腦膜炎球菌抗獨特型抗體疫苗的製作方法
2023-08-09 18:23:36 1
專利名稱：腦膜炎球菌抗獨特型抗體疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥領域，主要涉及腦膜炎球菌疫苗，具體講就是ー種腦膜炎抗獨特型疫苗及其製備方法。
背景技術：
流行性腦膜炎是由腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitids, Nm)通過呼吸道傳播所引起的化膿性腦膜炎。一般將Nm分為13個血清群，其中以A，B，C三群常見，佔流行病例的90%以上。我國曾於1938年、1949年、1959年、1967年和1977年先後發生5次全國性流腦大流行，其中以1967年春季最為嚴重，發病率高達403/10萬，病死率為5.49%。自1985年開展大規模流腦A群疫苗接種之後，流腦的發病率持續下降，2000年以來發病率一 直穩定在0.2/10萬左右，未再出現全國性大流行。我國以往的流行菌株以A群為主，B群其次，C群少見，但近些年B群和C群有增多的趨勢，尤其是在個別省份先後發生了 C群Nm引起的局部流行。接種疫苗是防治流行性腦膜炎的主要途徑。在國內市場上，《中國藥典》只列入了A群單價流腦多糖疫苗；然有蘭州生物製品研究所上市的A+C群ニ價疫苗，但並未成為國家級和部級標準，而國際市場上，原美國凱龍公司(現屬諾華)已經開始了四價多糖疫苗的臨床前研究。目前國內外有關腦膜炎球菌疫苗的專利大多為用腦膜炎球菌莢膜多糖製備的疫苗，它是ー種T細胞非依賴性抗原，不能誘發免疫記憶。與載體蛋白偶聯雖然可將多糖抗原轉變為T細胞依賴性抗原，能誘發免疫記憶。但生產エ藝複雜，產量較低，遠不能滿足計劃免疫的大規模需求。目前市場上腦膜炎疫苗由於抗原性較弱且具有致病菌內毒素，因此在疫苗接種後造成接種者有應急反應如發熱、局部紅、腫、熱、痛等，嚴重者出現皮疹、顏面部水腫甚至過敏性休克等變態反應、甚至造成感染擴散等。因此，本發明的研究是在生物製藥領域進行更加深入且針對性的探討，對於人類的健康和保護具有重要的意義。經本發明項目組在網際網路搜索和對國內外專利文獻和公開發表的期刊論文檢索，未發現與本發明相關的同樣報導或文獻。同時委託陝西省科學技術信息研究所就本發明主題在中、外文獻庫進行檢索，也未見與本發明完全相同的文獻報導。
發明內容
本發明的目的是提供ー種具有腦膜炎球菌抗原「內影像」、高保護率的且生產エ藝簡便、可大規模生產的抗獨特型抗體疫苗。下面對本發明進行說明本發明是根據「免疫網絡學說」:針對外來抗原的抗體分子(Abl)可變區上獨特型(idiotype, Id)可刺激機體產生相應的抗Id抗體(Ab2)。其中Ab2 0具有抗原「內影像」的作用，可模擬抗原誘導機體產生針對始動抗原的特異性抗體或細胞免疫應答。並抑制Abl與相應抗原的結合反應。應用Ab20的這一特性，研製的抗獨特型抗體可代替抗原刺激機體，通過誘導機體的免疫反應建立針對抗原的免疫效應，從而達到預防疾病的目的。並且，抗獨特型抗體可在自身體內、同類系、同種異體以及異種動物中誘導產生。抗獨特型抗體疫苗主要優點是它可模擬抗原的結構但不含抗原的有毒成分，是一種無毒副作用、安全有效的疫苗。如果將全分子的抗獨特型抗體接種免疫人體，會使人體產生抗IgG抗體。本發明特徵在於A群腦膜炎球菌CMCC29201、C群腦膜炎球菌CMCC29205、W135群腦膜炎球菌CMCC (B) 29037,Y群腦膜炎球菌CMCC (B) 29028，進行擴增培養後，將菌液腹腔注射免疫Ba/b/c小鼠,取免疫後小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合,進行培養，用酶聯免疫法(ELISA法)檢測陽性克隆，將確定為陽性的孔用有限稀釋法，進行克隆化，再將陽性克隆的雜交瘤細胞株擴增培養，腹腔注射接種到Ba/b/c小鼠製備出腹水型單抗，將以上單抗用ELISA法進行效價及亞類實驗。挑選有較高保護率的單抗進行純化，進行保護實驗，以每隻小鼠10 100 y g的量，腹腔注射免疫小鼠，然後進行細胞融合，篩選出能穩定分泌抗獨特型單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將細胞株擴增培養，調整為lX106/ml，以每隻小鼠0. 5ml量，腹腔注射接種到Ba/b/c小鼠，製備腹水型抗獨特型單克隆抗體，採用ELISA法，對以上單抗進行亞類、效價及3型抗獨特型單克隆抗體鑑定。結果顯示，A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗1A11、1C5，C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中·有4株單抗1D7、4E8、3F6、2F6，W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗1A2、3F6，Y群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗3D1、1E7，均能特異性地與抗原(病菌)競爭與Abl (腹水型單克隆抗體)結合，用這些單抗免疫小鼠，可從小鼠血液中檢測到抗病菌的的抗體，說明以上單抗為P型抗獨特型單克隆抗體，用以上單抗與不完全弗氏佐劑(I : I I : 2)混合，腹腔注射小鼠，對照組用生理鹽水取代單抗。免疫一個月後，用致死量病菌腹腔注射感染小鼠，觀察疫苗對小鼠的保護作用。結果顯示，A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中2株單抗1A11、1C5對小鼠的保護率分別為81 %和69% ;C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中4株單抗1D7、4E8、3F6、2F2對小鼠的保護率分別為52%、43%、78%和69%;W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中2株單抗1A2、3F6對小鼠的保護率分別為86%和70%，群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中2株單抗3D1、1E7對小鼠的保護率分別為76%和74%，挑選出保護率較高的抗獨特型單克隆抗體以一定比例配製成疫苗。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明進行詳細說明(一)材料I.菌種A群腦膜炎球菌CMCC29201、C群腦膜炎球菌CMCC29205、W135群腦膜炎球菌CMCC(B) 29037,Y群腦膜炎球菌CMCC(B) 29028購自北京生物製品公司。以上菌種用作
免疫原產生單克隆抗體。2.細胞瘤SP2/0小鼠骨髓瘤細胞株，由第四軍醫大學細胞工程中心惠贈。(二)方法I.免疫原細菌的製備及滅活A群腦膜炎球菌CMCC29201、C群腦膜炎球菌CMCC29205、Wl35群腦膜炎球菌CMCC (B) 29037、Y群腦膜炎球菌CMCC (B) 29028接種於含10 %羊血普通瓊脂培養基，35 37°Cニ氧化碳的環境，中培養16 20小時，無菌生理鹽水洗脫菌苔，3000rpm離心20分鐘，棄上清，加入I %的甲醒固定過夜，3000rpm離心20分鐘,棄上清,家無菌生理鹽水，比比池計數後，4 °C保存。2. Ba/b/c小鼠的免疫8周齡的Ba/b/c雌性小鼠10隻，將以上滅活的細菌菌液(lX108/ml)以0. 5ml/只得量，腹腔注射免疫小鼠，於第一次免疫後第7、14、28天分別追加免疫，第31天取脾細胞進行細胞融合。3.細胞融合
(I)免疫脾細胞的製備a.取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養液的平皿中，置於200目的不鏽鋼網上。用注射器內芯研磨脾臟，並用平皿內不完全培養液輕輕衝洗網，使脾細胞全部通過網孔到平皿的溶液中。b.將脾細胞懸液轉入50ml離心管中，加不完全培養液至30ml，混勻，IOOOrpm離心
5分鐘，棄去上清。c.用不完全培養液將沉澱細胞再離心洗滌一次(重複步驟b)，將細胞懸至10ml，混勻，用細胞計數板計數。(2) SP2/0小鼠骨髓瘤細胞懸液的製備a.將4瓶擴增培養的骨髄瘤細胞收集到50ml離心管中。b. IOOOrpm離心5分鐘,棄去上清。c.加入30ml不完全培養液，重複步驟b再離心洗滌一次，然後將細胞懸至10ml，混勻，計數。(3)細胞融合a.分別取含I X IO8個脾細胞懸液和含2 3X IO7個骨髓瘤細胞懸液，加入到50ml離心管中，加入不完全培養液至30ml，充分混勻。b. IOOOrpm離心7分鐘,棄去上清。c.加 50% 的融合劑 PEGO. 7ml.d.加入25ml不完全培養液，使PEG稀釋而失去促融作用。e. 800rpm離心7分鐘，棄去上清。f.加入20mlHAT培養液，並使溶液呈均勻混懸液。g.將細胞懸液積極加入鋪有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0. 1ml，在37°C含5% CO2的孵箱中培養。4.抗體檢測——間接ELISA法(I)用已知抗原滅活菌包被。(2)加有克隆生長的孔中的培養上清100 ill。(3)加酶標單抗鼠IgG抗體100 ill。(4)加底物液100 U 1，室溫避光顯色10 20分鐘。(5)結果在酶聯免疫檢測儀492nm波長下測定OD值，空白對照調零，若待測孔OD值大於或等於陰性對照孔2. I倍，即為陽性克隆。5.克隆化——有限稀釋法
將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細胞吹打混勻後計數，並採取有限稀釋法逐級稀釋，再加到96孔板中進行培養。觀察克隆生長，記錄單克隆孔，並及時進行陽性檢測，將陽性單克隆的細胞轉到24孔板培養，待其增殖到一定數量後再轉入細胞瓶中擴大培養。6.雜交瘤細胞的凍存將成對數生長的雜交瘤細胞收集入離心管，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入Iml凍存液混勻，移入凍存管，在_70°C低溫冰箱過夜後移入液氮罐長期保存。7.腹水型單克隆抗體製備將培養的雜交瘤細胞移入離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，收集上清做亞型實驗，加無血清培養液到沉澱的細胞中，調整細胞數為lX106/ml，每隻Ba/b/c小鼠注射0. 5ml,接種雜交瘤細胞後7 14天，處死小鼠後抽腹水，離心，收集上清，分裝後_20°C凍存備用。 8.單克隆抗體的鑑定抗A群腦膜炎球菌單克隆抗體中篩選到3株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為2A8、2D10和IFlI，經亞類鑑定2A8為IgG3，2D10和IFll為IgG2b，經效價測定，效價為I X 10_5 I X 10_7。抗C群腦膜炎球菌單克隆抗體中篩選到6株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為1A11、3C7、4E1、8F1、1G1和1G6，經亞類鑑定為其中1A11、8F1、1G1和1G6為IgGl，3C7和4E1為IgG2d,經效價測定，效價為I X 10_5 I X 10'抗W135群腦膜炎球菌單克隆抗體中篩選到2株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為1B55D1，經亞類鑑定為1B5為IgG3，5Dl為IgGl，經效價測定，效價為IXKT6 1X10'抗Y群腦膜炎球菌單克隆抗體中篩選到3株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為1G9、4F1和6F1，經亞類鑑定為其中1G9為IgGl，4Fl和6F1為IgG2a，經效價測定，效價為I X 10_6 I X 10_7。(三)抗獨特型單克隆抗體的製備I.動物免疫將以上單抗進行純化，以腹腔注射免疫小鼠，第一次免疫500 iil/只小鼠(lOOiig/抗體蛋白/只)。在第一次免疫後的第2、4、6周及細胞融合前3天，分別以同樣方法各追加免疫一次。2.細胞融合(I)免疫脾細胞的製備a.取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養液的平皿中，置於200目的不鏽鋼網上。用注射器內芯研磨脾臟，並用平皿內不完全培養液輕輕衝洗網，使脾細胞全部通過網孔到平皿的溶液中。b.將脾細胞懸液轉入50ml離心管中，加不完全培養液至30ml，混勻，IOOOrpm離心
5分鐘，棄去上清。c.用不完全培養液將沉澱細胞再離心洗滌一次(重複步驟b)，將細胞懸至10ml，混勻，用細胞計數板計數。(3) SP2/0小鼠骨髓瘤細胞懸液的製備a.將4瓶擴增培養的骨髓瘤細胞收集到50ml離心管中。
b. IOOOrpm離心5分鐘,棄去上清。c.加入30ml不完全培養液，重複步驟b再離心洗滌一次，然後將細胞懸至10ml，混勻，計數。(3)細胞融合a.分別取含I X IO8個脾細胞懸液和含2 3X IO7個骨髓瘤細胞懸液，加入到50ml離心管中，加入不完全培養液至30ml，充分混勻。
b. IOOOrpm離心7分鐘，棄去上清。c.加 50% 的融合劑 PEGO. 7ml.d.加入25ml不完全培養液，使PEG稀釋而失去促融作用。e. 800rpm離心7分鐘,棄去上清。f.加入20mlHAT培養液，並使溶液呈均勻混懸液。g.將細胞懸液積極加入鋪有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0. 1ml，在37°C含5% CO2的孵箱中培養。3.抗獨特型抗體檢測——雙抗夾心ELISA法(I)用純化後的兔抗病菌菌抗體包被酶標板。(2)加有克隆生長的孔中的培養上清100 ill。(3)加酶標單抗鼠IgG抗體100 ill。(4)加底物液100 U 1，室溫避光顯色10 20分鐘。(5)結果在酶聯免疫檢測儀492nm波長下測定OD值，空白對照調零，若待測孔OD值大於或等於陰性對照孔2. I倍，即為陽性克隆。4.克隆化將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細胞吹打混勻後計數，並採取有限稀釋法逐級稀釋，再加到96孔板中進行培養。觀察克隆生長，記錄單克隆孔，並及時進行陽性檢測，將陽性單克隆的細胞轉到24孔板培養，待其增殖到一定數量後再轉入細胞瓶中擴大培養。5.雜交瘤細胞的凍存將成對數生長的雜交瘤細胞收集入離心管，IOOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入Iml凍存液混勻，移入凍存管，在-70°C低溫冰箱過夜後移入液氮罐長期保存。6.腹水型單克隆抗體製備將培養的雜交瘤細胞移入離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，收集上清做亞型實驗，加無血清培養液到沉澱的細胞中，調整細胞數為lX106/ml，每隻Ba/b/c小鼠注射0. 5ml,接種雜交瘤細胞後7 14天，處死小鼠後抽腹水，離心，收集上清，分裝後_20°C凍存備用。7.鑑定A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中篩選到2株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為1A11UC5，經亞類鑑定為IgG3，經效價測定，效價為1X10_4 1X10'C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中篩選到4株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為1D7、4E8、3F6、2F6，經亞類鑑定為其中1D7、3F6和2F2為IgG2a，4E8為IgGl，經效價測定，效價為I X 10_5 I X 10_6。W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中篩選到2株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為1A2、3F6，經亞類鑑定為其中1A2為IgG2a，3F6為IgG3，經效價測定，效價為1X10—4 1X10-5。Y群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中篩選到2株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為3D1、1E7，經亞類鑑定為其中3D1為IgGl，lE7為IgG3，經效價測定，效價為 IXKT5 1X10'8. ^型抗獨特型抗體的鑑定經競爭抑制測定顯示A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體IAll和1C5能有效抑制抗原與Abl結合，抑制率達到70%以上，而且抑制率隨Abl濃度的下降而降低，說明這兩株單抗與抗原識別相同的Abl表位，能有效地與抗原競爭Abl結合表位，是P型A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體。
C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中1D7、4E8、3F6、2F6能有效抑制抗原與Abl結合，抑制率達到70%以上，而且抑制率隨Abl濃度的下降而降低，說明這兩株單抗與抗原識別相同的Abl表位，能有效地與抗原競爭Abl結合表位，是P型A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體。W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中1A2、3F6能有效抑制抗原與Abl結合，抑制率達到70%以上，而且抑制率隨Abl濃度的下降而降低，說明這兩株單抗與抗原識別相同的Abl表位，能有效地與抗原競爭Abl結合表位，是P型A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體。Y群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中3D1、1E7能有效抑制抗原與Abl結合，抑制率達到70%以上，而且抑制率隨Abl濃度的下降而降低，說明這兩株單抗與抗原識別相同的Abl表位，能有效地與抗原競爭Abl結合表位，是P型A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體。9.以抗獨特型單克隆抗體為免疫原誘導產生抗體試驗(I)以腹水型Ab2為免疫原免疫小鼠，每次免疫量及追加免疫次數同Ab2的製備。第四次免疫5天後，收集抗血清(Ab3)。(2)Ab3的檢測——間接ELISA法a.用已知抗原滅活菌包被。b.加有克隆生長的孔中的培養上清100 ill。c.加酶標單抗鼠IgG抗體100 ill。d.加底物液100 U 1，室溫避光顯色10 20分鐘。e.結果在酶聯免疫檢測儀492nm波長下測定OD值，空白對照調零，若待測孔OD值大於或等於陰性對照孔2. I倍，即為陽性克隆。(3)由A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體IAll和1C5誘導產生的鼠血清中含有抗A群腦膜炎球菌的抗體Ab3，OD值分別是對照孔2. I倍以上，其效價為I : 100 I 1000。(4)由C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體1D7、4E8、3F6、2F2誘導產生的鼠血清中含有抗C群腦膜炎球菌的抗體Ab3，OD值分別是對照孔2. I倍以上，其效價為I : 100 I 1000。(5)由W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體1A2、3F6誘導產生的鼠血清中含有抗W135群腦膜炎球菌的抗體Ab3，OD值分別是對照孔2. I倍以上，其效價為I : 100 I 1000。(6)由Y群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體3D1、1E7誘導產生的鼠血清中含有抗Y群腦膜炎球菌的抗體Ab3，0D值分別是對照孔2. I倍以上，其效價為I : 100 I : 1000。10.抗獨特型單克隆抗體疫苗的保護試驗(I)方法抗獨特型單克隆抗體和弗氏不完全佐劑I : I混合，腹腔注射免疫小鼠0.05ml/只(含單抗10 20 y g)，免疫ー個月後，用致死量的病菌腹腔注射攻擊小鼠，觀察抗獨特型單克隆抗體的保護作用。 保護率的計算公式免疫保護率=(實驗組存活率-對照組存活率)/對照組死亡率X 100 %(2)結果A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗1A11UC5對小鼠的保護率分別為81%和69% ；C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有4株單抗1D7、4E8、3F6、2F6對小鼠的保護率分別為52 %、43 %、78 %和69 % ；W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗1A2、3F6對小鼠的保護率分別為86%和70% ;Y群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗3D1、1E7對小鼠的保護率分別為76%和74%。同樣條件分別進行三次實驗，挑選出保護率達最高的抗獨特型單克隆抗體以ー定比例配製成疫苗。
11.製備成品將A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中IAl I，C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中3F6，W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中1A2，Y群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中3D1，以等效價I : I : I : I的比例混合，製成腦膜炎球菌疫苗，達到了製備有效腦膜炎球菌疫苗的目的。
權利要求
1.一種腦膜炎球菌疫苗，其特徵在於將A群腦膜炎球菌CMCC29201、C群腦膜炎球菌CMCC29205、W135群腦膜炎球菌CMCC (B) 29037、Y群腦膜炎球菌CMCC (B) 29028，分別進行擴增培養後，腹腔注射免疫Ba/b/c小鼠，取免疫後小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，進行培養，用酶聯免疫法(ELISA法)檢測陽性克隆，進行克隆化，再將陽性克隆的雜交瘤細胞株擴增培養，免疫小鼠製備出腹水型單抗，將以上單抗用ELISA法進行效價及亞類實驗，挑選有較高保護率的單抗進行純化，腹腔注射接種到Ba/b/c小鼠，製備腹水型抗獨特型單克隆抗體，採用ELISA法，對以上單抗進行亞類、效價及P型抗獨特型單克隆抗體鑑定；結果顯示，A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗1A11、1C5，C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有4株單抗1D7、4E8、3F6、2F6，W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗1A2、3F6，Y群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗3D1、1E7，均能特異性地與抗原(病菌)競爭與Abl (腹水型單克隆抗體)結合，用這些單抗免疫小鼠，可從小鼠血液中檢測到抗病菌的的抗體，說明以上單抗為P型抗獨特型單克隆抗體，以上單抗腹腔注射免疫小鼠，觀察疫苗對小鼠的保護作用；結果顯示，A群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗1A11、1C5對小鼠的保護率分別為81 %和69% ;C群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有4株單抗1D7、4E8、3F6、2F2對小鼠的保護率分別為52%、43%、78%和69% ；W135群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗1A2、3F6對小鼠的保護率分別為86%和70% ;Y群腦膜炎球菌抗獨特型單克隆抗體中有2株單抗3D1、1E7對小鼠的保護率分別為76%和74%，挑選出保護率最高的抗獨特型單克隆抗體以一定比例配製成疫苗。
全文摘要
腦膜炎球菌抗獨特型抗體疫苗，屬於生物製藥領域，主要涉及腦膜炎球菌疫苗及其製備方法，將A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌、W135群腦膜炎球菌、以及Y群腦膜炎球菌分別免疫小鼠，進行細胞融合，再克隆化，製備出特異性強、效價較高的單克隆抗體，再純化抗體、免疫小鼠，篩選出抗獨特型單克隆抗體，挑選出保護率最高的抗獨特型單克隆抗體以一定比例配製成疫苗。
文檔編號A61K39/095GK102755643SQ20111010585
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者侯忠玲, 劉麗文, 楊力軍, 秦紅, 黃威權 申請人:秦紅, 黃威權