一種螢光標記的X-InDel位點複合擴增系統及其應用的製作方法
2023-08-09 18:34:11
一種螢光標記的X-InDel位點複合擴增系統及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種螢光標記的X-InDel位點複合擴增系統,該系統可複合擴增18個X染色體上的插入缺失遺傳多態性位點。這18個位點分別用FAM、HEX和TAMRA三種螢光素標記。該複合擴增系統靈敏度高,個體識別率高,且多態性高、穩定性、重複性好,分型結果準確,能滿足實際需要。基於本發明的複合擴增系統可製成試劑盒,用於親子鑑定、二聯體親子鑑定、祖孫鑑定、同胞鑑定、個體識別,為人類學、醫學遺傳學等領域提供新的技術手段。
【專利說明】—種螢光標記的XHnDeI位點複合擴增系統及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測人類基因組中具有多態性的遺傳標記,尤其涉及一種通過複合擴增18個插入缺失遺傳多態性標記(Insert1n/Delet1n, InDel)來進行突光標記複合擴增系統及其應用。
【背景技術】
[0002]STR (Short Tandem Repeats, STR)分型技術是目前法醫生物學研究和鑑定普遍採用的技術手段。就目前而言,STR分型被認為是法醫DNA鑑定中最標準、最權威的途徑和方法,能夠解決大多數的實際問題。但是,隨著STR基因座在法醫DNA分析中的廣泛應用,其缺陷也日益受到學界關注。如STR基因座的高突變率不利於親權鑑定的結果解釋;PCR擴增子較長不易實現對降解檢材的DNA分型;STR基因座的數量有限不利於複雜親緣關係的鑑定等。
[0003]SNP (Single Nucleotide Polymorphism,單核苷酸多態性)作為第三代遺傳標記,應用於法醫學實踐的優越性已越發顯著。與STR (自發突變率為10_3~10_5)相比,SNP具有相對較低的自發突變率(10_8);而單個的SNP位點擴增產物可以控制在200bp以下,容易實現多個位點的複合擴增,並有利於降解檢材的分型;二等位基因的特性也使其分型結果的分析簡便易行,更加容易完成向自動化的轉變。然而SNP分型採用的技術平臺無論是Minisequencing (核心是單鹼基延伸)、連接反應還是質普分析,要麼需要特殊儀器設備(如SNPStream, MALD1-T0F質普儀),要麼核心技術為國外技術公司掌握(如SNPlex),它們普遍具有儀器昂貴,使用成本高,操作繁瑣或通量小等一些限制性特徵,並不適合在常規的法醫學實驗室推廣。
[0004]近年來,InDel這種新型的遺傳標記受到了越來越多的關注,其在法醫生物學領域的應用也具有廣闊的前景。InDel (Insert1n/Delet1n Polymorphism)是一種特殊類型的二等位基因遺傳標記,具有較低的自發突變率和較小的擴增產物片段,兼具了 STR和SNP兩種遺傳標記的優勢,以這種遺傳標記為分型標準的法醫生物學分型試劑盒將為法醫生物學的研究與法醫DNA鑑定的應用提供更為便捷有效的分型分析途徑。自2006年起,國內外對常染色體InDel的法醫學研究就如火如荼的展開了,較為典型的是Pereira等人與Edelmann等人於2009年建立了一個包含38個常染色體InDel位點的可用於個體識別目的的複合擴增體系,以及李成濤等建立的一個包含30個常染色體InDel位點的複合擴增體系,均系採用多色螢光標記,毛細管電泳,依靠插入缺失片段的大小就可以實現快速、準確的進行分型,體現出了 InDel遺傳標記在法醫學中應用的優越性。
[0005]X染色體有著特殊的遺傳方式,在一些特殊的親權鑑定案件中(祖母-孫女關係鑑定、同父異母姐妹關係鑑定),常染色體上的遺傳標記應用價值就很有限,X染色體上的遺傳標記在這樣的親緣關係鑑定中重要的應用價值就得以凸顯。另外,在普通的父-女、母-兒子(或女兒)親子鑑定中,遇到由於突變導致I~2個基因座不符合孟德爾遺傳規律的現象較為多見,客觀上也需要X染色體上的遺傳標記構成的分型系統來補充當前常染色體上遺傳標記系統的不足。因此,法醫物證學迫切需要建立以X染色體上遺傳標記為分型基礎的基因型檢測方法和體系,來克服目前常用系統帶來的不足,並改變當前司法檢驗鑑定工作的被動局面。對於新興的遺傳標記InDel在X染色體上的研究在國際上已有一些成果的發表,但國內相關的研究還是相對欠缺,甚至連亞洲人群的數據都相對較為稀少。所以,研製針對中國人群的X-1nDel (X染色體上的InDel)多態分型系統可以說是當務之急也是大勢所趨。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於針對現有技術的不足,提供一種在中國人群中具有高個體識別率的X-1nDel位點(X染色體上的InDel位點)並建立相應的螢光標記複合擴增系統。
[0007]本發明的第一個目的是提供一種螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統,包括包括針對X-1nDel位點設計的突光標記的引物;其中,所述X-1nDel位點為如下18個X染色體上的 InDel 位點=X-1nDel-Ol (rs25581)、X-1nDel-02 (rs363794)、X-1nDel-03(rs2308033)、 X-1nDel-04 (rs2308280)、 X-1nDel-05 (rs3047852)、 X-1nDel-06(rs3048996)、 X-1nDel-07 (rs3080039), X-1nDel-08 (rs3215490)、 X-1nDel-09(rs5901519)、 X-1nDel-1O (rs5903978)、 X-1nDel-1l (rs35574346)、 X-1nDel-12(rs45409991)、X-1nDel-13 (rs55877732)、X-1nDel-14 (rs57608175)、X-1nDel-15(rs59400186)、X-1nDel-16 (rs60283667)、X-1nDel-17 (rs66676381)、X-1nDel-18(rs72417152),括號中的rs號表示該位點在dbSNP資料庫的編號。
[0008]其中,X-1nDel位點所對應的引物序列優選為如下所示:
[0009]X-1nDel-Ol 位點的引物序列 F:5』-CCTTTCTTGCACATTCTAGCTGAAC-3』,R:5,-GGGGTGGTGACAGAAGGGAAT-3,;
[0010]X-1nDel-02 位點的引物序列 F:5』-TGGTCTCTGGAGTGCAATTTTAAGTC-3』,R:5』-CCAAGCCAGCCATTTGTTCTTC-3』 ;
[0011]X-1nDel-03 位點的引物序列 F:5』 -ATGGCATTTAGTCTCAGGTCTGCTTA-3』,R:5』 -CAACTGGTCCACCCTAACTGTATCC-3』 ;
[0012]X-1nDel-04 位點的引物序列 F:5』 -CTACCAACAAAATCCATTCTGGAATAA-3』,R:5』 -GTTTTATAGCAACACAAAATTGACTAAGACA-3』 ;
[0013]X-1nDel-05 位點的引物序列 F:5』 -TTCCCAGATTTGAAATGTATGAAACTCT-3』,R:5』 -CCTTAGTGCCTTGTTAGAAGGAATGA-3』 ;
[0014]X-1nDel-06 位點的引物序列 F:5』 -TGAATATACTGCAGGGTTCTGTTACAAC-3』,R:5』 -AGATAGACAGGAGATGAGTGAATGGCT-3,;
[0015]X-1nDel-07 位點的引物序列 F:5』 -ACCTTGGACAAAGTTACTTAGCTGCT-3』,R:5』 -TAGCAAGTCACACATGGATGAGAAA-3,;
[0016]X-1nDel-08 位點的引物序列 F:5』 -TCATCTATATTGAGTCAGCATTTGAACC-3』,R:5』 -CAGAATCTCTGGAAACACTTGGTAGAA-3』 ;
[0017]X-1nDel-09 位點的引物序列 F:5』-TTGACGGGAATTGAGTCACCTG-3』,R:5,-CTAAGGACAGCCTGAATCCCAGAT-3,;
[0018]X-1nDel-1O 位點的引物序列 F:5』-TGTACCACTGTAAAGCCCCCG-3』,R:5』-GCTGCATTGTCTGGCAATGAA-3』 ;
[0019]X-1nDel-1l 位點的引物序列 F:5』 -ACTGGTAGGATCTGGAACATCTGC-3』,R:5』 -TGACTGTGGGCTTAAATCAAAACTT-3,;
[0020]X-1nDel-12 位點的引物序列 F:5』-CCGAGTAGAGCTTAACATTTATACCTG-3』,R:5』-AGACATGATTGTGCCACTGGATTT-3』 ;
[0021]X-1nDel-13 位點的引物序列 F:5』 -ACCCTAGTTCTACAAAGCGCAAGTC-3』,R:5』 -AAACATTTTTCAAGGGCAATGATGT-3』 ;
[0022]X-1nDel-14 位點的引物序列 F:5』 -CAAATTGACTA TAGCCTTCCACCCT-3』,R:5』 -TGCCTTCCTCTCATTGACTTCATAA-3』 ;
[0023]X-1nDel-15 位點的引物序列 F:5』 -TGTCACCACATTTCCTTCTGGGTA-3』,R:5』 -TCACTTCCATTTGGCTTACTTCCTC-3』 ;
[0024]X-1nDel-16 位點的引物序列 F:5』 -CCTTATTTTGTGCCTTTTATTCTTGG-3』,R:5』 -TCCTCTAAATTGGGGACCTATGTGTA-3』 ;
[0025]X-1nDel-17 位點的引物序列 F:5』-CTTTGGGTGATAGGAGGTTTTGC-3』,R:5』-AACCCCTGGTGCTGTGTGTAAAT-3』 ;
[0026]X-1nDel-18 位點的引物序列 F:5』 -TGTAAAGCTACACCAATGGACAGATG-3』,R:5』 -TGCAAAGATTAAGTGCATTTTCTCTG-3』 。
[0027]其中,F為上遊引物(Forward primer), R 為下遊引物(Reverse primer)。
[0028]優選地,所述18個X-1nDel位點引物分別用FAM、HEX和TAMRA三種螢光素標記。
[0029]優選地,突光素標記X-1nDel位點弓丨物,具體如下:FAM標記X-1nDel-02、X-1nDel-03、X-1nDel-06、X-1nDel-07、X-1nDel-09、X-1nDel-1O 和 X-1nDel-17 ;HEX 標記X-1nDel-04、X-1nDel-08、X-1nDel-12、X-1nDel-13和X-1nDel-15 ;TAMRA標記X-1nDel-Ol、X-1nDel-05、X-1nDel-ll、X-1nDel-14、X-1nDel-16 和 X-1nDel-18。
[0030]本發明還可以採用第四種螢光素用於內標的標記,其中第四種螢光素可以為LIZ、SIZ 等。
[0031]優選地,上述18個X-1nDel位點是在一個複合擴增體系中同時擴增,從而可同時分析多個X染色體的InDel位點。
[0032]本發明的第二個目的是提供一種基於上述螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統的試劑盒,該試劑盒包括總體積為10-25 μ L的PCR反應體系,其中,該PCR反應體包括PCR 反應緩衝液(Buffer) 2-7.5 μ L,引物混合物(Primer pair Mix) 1_3.0 μ L,DNA 聚合酶1-2.5 μ L,模板DNA1-3.0 μ LL,和餘量水;其中,所述引物混合物包括針對X-1nDel位點設計的螢光標記的引物序列。
[0033]本發明的第三個目的是提供上述螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統在三聯體親子鑑定、二聯體親子鑑定、祖孫鑑定、同胞鑑定、個體識別以及製備疾病診斷工具中的應用。
[0034]與現有技術相比,本發明具有如下有益效果:
[0035]1、高靈敏度:本發明研製的18個InDel位點螢光複合擴增系統在模板量為200pg時仍可檢出全部的18個InDel位點。
[0036]2、高個體識別率:本發明研製的這18個InDel位點在上述5個民族的累積個體識別效能(CDP 值)分別達到 7 0.99999999690、0.99999999580、0.99999999739、
0.99999999629,0.99999999518,這表明該InDel系統完全適用於中國這5個主要民族個體的法醫學DNA鑑定。
[0037]3、本發明所研製的18個InDel位點螢光複合擴增系統在實驗室用於檢案,結果表明該系統多態性高、穩定性、重複性好,分型結果準確,能滿足實際需要。
[0038]4、本發明在國內首先研製出一組18個X染色體InDel位點在單一反應管中實現複合擴增的三色螢光標記複合擴增檢測系統。
[0039]5、本發明的螢光標記引物複合擴增技術快速、簡便,PCR產物可用310、3100、3130,3500等遺傳分析儀電泳,結果自動分析,能標準化,可以保證不同實驗室數據比較的正確性。
[0040]6、本發明可製備一套試劑盒,可進行商品化,可以填補國內沒有X染色體InDel位點螢光複合擴增試劑盒的空白,也可補充目前STR螢光檢測試劑盒的不足,作為有中國特色的InDel位點螢光複合擴增試劑盒,可用於三聯體親子鑑定、二聯體親子鑑定、祖孫鑑定、同胞鑑定以及個體識別、疾病診斷和人類學等領域中。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]圖1為實施例1中18個X-1nDel位點的分型效果圖。
【具體實施方式】
[0042]下面將結合具體的實施例對本發明作進一步的說明,以更好地理解本發明。
[0043]一、本發明複合擴增系統中18個X-1nDel位點的選擇
[0044](I) X-1nDel位點的篩選原則
[0045]①X-1nDel等位基因片段長度差異(插入或缺失的鹼基)≥3bp且< 30bp。
[0046]②為儘可能避免篩選的InDel位點與某些特殊的疾病表型相關聯,限制其為X染色體的內含子區域;
[0047]③dbSNP資料庫中該位點的最低等位基因頻率(Minor Allele Frequency, MAF)介於0.20~0.50 (以東亞人群為基準,兼顧其他人種);
[0048]④總位點數不少於15個,累積個體識別率達到0.9999以上;
[0049]⑤在中國漢族人群中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。
[0050](2)多重PCR引物的螢光標記
[0051]由於需要對18個InDel位點進行複合擴增,並對等位基因片段長度差異和擴增子長度的限制,多重PCR體系構建時要進行多重螢光標記本發明採用3色螢光標記,在選擇螢光標記時考慮以下要素:
[0052]①每種螢光素的激發光光譜間隔應儘可能均勻,且其間隔最好是不少於20nm,以達到最佳的分離效果;
[0053]②一種螢光素的激發光光譜與另一種螢光素的吸收光光譜儘可能不重疊,以減少相互間的幹擾;
[0054]③螢光素可通過商業途徑獲得,不受專利保護;
[0055]④由於未來的應用主要依據美國AB公司的遺傳分析儀,要求所選擇的螢光素在美國AB公司的遺傳分析儀上適用。
[0056]根據上述原則,本發明採用的InDel位點為X-1nDel-Ol (rs25581)、X-1nDel-02(rs363794)、X-1nDel-03(rs2308033)、X-1nDel-04(rs2308280)、X-1nDel-05(rs3047852)、X-1nDel-06 (rs3048996)、X-1nDel_07 (rs3080039)、X-1nDel_08 (rs3215490)、X-1nDel_09(rs5901519)、 X-1nDel-1O (rs5903978)、 X-1nDel-1l (rs35574346)、 X-1nDel-12(rs45409991)、X-1nDel-13 (rs55877732)、X-1nDel-14 (rs57608175)、X-1nDel-15(rs59400186), X-1nDel-16 (rs60283667), X-1nDel-17 (rs66676381)、X-1nDel-18(rs72417152),括號中的rs號表示該位點在dbSNP資料庫的編號。
[0057]本發明的18個InDel位點分別採用FAM、HEX和TAMRA三種不同顏色的螢光素標記(第四種螢光用於內標的標記如LIZ、SIZ等)=FAM標記X-1nDel-02、X-1nDel-03、X-1nDel-06、X-1nDel-07、X-1nDel-09、X-1nDel-1O 和 X-1nDel-17 ;HEX 標記 X-1nDel-04、X-1nDel-08、X-1nDel-12、X-1nDel-13 和 X-1nDel-15 ;TAMRA標記X-1nDel-01、X-1nDel_05、X-1nDel-ll、X-1nDel-14、X-1nDel-16 和 X-1nDel-18。
[0058]二、本發明體系中18個X-1nDel位點的複合擴增與檢測
[0059]本發明的複合擴增系統是採用複合PCR技術在同一 PCR反應管中同時擴增上述18個X-1nDel位點,從而可同時分析多個X染色體的InDel位點。
[0060]複合擴增體系中的X-1nDel位點被位於該位點兩側的一對引物擴增,其中每對引物中的正鏈或反鏈的5'端用相應的螢光素標記即用FAM、HEX和TAMRA標記,全部18個InDeI位點的弓丨物按照比例混合在一個試管中。
[0061]1、PCR反應體系
[0062]反應總體積為10-25 μ L,包括PCR反應緩衝液(Buffer) 2-7.5 μ L,引物混合物(Primer pair Mix) 1-3.0 μ L,DNA 聚合酶 1-2.5U,模板 DNA1-3.0 μ L,超純水補足至總體積。
[0063]2、PCR擴增參數
[0064]在9700或其他型號的PCR儀上進行擴增,多重PCR擴增參數為:95°C 15min ;94°C 30sec、65°C 90sec、72°C、90sec,共進行 30 個循環;60°C延伸 60min。
[0065]3、結果分析
[0066]①樣品製備
[0067]
【權利要求】
1.一種螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統,其特徵在於,包括針對X-1nDel位點設計的螢光標記的引物;其中,所述X-1nDel位點為如下18個X染色體上的InDel位點:X-1nDe1-01(rs25581)、X-1nDel-02(rs363794)、X-1nDel-03(rs2308033)、X-1nDe1-04(rs2308280)、 X-1nDe1-05(rs3047852)、 X-1nDe1-06(rs3048996)、X-1nDe1-07(rs3080039)、 X-1nDe1-08(rs3215490)、 X-1nDe1-09(rs5901519)、X-1nDel-1O(rs5903978)、X-1nDel-1 I (rs35574346)、X-1nDel-12 (rs45409991)、X-1nDel-13(rs55877732)、 X-1nDel-14(rs57608175)、 X-1nDel-15(rs59400186)、X-1nDel-16 (rs60283667)、X-1nDel-17 (rs66676381)、X-1nDel-18 (rs72417152),括號中的rs號表不該位點在dbSNP資料庫的編號。
2.根據權利要求1所述的螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統,其特徵在於,所述18個X-1nDel位點是在一個複合擴增體系中同時擴增。
3.根據權利要求1所述的螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統,其特徵在於,X-1nDel位點所對應的引物序列如下所示: X-1nDel-Ol 位點的引物序列 F:5 ' -CCTTTCTTGCACATTCTAGCTGAAC-3 ',R:5' -GGGGTGGTGACAGAAGGGAAT-3'; X-1nDel-02 位點的引物序列 F:5 ' -TGGTCTCTGGAGTGCAATTTTAAGTC-3 ',R:5' -CCAAGCCAGCCATTTGTTCTTC-3'; X-1nDel-03 位點的引物序列 F:5' -ATGGCATTTAGTCTCAGGTCTGCTTA-3' ,R:5/ -CAACTGGTCCACCCTAACTGTATCC-3'; X-1nDel-04 位點的引物序列 F:5' -CTACCAACAAAATCCATTCTGGAATAA-3' ,R:5/ -GTTTTATAGCAACACAAAATTGACTAAGACA-3'; X-1nDel-05 位點的引物序列 F:5' -TTCCCAGATTTGAAATGTATGAAACTCT-3' ,R:5/ -CCTTAGTGCCTTGTTAGAAGGAATGA-3'; X-1nDel-06 位點的引物序列 F:5' -TGAATATACTGCAGGGTTCTGTTACAAC-3' ,R:5/ -AGATAGACAGGAGATGAGTGAATGGCT-3'; X-1nDel-07 位點的引物序列 F:5' -ACCTTGGACAAAGTTACTTAGCTGCT-3' ,R:5/ -TAGCAAGTCACACATGGATGAGAAA-3'; X-1nDel-08 位點的引物序列 F:5' -TCATCTATATTGAGTCAGCATTTGAACC-3' ,R:5/ -CAGAATCTCTGGAAACACTTGGTAGAA-3'; X-1nDel-09 位點的引物序列 F:5 ' -TTGACGGGAATTGAGTCACCTG-3 ',R:5' -CTAAGGACAGCCTGAATCCCAGAT-3'; X-1nDel-1O 位點的引物序列 F:5 ' -TGTACCACTGTAAAGCCCCCG-3 ',R:5' -GCTGCATTGTCTGGCAATGAA-3'; X-1nDel-1l 位點的引物序列 F:5' -ACTGGTAGGATCTGGAACATCTGC-3' ,R:5/ -TGACTGTGGGCTTAAATCAAAACTT-3'; X-1nDel-12 位點的引物序列 F:5 ' -CCGAGTAGAGCTTAACATTTATACCTG-3 ',R:5' -AGACATGATTGTGCCACTGGATTT-3'; X-1nDel-13 位點的引物序列 F:5' -ACCCTAGTTCTACAAAGCGCAAGTC-3' ,R:5/ -AAACATTTTTCAAGGGCAATGATGT-3';X-1nDel-14 位點的引物序列 F:5' -CAAATTGACTATAGCCTTCCACCCT-3' ,R:5/ -TGCCTTCCTCTCATTGACTTCATAA-3'; X-1nDel-15 位點的引物序列 F:5' -TGTCACCACATTTCCTTCTGGGTA-3' ,R:5/ -TCACTTCCATTTGGCTTACTTCCTC-3'; X-1nDel-16 位點的引物序列 F:5' -CCTTATTTTGTGCCTTTTATTCTTGG-3' ,R:5/ -TCCTCTAAATTGGGGACCTAATGTGTA-3'; X-1nDel-17 位點的引物序列 F:5 ' -CTTTGGGTGATAGGAGGTTTTGC-3 ',R:5' -AACCCCTGGTGCTGTGTGTAAAT-3'; X-1nDel-18 位點的引物序列 F:5' -TGTAAAGCTACACCAATGGACAGATG-3' ,R:5/ -TGCAAAGATTAAGTGCATTTTCTCTG-3'。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統,其特徵在於,所述18個X-1nDel位點引物分別用FAM、HEX和TAMRA三種螢光素標記。
5.根據權利要求4所述的螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統,其特徵在於,螢光素標記 X-1nDel 位點引物,具體如下:FAM 標記 X-1nDel-02、X-1nDel-03、X-1nDel-06、X-1nDel-07、X-1nDel-09、X-1nDel-1O 和 X-1nDel-17 ;HEX 標記 X-1nDel-04、X-1nDel-08、X-1nDel-12、X-1nDel-13 和 X-1nDel-15 ;TAMRA標記X-1nDel-01、X-1nDel-05、X-1nDel_ll、X-1nDel-14、X-1nDel-16 和 X-1nDel-18。
6.—種基於權利要求1-5中任意一項所述的螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統的試劑盒,其特徵在於,包 括總體積為10-25μL的PCR反應體系,其中,所述PCR反應體系包括PCR反應緩衝液2-7.5 μ L,引物混合物1-3 μ L,DNA聚合酶1-2.5 μ L,模板DNA1-3.0 μ L,和餘量水;其中,所述引物混合物包括針對X-1nDel位點設計的螢光標記的引物序列。
7.權利要求1-5中任意一項所述的螢光標記的X-1nDel位點複合擴增系統,在三聯體親子鑑定、二聯體親子鑑定、祖孫鑑定、同胞鑑定、個體識別以及製備疾病診斷工具中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131067SQ201310161815
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年5月3日 優先權日:2013年5月3日
【發明者】李成濤, 孫寬, 趙書民, 張素華 申請人:司法部司法鑑定科學技術研究所