG純度之差，即用下述計算式(2)定義的含DAG油脂的「DAG純度之差」 優選為-0.9%以上，更優選為-0.7%以上，特別優選為-0.5%以上。DAG純度之差=(使用本發明的固定化酶時的DAG純度)_(使用新固定化酶時 的DAG純度) (2)另外，使用本發明的固定化酶時的TAG含量與使用新固定化酶時的TAG含量之 差，即用下述計算式(3)定義的含DAG油脂中的「TAG含量之差」優選為0.6%以下，更優選為0.3%以下。TAG含量之差=(使用本發明的固定化酶時的TAG含量)_(使用新固定化酶時 的TAG含量) (3)作為本發明中的DAG的製造方法，可以列舉出甘油與脂肪酸或與其低級烷基酯 的酯化反應。這裡，作為酯化反應中使用的脂肪酸或其低級烷基酯，可以使用直鏈或支鏈的 碳原子數為4 22，優選碳原子數為8 18的飽和或不飽和脂肪酸；例如可以使用丁 酸、異戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚 酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、反油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、順9-二十碳烯 酸(GadoleicAdd)、花生酸、山嵛酸、芥酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。作為 與上述脂肪酸形成酯的低級醇，可以舉出碳原子數為1 6的醇，例如可以列舉出甲醇、 乙醇、1-丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇或叔丁醇等。上述脂肪酸或其低級烷基酯可以 並用2種以上。另外，也可以使用上述脂肪酸的混合物例如大豆脂肪酸等天然來源的脂 肪酸。在該反應中，脂肪酸或其低級烷基酯與甘油的反應摩爾比R[R =脂肪酸或其低 級烷基酯(mol)/甘油(mol)]優選為1.5 3.0，更優選為1.6 2.8，特別優選為1.8 2.6。另外，酯化反應的反應溫度沒有特別限定，從反應效率的觀點出發，優選為 20 80°C，特別優選為30 70°C。還從工業化生產效率的觀點出發，反應時間優選為 10小時以內。通過酯化反應得到的含DAG油脂可以通過後處理作成製品。後處理優選進行脫 酸(除去未反應的脂肪酸和副生成的單醯甘油)、酸處理、水洗、脫臭各工序。脫酸工序 是指，通過對由酯化反應得到的含DAG油脂進行減壓蒸餾，從反應生成物中除去未反應 的脂肪酸和副生成的單醯甘油。酸處理工序是指在上述脫酸油中添加檸檬酸等螯合劑， 混合，根據需要，進一步減壓脫水的工序。另外，從使色相、風味更良好的觀點出發， 得到的酸處理油可以進行與吸附劑接觸的脫色工序。水洗工序是指在上述酸處理油中添 加水，強烈攪拌，進行油水分離操作的工序。水洗優選重複多次(例如3次)，得到水洗 油。脫臭工序是指對上述水洗油進行減壓水蒸氣蒸餾的工序。脫臭可以列舉出間歇式、 連續式、半連續式等，除了單獨用薄膜脫臭裝置或淺盤式脫臭裝置進行的方法以外，也 可以將使用了上述薄膜脫臭裝置的脫臭處理和使用了淺盤式脫臭裝置的脫臭處理組合進 行。
實施例
[固定化酶活性的測定方法]在設置有月牙狀攪拌翼的4 口燒瓶中加入4份固定化酶，用大約20份大豆 脂肪酸洗淨3次。其後，加入大豆脂肪酸，50°C下以400rpm攪拌15分鐘。接著， 加入甘油開始反應，用真空泵減壓。酯化反應在溫度50°C ·攪拌400rpm ·真空度 400Pa的條件下進行，大豆脂肪酸和甘油以FA/GLY的摩爾比為2，加入合計量80份。 每30分鐘對反應液進行取樣，以及AV值·水分·甘油組成的分析，畫出各組成(FA · GLY · MAG · DAG · TAG)隨時間變化的圖。當收率(DAG+TAG)達到70%時， 從時間變化曲線上讀取並計算出時間和DAG純度(DAG質量/(DAG+TAG質量)X100)。[新固定化酶A的製備] 將10 份 Duolite A-568 (Rohm and Hass Co.)放入 100 份 0.IN氫氧化鈉水溶液中攪
拌1小時。過濾後，用100份蒸餾水洗淨，用100份500mM醋酸緩衝液(pH值為6)調 節pH值平衡1次，用100份50mM醋酸緩衝液(pH值為6)調節pH值平衡2次。過濾 後，用40份乙醇進行乙醇置換。過濾後，加入10份大豆脂肪酸和40份乙醇的混合液， 攪拌30分鐘。接著，用50份50mM醋酸緩衝液(pH值為6)每30分洗淨1次共4次， 過濾，回收載體。其後，使10份脂肪酶(LilipaseA-lOFG，Nagase Chemtex Co。)與溶 解在180份50mM醋酸緩衝液(pH值為6)中的酶液接觸2小時，進行固定化。固定化 後過濾，回收固定化酶，然後用50份50mM醋酸緩衝液(pH值為6)進行30分鐘洗淨， 除去沒有固定化的酶和蛋白質，過濾，回收固定化酶。酶吸附率是98.0%。接著，使回 收的固定化酶與40份菜籽油接觸16小時，過濾，回收油處理後的固定化酶。對於通過 以上操作製備得到的新固定化酶A，按上述「固定化酶活性的測定方法」測定其活性(以 下相同)，收率達到70%的時間是64.0分鐘，DAG純度是95.1%，TAG含量是3.4%。 結果在表1中表示。[新固定化酶B的製備]將10 份 Duolite A-568 (Rohm and Hass Co.)放入 100 份 0.IN氫氧化鈉水溶液中攪
拌1小時。過濾後，用100份蒸餾水洗淨，用100份500mM醋酸緩衝液(pH值為6)調 節pH值平衡1次，用100份50mM醋酸緩衝液(pH值為6)調節pH值平衡2次，過濾， 回收載體。其後，將12份脂肪酶(Palatase 20000L，Novozymes Japan Co.)與溶解在180 份50mM醋酸緩衝液(pH值為6)中的酶液接觸2小時，進行固定化。固定化後過濾， 回收固定化酶，然後用50份50mM醋酸緩衝液(pH值為6)進行30分鐘洗淨，除去沒有 固定化的酶和蛋白質，過濾，回收固定化酶。酶吸附率是99.8%。接著，使回收的固定 化酶與40份菜籽油接觸16小時，過濾，回收油處理後的固定化酶。對通過以上操作制 備得到的新固定化酶B的活性進行測定，收率達到70%的時間是117.7分鐘，DAG純度 是97.0%，TAG含量是2.1%。結果在表2中表示。[已用過的固定化酶A的製備]使用上述新固定化酶A，在50°C進行相當於酯化反應時間1000小時的操作，制 備活性降低但具有殘留活性的已用過的固定化酶A。此時，油分殘留量相對於100份固定 化載體為150份。對已用過的固定化酶A的活性進行測定，收率達到70%的時間是220 分鐘，DAG純度是92.9%，TAG含量是5.0%。[已用過的固定化酶B的製備]使用上述新固定化酶B，在50°C進行相當於酯化反應時間1000小時的操作，制 備活性降低但具有殘留活性的已用過的固定化酶B。此時，相對於100份固定化載體， 油分殘留量是85.3份。對已用過的固定化酶B的活性進行測定，收率達到70%的時間是 290分鐘，DAG純度是93.9%，TAG含量是4.4%。[油分殘留量的測定]相對於固定化酶a部分，用10質量倍的己烷、丙酮交替各洗淨3次後，在70°C下放置15小時，進行脫溶劑處理，僅稱量固定化載體的質量(b)，根據下述計算式求出 相對於100份固定化載體的質量比。油分殘留量=(a-b)/bX100(a固定化酶質量，b:固定化載體質量)[酶吸附率的測定]使用脂肪酶 試劑盒S (大日本製藥製造)，37°C下反應15分鐘，對酶固定化操作 中的吸附前後的酶溶液的酶活性進行測定，酶吸附率用下述計算式求得。酶吸附率[% ]=(吸附前活性-吸附後活性)/吸附前活性X 100實施例1相對於10份已用過的固定化酶A(以乾燥物為基準)，加入85份正己烷，攪拌 30分鐘。洗淨後的油分殘留量相對於100份固定化載體為36.9份。減壓蒸餾除去己烷 後，使其與100份IN氫氧化鈉水溶液在50°C下接觸24小時，進行殘留酶的脫附。除 去氫氧化鈉水溶液，用100份蒸餾水洗淨後，加入4份10%醋酸水溶液和100份蒸餾水 中和。其後，用100份500mM醋酸緩衝液(pH值為6)調節pH值平衡1次，用100份 50mM醋酸緩衝液(pH值為6)調節pH值平衡2次。過濾後，用40份乙醇進行乙醇置 換。過濾後，加入10份大豆脂肪酸和40份乙醇的混合液，攪拌30分鐘。接著，50份 50mM醋酸緩衝液(pH值為6)每30分鐘洗淨1次共4次，回收，過濾載體。其後，將 10份脂肪酶(Lilipase A-IOFG, Nagase Chemtex Co.)與溶解在180份50mM醋酸緩衝液 (pH值為6)中的酶液接觸2小時，進行固定化。固定化後過濾，回收固定化酶，然後用 50份50mM醋酸緩衝液(pH值為6)進行30分鐘洗淨，除去沒有固定化的酶和蛋白質， 過濾，回收固定化酶。酶吸附率是97.7%。接著，使回收的固定化酶與40份菜籽油接 觸16小時，過濾，回收油處理的固定化酶。對通過以上操作製備得到的固定化酶的活性進行測定，收率達到70%的時間是 64.3分鐘，DAG純度是95.0%，DAG純度之差是_0.1 %，TAG含量是3.5%，TAG含量 之差是0.1%。結果在表1中表示。實施例2除了與氫氧化鈉水溶液的接觸時間為2小時以外，其它與實施例1同樣地製備固 定化酶。酶吸附率是95.5%。對得到的固定化酶的活性進行測定，收率達到70%的時 間是66.2分鐘，DAG純度是94.7%，DAG純度之差是-0.4%，TAG含量是3.8%，TAG 含量之差是0.3%。結果在表1中表示。實施例3相對於10份已用過的固定化酶A(以乾燥物為基準)，加入85份正己烷，攪拌 30分鐘，減壓蒸餾除去己烷。該操作進行2次，使用其油分殘留量相對於100份固定化 載體為6.7份的物質，與實施例1同樣地製備固定化酶。酶吸附率是96.7%。對得到的 固定化酶的活性進行測定，收率達到70%的時間是65.2分鐘，DAG純度是96.7%，DAG 純度之差是1.6%，TAG含量是2.3%，TAG含量之差是_1.1%。結果在表1中表示。實施例4相對於10份已用過的固定化酶A(以乾燥物為基準)，加入85份正己烷，攪拌 30分鐘，減壓蒸餾除去己烷。該操作進行3次，使用相對於100份固定化載體，其油分 殘留量為2.4份的物質，與實施例1同樣地製備固定化酶。酶吸附率是98.6%。對得到的固定化酶的活性進行測定，收率達到70%的時間是66.8分鐘，DAG純度是95.8%， DAG純度之差是0.7%，TAG含量是2.9%，TAG含量之差是-0.5%。結果在表1中表示。實施例5相對於10份已用過的固定化酶B (以乾燥物為基準)，加入85份正己烷，攪拌 30分鐘。相對於100份固定化載體，洗淨後的油分殘留量是8.7份。減壓蒸餾除去己 烷後，使其與100份IN氫氧化鈉水溶液在50°C下接觸24小時，進行殘留酶的脫附。除 去氫氧化鈉水溶液，用100份蒸餾水洗淨後，加入4份10%醋酸水溶液和100份蒸餾水 中和。其後，用100份500mM醋酸緩衝液(pH值為6)調節pH值平衡1次，用100份 50mM醋酸緩衝液(pH值為6)調節pH值平衡2次，回收，過濾載體。其後，使12份 脂肪酶(Palatase 20000L, NovozymesJapan Co.)與溶解在份5OmM醋酸緩衝液(pH值 為6)中的酶液接觸2小時，進行固定化。固定化後過濾，回收固定化酶，然後用50份 50mM醋酸緩衝液(pH值為6)進行30分鐘洗淨，除去沒有固定化的酶和蛋白質，回收， 過濾固定化酶。酶吸附率是99.1%。接著，使回收的固定化酶與40份菜籽油接觸16小 時，過濾，回收油處理的固定化酶。對得到的固定化酶的活性進行測定，收率達到70%的時間是86.8分鐘，DAG純 度是97.1%，DAG純度之差是0.1%，TAG含量是2.1%，TAG含量之差是0.0%。結果 在表2中表示。比較例1不對上述已用過的固定化酶A進行己烷洗淨，直接使其在50°C下與100份IN氫 氧化鈉水溶液接觸24小時，進行殘留酶處理，在過濾時，液體的流動性差無法過濾，因 而不能製備固定化酶。比較例2相對於10份上述已用過的固定化酶A(以乾燥物為基準)，用30份正己烷洗淨， 相對於100份固定化載體，調節油分殘留量為100份，然後使其在50°C下與100份IN氫 氧化鈉水溶液接觸24小時，進行殘留酶處理，與比較例1同樣流動性差無法過濾，因而 不能製備固定化酶。比較例3除了在實施例1中，己烷洗淨後，不進行通過鹼處理的酶脫附，進行乙醇置換 以外，其它與實施例1同樣地製備固定化酶。酶吸附率是91.1%。對得到的固定化酶的 活性進行測定，收率達到70%的時間是69.5分鐘，DAG純度是92.6%，DAG純度之差 是-2.5%，TAG含量是5.2%，TAG含量之差是1.8%。結果在表1中表示。比較例5除了在實施例5中，己烷洗淨後，不進行通過鹼處理的酶脫附，進行乙醇置換 以外，其它與實施例5同樣地製備固定化酶。酶吸附率是93.8%。對得到的固定化酶的 活性進行測定，收率達到70%的時間是103.8分鐘，DAG純度是96.0%，DAG純度之差 是-1.0%，TAG含量是2.8%，TAG含量之差是0.7%。結果在表2中表示。表 1
權利要求
1.一種固定化脂質分解酶的製造方法，將酯化反應中使用過的固定化脂質分解酶和 溶劑混合，進行洗淨使得相對於100質量份的固定化載體，固定化脂質分解酶中的油分 殘留量為50質量份以下，接著，使其接觸鹼溶液，然後回收固定化載體，使脂質分解酶 吸附在該固定化載體上。
2.如權利要求1所述的固定化脂質分解酶的製造方法，其中，鹼溶液的溫度為0 70°C，濃度為0.25 2當量濃度，接觸時間為2 48小時。
3.如權利要求1或2所述的固定化脂質分解酶的製造方法， 其中，脂質分解酶是1，3位選擇性脂肪酶。
4.如權利要求1或2所述的固定化脂質分解酶的製造方法， 其中，固定化載體為陰離子交換樹脂。
5.一種甘油二酯的製造方法，其使用根據權利要求1或2所述的方法製得的固定化脂 質分解酶，使甘油與脂肪酸或其低級烷基酯反應。
全文摘要
本發明涉及固定化酶的製造方法。本發明提供一種製造固定化脂質分解酶的方法，有效利用已在酯化反應中使用過的固定化酶的固定化載體，製造與使用前具有相同性能的固定化脂質分解酶。本發明的固定化脂質分解酶的製造方法是將酯化反應中使用過的固定化脂質分解酶和溶劑混合，進行洗淨使得相對於100質量份的固定化載體，固定化脂質分解酶中的油分殘留量為50質量份以下，接著，使其接觸鹼溶液，然後回收固定化載體，使脂質分解酶吸附在該固定化載體上。
文檔編號C12N11/00GK102016019SQ20098011406
公開日2011年4月13日 申請日期2009年4月20日 優先權日2008年4月21日
發明者加瀬實, 小松利照, 福原真平 申請人:花王株式會社