一種體外高效擴增動物細胞的培養液及其用途的製作方法
2023-08-10 02:51:41 1
專利名稱：一種體外高效擴增動物細胞的培養液及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於細胞與組織培養領域中的培養液配方，涉及ー種低血清、組成成分明確的培養液，該培養液特別適用於體外擴增貼壁細胞。
背景技術：
細胞培養基是維持體外細胞生存和生長增殖的基礎物質，也提供組織細胞營養和繁殖的生存環境。通過改善培養環境，可在較短時間內提高擴增倍數，減少擴增過程中的分化與老化。可分為天然培養基及合成培養基兩大類。體外培養細胞所需的營養物質與體內相同。目前市面上銷售的合成培養基RPMI1640、199等所含的胺基酸已足夠，但在使用合成培養基時，仍需加入ー些天然成份，如人或動物的血清、血漿和胎汁等。動物細胞培養基的基本成分包括胺基酸、碳水化合物、無機鹽、緩衝系統、維生素等，所必需的溶液為平衡鹽溶液(常用的為Hanks液和Earle液)和PH調整液(3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES溶液)。在ー些較為複雜的培養液中還包括其它ー些成分。如在雜交瘤技術中常用的DMEM培養液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和2-巰基こ醇(2-Mercaptoethanol,2_Me)。2_Me對細胞生長有很重要 的作用。有人認為它相當於胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中ー個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成穀胱甘肽，能誘導細胞的増殖，為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養細胞的損害。另ー個重要作用是促進分裂原的反應和DNA合成，増加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉化作用，已廣泛應用於雜交瘤技術。所謂的貼壁培養是指大多數動物細胞在離體培養條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長，並最終在附著表面擴展成單層。貼壁生長的細胞有接觸抑制的特性，一旦細胞形成單層，生長就會受到抑制，細胞產量有限。而懸浮培養是指少數懸浮生長型動物細胞在離體培養時不需要附著物，懸浮於培養液中即可良好生長。懸浮生長的細胞其培養和傳代都十分簡便。在動物體中只有少數種類的細胞適於懸浮培養。如果貼壁細胞長期不貼壁，有可能會死，或者活性降低。目前較為常用的貼壁細胞培養基有以下幾種:RPMI1640、MEM、DMEM、DMEM/F12及
無血清培養基。(1) RPMI1640 =RPMI 1640是由Moor等研究成功的，最初為培養小鼠白血病細胞的需要而製備。開始的配方特別適合懸浮細胞的生長，主要針對淋巴細胞，後經幾次改良從RPMI1630、1634，而至RPMI1640。其組成較為簡單，但可以適應很多種類型細胞的生長。(2) MEM:MEM培養基是由Eagle』 s基礎培養基(BME)發展而來的，是將其中的胺基酸和維生素濃度調整至接近細胞質內含量水平的最低必需培養液(Eagle』 s minimumessential medium)。MEM是哺乳動物細胞的理想培養基，通常用於貼壁細胞的培養，通過對配方進行修正，可以用於其他類型細胞的培養，如無鈣MEM培養基可以用於懸浮細胞的培養，含有Hank』 s鹽的MEM培養基可以用於二倍體細胞的培養。
(3) DMEM培養基是為小鼠成纖維細胞設計的，現在常用於貼壁細胞的培養。含各種胺基酸、維生素和葡萄糖。DMEM在MEM基礎上增加了各成分的用量，其胺基酸濃度是MEM的兩倍，維生素濃度是MEM的4倍，採用雙倍的HC03-和C02濃度起到更好的緩衝作用。最初的配方中葡萄糖含量為1.0g/L (低糖型)，後來為了某些細胞的生長需要，將葡萄糖含量又調整為4.5g/L (高糖型)。高糖型有利於細胞停泊於ー個位置生長，適合於高密度懸浮細胞的培養。低糖型適於生長慢、依賴性貼壁細胞的培養。有研究表明目前常用的含10%胎牛血清的低糖DMEM不利於維持間充質幹細胞的幹細胞特性，在多次傳代後發現其細胞粘附面積變大，鋪展開呈不規則型，増殖能力及分化潛能均降低，細胞老化明顯。(4)DMEM/F12是由DMEM和F12按I: I混合而成的。其中F12的成分和DMEM有所不同，它與FlO相比含有更多的維生素，肌醇，胺基酸，與DMEM混和後成分更為多樣而均衡，營養成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無血清培養基的基礎培養基，適於原代細胞的培養。(5)目前也有商品化的無血清培養基。無血清培養基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配製的完全培養基可以滿足大部分細胞培養的要求。但對有些實驗卻不適合，如觀察ー種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的幹擾作用。而血清中可能含有各種生長因子，又如需要測定某種細胞在培養過程中分泌某種物質的能力，或者要大規模的培養某種細胞，以獲得它們的分泌產物。因此研製出無血清培養基一直是生物科學工作者努力的目標。但是，配製無血清培養液必須使用高質量的水，在無血清培養基中通常要加入激素和生長因子，有化學限定性，價格昂貴，細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便，針對性強，一種無血清培養基僅適合某一類細胞的培養。(6)目前廣泛應用的貼壁細胞培養體系多採用胎牛血清，它含有補體成分，殘存的胎牛血清可能會導致患者的不良反應。在體外培養過程中，細胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子細胞內在化，即使通過洗滌也不能清除牛血清蛋白，從而幹擾治療效果及其評估。為此，有人嘗試應用已知人 源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清進行人間充質幹細胞培養，結果發現在無血清體系中，細胞能保持其多向分化特性，増殖速度較傳統體系下更為旺盛，此外，它能增加確定性、減少後期純化和下遊加工，提高製品安全性和質量。但是，血清替代品中多含有牛血清白蛋白，它是主要蛋白質成分之一，無血清培養體系雖能保證細胞培養批次及實驗室間的穩定性，仍不能從根本上解決異種蛋白內在化問題。在無血清培養液中，間充質幹細胞若不添加細胞因子將很難生長，可能與血清誘發間充質幹細胞増殖與分化相關的胞內Ca2+流動有夫。綜上所述，上述現有培養方案的缺點是:1、現有的無血清培養基是用成分未能完全確定的血製品代替血清，因為部分成分未知，所以細胞受汙染的風險也不能確定，進而導致臨床風險無法預測。2、現有用於擴增貼壁細胞尤其是幹細胞生長的培養液，在培養20代後幹細胞便開始分化而失去幹細胞的可塑性及臨床應用效能。3、現有的無血清培養基配方十分複雜，所需材料成本比起用動物血清要高數倍，令其不能廣泛地推廣使用。
4、商品化的低血清或無血清培養基一般價格較昂貴，不適合用於大規模擴增細胞。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是:提供一種低成本、低臨床風險、高擴增效率和組分來源明確的低血清的體外高效擴增動物細胞的培養液及其用途。為解決上述技術問題，本發明採取以下技術方案:ー種體外高效擴增動物細胞的
培養液，姆升培養液包括以下組分:
基礎培養基0.95-0.98L
胎牛血清0.02L-0.05L
細胞因子0.1-19.9ug
丙酮酸鈉0.1-lg
碳酸氫鈉l-2g
谷氧醯胺l-4mmol。所述細胞因子為鹼性成纖維細胞生長因子bFGF和表皮生長因子中的一種或兩種組合。`所述基礎培養基為DMEM/F12培養基。所述的體外高效擴增動物細胞的培養液用於貼壁生長細胞的培養。本發明的有益效果是:本發明培養的包括間充質幹細胞在內的貼壁細胞在5-6天的培養周期中，細胞量可増殖20倍，小方瓶與滾瓶的效果相同。可得到大量富有活性的貼壁細胞，井能夠長時間保存而不失其活性和幹細胞特性，且操作簡單易行，並且經過流式細胞儀檢測、細胞周期檢測以及體外分化實驗鑑定，獲得的細胞純度和細胞活性較高，具有良好増殖潛力，可直接用於科學實驗研究和臨床上的輔助治療，富有應用前景。此外，該培養液組成成分明確清晰，避免了因培養液批次間差異，造成所培養的貼壁細胞性質不同的可能性，同時也避免了因殘留成分未知而給臨床應用帶來無法預知的風險。本發明的培養液不僅適用於間充質幹細胞的培養，也可適用於其它組織或其它動物貼壁細胞的培養，應用前景廣闊。
圖1為不同培養基培養的人臍帶胎盤間充質幹細胞細胞形態及細胞生長曲線(A-DMEM培養基，B-MesenPRO RS Medium, C-本發明培養液，D-三種培養基的生長曲線對比)。圖2為本發明培養液培養的人臍帶胎盤間充質幹細胞表型分析結果。圖3為本發明培養液培養的人臍帶胎盤間充質幹細胞分化特性(圖A C為成骨誘導結果。A-誘導後為染色的圖片，可見細胞聚集成團的鈣結節，B-免疫組化鑑定骨涎蛋白，C-Von Kossa染色鑑定鈣結節的產生；圖D和E為成脂誘導結果，其中圖D-未經成脂誘導組細胞圖片，圖E-間充質幹細胞經成脂誘導後油紅0染色結果)。圖4為本發明培養液培養的人包皮成纖維細胞系HFF的形態、生長曲線。
圖5為本發明培養液培養的腫瘤細胞系HeLa的形態、生長曲線。圖6為本發明培養液培養的腫瘤細胞系HepG2的形態、生長曲線。
具體實施例方式本發明的體外高效擴增動物細胞的培養液，每升培養液包括以下組分:
基礎培養基0.95-0.98L
胎牛血清0.02L-0.05L
細胞因子0.1-19.9ug
丙酮酸鈉0.1-lg
碳酸氫鈉l-2g
穀氨醯胺l-4mmol。所述細胞因子為鹼性成纖維細胞生長因子bFGF和表皮生長因子中的一種或兩種組合。所述基礎培養基為DMEM/F12培養基。所述的體外高效擴增動物細胞的培養液用於貼壁生長細胞的培養。表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)最初從鼠頜下腺分離提純，鼠EGF分子量約6040，由53個胺基酸組成，含有3個ニ硫鍵結構，人EGF主要由唾液腺，十二指腸腺和腎臟組織分泌，分子量約5700，結構與mEGF相似，可作用於同一受體。EGF是ー個強效的促分裂原，對許多上皮細胞，間質細胞和腫瘤細胞具有明顯的促生長作用，EGF通過與細胞膜上EGF受體結合發揮作用。在1940年，Hoftman等在腦和垂體的抽提物中發現的，1974年該物被分離純化，並命名為成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)。接著,人們又分離出ー種與之高度同源的物質，由於它含有較多的酸性胺基酸鹼基，等電點為酸性(5.6)，故命名為酸性FGF (aFGF)。先發現的FGF因對酸和熱敏感，等電點呈鹼性(9.6)，則稱為鹼性FGF(bFGFXbFGF作為細胞分裂原，主要作用在起源於中胚層和神經外胚層的骨骼肌細胞、成纖維細胞和骨細胞等，其受體也相應的分布於上述細胞表面。現今資料表明，bFGF的生物學作用極其廣泛，它在血管形成、促進創傷癒合與組織修復、促進組織再生和神經組織生長發育過程中起著十分重要的作用。丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，儘管細胞更傾向於以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。穀氨醯胺是細胞生長的必須胺基酸，為培養的細胞提供重要的能量來源。脫掉氨基後，穀氨醯胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。培養液中使用了 NaHCO3-CO2緩衝系統，並採用開放培養，使細胞代謝產生的CO2及時溢出培養瓶，再通過穩定調節溫箱中CO2濃度(5% )，與培養液中的NaHCO3處於平衡狀態，從而調節培養液的PH值，其用量也直接關係到培養基對細胞生長增殖和生物學特性的影響。基於上述因素的影響，考慮將血清的濃度降至最低，以避免其對細胞生長、増殖、形態和功能的影響。這樣可以在節省培養基成本的前提下，減少由於不確定蛋白或者其它血清組分帶來幹擾和差異的風險，提高製品安全性。血清用量減少的同時可以減少血清使用批次及批間差的影響。所以，選擇合適劑量的bFGF、EGF、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉和穀氨醯胺作為本發明培養液利於細胞生長增殖的添加成分。本發明的培養液的特點如下:(I)使用成分明確、營養豐富且可使用較少血清的DMEM/F12作為本發明的基礎培養基，克服其它基礎培養基對貼壁細胞生長的不利因素。此外，無血清培養基中通常要加入激素和生長因子，有化學限定性，價格昂貴，細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和應用不如傳統的合成培養基方便，針對性強，一種無血清培養基僅適合某一類細胞的培養，本發明也同樣可以解決無血清培養基之上述弊端。(2)使用較低濃度的胎牛血清，以避免在高濃度或無血清環境下其對細胞生長、増殖、形態和功能的影響。這樣可以在節省培養基成本的前提下，減少由於不確定蛋白或者其它血清組分帶來幹擾和差異的風險，提高製品安全性。血清用量減少的同時可以減少血清使用批次及批間差的影響。(3)選擇合適劑量的bFGF、EGF、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉和穀氨醯胺作為本發明培養液的添加成分，在保證細胞對營養的需求外，還可以高效地擴增並很好地保持細胞的生物學特性。因此，本發明的培養液是一種低成本、低臨床風險、高擴增效率和組分來源明確的低血清培養液。綜上所述，應用高效、穩定的培養基在體外大規模擴增貼壁細胞是滿足臨床需求的充分且必要條件。下面結合附圖和具 體實施例對本發明作進ー步的說明，但本發明並不受限於下述實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1臍帶或胎盤自手術臺取下後於超淨臺內取出，用D-PBS衝洗淨表面殘餘血液，カロ入膠原酶於恆溫振蕩儀內消化,於100目篩網過濾收集細胞並用D-Hank』 s液衝洗細胞3次，將細胞懸液放入T-75細胞培養瓶中培養。本實施例每升的培養液組分為:添加0.1lg丙酮酸鈉和1.5g碳酸氫鈉的DMEM/F12培養基(市售如GIBC0、Hyclone、友康基業生物科技(北京)有限公司等公司均可)0.98L、0.02L胎牛血清、9ug的bFGF和9ug的EGF、2mmol穀氨醯胺。採用以上培養液，每3天更換一次培養液，當細胞生長至80%滿時行傳代培養，繪製細胞生長曲線和細胞倍增時間。細胞倍增時間是指有增殖能力的細胞通過有絲分裂使細胞增加一倍所需要的時間。體外傳代培養細胞的倍增時間可以通過測量計算而得。細胞倍增時間因細胞種類而異，對同種細胞而言其倍増時間是相對恆定的。因而細胞倍增時間直接反映細胞増殖的快慢，當環境因素使細胞倍増時間發生改變時，則意味著細胞周期進程發生了改變。因此，細胞倍增時間也是觀察細胞周期進程變化的重要參數。況且，此參數的測定簡而易行，更有實際意義。1、繪製人臍帶胎盤間充質幹細胞細胞生長曲線和計算細胞倍增時間(I)細胞懸液製備:取生長良好接近匯合的人臍帶胎盤間充質幹細胞，胰酶消化，再加新鮮培養基製成細胞懸液後計數。(2)接種:根據細胞計數結果，按每瓶5X104個接種細胞作傳代培養。
(3)計數:24h後開始作細胞計數，以後每隔24h計數一次，連續計數7天。(4)繪圖:根據計數結果，繪製人臍帶胎盤間充質幹細胞生長曲線。用Patterson公式計算對數生長期細胞倍增時間，(Td=tX [lg2/lg (Nt/No) ] ), t為細胞數由No增至Nt所用時間(h),No為首次記下的細胞數,Nt為t時間後的細胞數。一般No在接種細胞24小時後進行。結果發現本發明培養液培養的細胞僅需較短的初期融合時間和細胞倍增時間，在5-6天的培養周期中，細胞量可増殖20倍，可得到大量富有活性的人臍帶胎盤間充質幹細胞，井能夠長時間保存而不失其活性，且具有較強的克隆形成能力，更適於人臍帶胎盤間充質幹細胞的體外擴增，圖1。2、人臍帶胎盤間充質幹細胞的免疫表型分析免疫表型檢測CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD31，CD34，HLA-DR (見表 I)。將使用本發明培養液培養的第3-6代人臍帶胎盤來源間充質幹細胞檢測，待細胞達到80-90%融合時使用胰酶消化，加入含10% FBS的培養基進行中和，離心之後，棄掉上清，PBS洗滌2次，分成每管I X IO6細胞，混勻，4°C避光孵育30分鐘，PBS洗滌I次，離心後棄上清，加入500 u I PBS重懸，混勻，即可上機(流式細胞儀FACSAria，BD公司)檢測，見圖2。表I本發明優選檢測人臍帶胎盤間充質幹細胞的表面標誌物
序號物品名稱標記CatN0.數量來源
I PE Mouse Ant1-Human CD29`陽性 MCA1949PET 25 TESTS serotec2 APC Mouse Ant1-HumanCD44 陽性559942IOOtests BD 公司
3PE Mouse Ant1-Hunian CD73陽性550257IOOtests BD 公司
4FITC ant1-human CD90陽性MCA90FT25 Hgserotec
5PE labeled ant1-human CD 105陽性 MCA1557PET 25 TESTS serotec` 6FITC labeled ant1-hiiman CD31IJ 性MCA1738FT25 Hgserotec
7APC Mouse Ant1-Hiraian CD34I性 555824IOOtestsBD 公司「.8FITC labeled ant1-human HLA DR陰性 MCA71FImlserotecL0059」 9MOUSE IgGl:RPE同甩對照MCA928PE100 TESTSserotec
11)MOUSE IgGl:FITC同. 對照 MCA928F 100 TESTS serotec
ilAPC-Mouse IgGl k同.fl對照555751100 tests BD 公司表2人臍帶胎盤間充質幹細胞表面標誌物的檢測結果
細
\ 胞
表代"Dl
面ヽ\ 數
標記\
陽性標記I CD2999.7%CD44 99.8%
CD9099.7%
CD10599.8%
陰性標-1dcrnlo%
CD3401%
^HLA-DRoI%3、人臍帶胎盤間充質幹細胞體外分化潛能的鑑定
消化體外擴增的第4 一 6代間充質幹細胞，以5X IO4細胞總數接種於6孔板中，每孔加2ml上述本發明培養液。在細胞達到60% — 80%融合時，更換相應的誘導分化培養基。(I)細胞的成骨分化潛能及分化後鑑定誘導分化培養基為含有100nmol/L的地塞米松,10mmol/L的￠-甘油磷酸鈉，50 u mo I/L維生素C和10 % FBS的DMEM/F12培養液，每隔2天換液I次，培養21天，行鹼性磷酸酶定性檢測、茜素紅染色、I型膠原的免疫螢光檢測、四環素螢光檢測及Von Kossa染色，鑑定鈣結節的產生。顯微鏡下觀察，鹼性磷酸酶染色及茜素紅染色可見細胞漿中有大量的鈣沉積，I型膠原和四環素的螢光檢測可見在形成鈣結節的位置有紅色螢光信號，VonKossa染色可見黑色礦化物沉積。(2)成脂分化潛能及分化後鑑定配置含0.5mM3_異丁基-1-甲基黃嘌呤、I U M地塞米松、10 ii M胰島素、200 ii M吲哚美辛、10%FBS的DMEM/F12成脂誘導液。取第3代細胞以I X IO5個/mL密度接種於預置蓋玻片的6孔板，每孔加入ImL本發明培養基，37°C、5%C02及飽和溼度培養箱培養至細胞達60% 70%融合，加入成脂誘導液，37°C、5%C02及飽和溼度培養箱培養，每日倒置相差顯微鏡下觀察細胞內脂滴形成情況，14d後行油紅0染色。油紅0染色可見細胞胞質內有紅染脂滴，大小不等，部分脂滴發生融合。對於按照本發明上述方法製備的間充質幹細胞，按照「國際細胞療法協會」(ISCT)制定的標準進行生物學表型鑑定，表現出以下技術特徵:①在最佳培養體系條件下細胞貼壁生長，可形成CFU-F集落，形態相對均一，呈平行排列生長或旋渦狀生長的梭形細胞；
②表達粘附分子受體標記物⑶29、⑶44，間質細胞標記⑶73、⑶105，幹細胞標記物⑶90 ;而不表達內皮細胞標記物⑶31和造血幹細胞標誌⑶34，也不表達HLA-DR ；結果表明，人臍帶胎盤間充質幹細胞在DMEM、MesenPR0 RSr Medium和本發明培養基中的倍增時間分別為42.09h、29.36h和24.77h，本發明培養基能使人臍帶胎盤間充質幹細胞的増殖時間縮短近20h，並可以在體外誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞，能很好地保持其幹細胞特性。實施例2無菌條件下取兒童包皮環切術後包皮，用無菌PBS清洗3次；剪去皮下組織，將皮片置於胰酶中37°C消化2h ;用眼科鑷採取機械法分離表皮與真皮；將真皮片用無菌PBS清洗3次後用眼科剪將其剪成約Imm3大小組織塊；將組織塊移人離心管中，加入膠原酶溶液吹打均勻，37°C,5% CO2孵箱消化4h，經150目不鏽鋼濾網過濾消化液；收集消化液，IOOOrpm離心5min，棄上清，以同樣的方法再離心I次；將細胞懸液放入T-75細胞培養瓶中培養。本實施例每升的培養液組分為:添加0.1lg丙酮酸鈉和1.5g碳酸氫鈉的DMEM/F12培養基(市售如GIBC0、Hyclone、友康基業生物科技(北京)有限公司等公司均可)0.95L、0.05L胎牛血清、IOug的bFGF和9.9ug的EGF、2mmol穀氨醯胺。採用以上培養液，每3天更換一次培養液，當細胞生長至80%滿時行傳代培養，繪製人包皮成纖維細胞(Human foreskinfibroblasts, HFF)細胞生長曲線和計算細胞倍增時間。(I)細胞懸液製備:取生長良好接近匯合的HFF細胞，胰酶消化，再加新鮮培養基製成細胞懸液後計數。(2)接種:根據細胞計數結果，按每孔I X IO4個接種細胞作傳代培養。(3)計數:24h後開始作細胞計數，以後每隔24h計數一次，連續計數7天。(4)繪圖:根據計數結果，繪製HFF細胞生長曲線。用Patterson公式計算對數生長期細胞倍增時間，(Td=tX [lg2/lg (Nt/No) ] ), t為細胞數由No增至Nt所用時間(h) ,No為首次記下的細胞數,Nt為t時間後的細胞數。一般No在接種細胞24小時後進行。結果表明，HFF的細胞倍增時間為52.32h。實施例3腫瘤細胞系(包括HeLa細胞系和H印G2細胞系)的復甦和培養:從液氮中取出凍存管、迅速置於溫水中並不斷攪動。使凍存管中的凍存物在I分鐘之內融化。打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。IOOOrpm離心10分鐘，棄去上清液。沉澱加IOml培養液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。加適當培養基後將細胞轉移至培養瓶中，37°C，5% CO2孵箱培養，第二天觀察生長 情況。本實施例每升的培養液組分為:添加0.1lg丙酮酸鈉和2g碳酸氫鈉的DMEM/F12培養基(市售如GIBCO、Hyclone、友康基業生物科技(北京)有限公司等公司均可)0.98L、0.02L胎牛血清、15ug的EGF、2m mo I穀氨醯胺。採用以上培養液，每3天更換一次培養液，當細胞生長至80%滿時行傳代培養，繪製細胞生長曲線和細胞倍增時間。(I)細胞懸液製備:取生長良好接近匯合的HeLa和H印G2細胞，胰酶消化，再加新鮮培養基製成細胞懸液後計數。(2)接種:根據細胞計數結果，按每瓶5X104個接種細胞作傳代培養。(3)計數:24h後開始作細胞計數，以後每隔24h計數一次，連續計數7天。(4)繪圖:根據計數結果，繪製HeLa和H印G2細胞生長曲線。用Patterson公式計算對數生長期細胞倍增時間，(Td=tX [lg2/lg (Nt/No) ] ), t為細胞數由No增至Nt所用時間(h),No為首次記下的細胞數,Nt為t時間後的細胞數。一般No在接種細胞24小時後進行。結果表明，HeLa和H印G2的細胞倍增時間為27.5h和24h。綜上所述，本發明的內容並不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的範圍之內。
權利要求
1.一種體外高效擴增動物細胞的培養液，其特徵在於，每升培養液包括以下組分: 基礎培養基0.95-0.98L 胎牛血清0.02L-0.05L 細胞因了 0.1-19.9ug 丙+酬酸鈉0.1-lg碳酸氫鈉l- 2g 穀氨醯胺l-4mmolo
2.根據權利要求1所述的體外高效擴增動物細胞的培養液，其特徵在於，所述細胞因子為鹼性成纖維細胞生長因子bFGF和表皮生長因子中的ー種或兩種組合。
3.根據權利要求1或2所述的體外高效擴增動物細胞的培養液，其特徵在於，所述基礎培養基為DMEM/F12培養基。
4.權利要求1所述的體外高效擴增動物細胞的培養液用於貼壁生長細胞的培養。
全文摘要
本發明公開了一種體外高效擴增動物細胞的培養液及其用途，培養液組成包括基礎培養基DMEM/F12、bFGF、EGF、丙酮酸鈉、穀氨醯胺、碳酸氫鈉和胎牛血清。本發明的培養液中含有較低的動物血清，具有較高的安全性，配方成分簡單、明確，避免因培養基批次間差異，造成所培養的細胞性質不同的可能性，適合細胞產品的產業化。採用本發明培養液培養的動物貼壁細胞體外增殖能力較強且能很好地保持其生物學特性，不僅試用於貼壁的間充質幹細胞的培養，也可適用於其他成纖維細胞系和其他細胞系的培養。
文檔編號C12N5/0775GK103087977SQ20131002963
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者洪敬欣, 韓俊領, 劉俊江, 李茜, 黃文敬 申請人:協和幹細胞基因工程有限公司