細胞或組織的培養方法

2023-07-30 21:36:46 2

專利名稱：細胞或組織的培養方法
技術領域：
本發明涉及在再生醫療領域、組織工程領域中的細胞或組織的培 養，還涉及用於三維組織或器官再生的三維組織的培養方法，具體來 說，涉及含有細胞、細胞載體、細胞產生的胞外基質的任意種類作為
細胞構成體(Cell construct),根據情況添加培養液或其它添加物、或生 長因子或藥品等進行的培養方法。
簡而言之，本發明的培養方法與以往的靜置培養不同，是涉及物 理作用並用的三維培養的方法，該培養方法是對細胞構成體的細胞 施加主動刺激，對細胞構成體施加位移，促進增殖、細胞移動、物質 移動，提高細胞的存活能力，同時通過誘導分化或抑止去分化來實現 目標再生組織。
背景技術：
細胞或組織的培養中，對於對要培養的細胞或組織給予壓力或張 力等物理刺激的方法進行了研究，提出了各種生物反應器等。二元培 養(平面培養)是使用平底培養基材的培養方法，通常是在培養箱內的 靜置培養法。懸浮培養是使非貼壁細胞懸浮培養的方法，也是在培養 箱內的靜置培養方法。三維培養的常規方法是將接種了細胞的細胞載 體在培養箱內靜置，進行培養。三維培養(使用生物反應器)通常是使
細胞粘附或包含在細胞載體上，進行培養液的攪拌等處理，但是細胞 載體的三維培養中也有對細胞施加加壓、壓縮、張力、剪切等物理作 用的培養方法。施加物理性作用的培養裝置被稱為"生物反應器"、"組 織工程處理器"等，作為用於組織工程培養實驗或再生醫療的體外細 胞、組織的培養裝置，有望得到實際應用。關於所迷細胞或組織的培養、該培養中所使用的具有施加物理性 位移或應力、刺激的功能的生物反應器，採用壓力、振動(超聲波)的
例子有專利文獻l中公開的細胞或組織的培養方法及其裝置；採用壓 力的例子有專利文獻2中公開的生物體內、生物體外和試管內的軟骨 和膠原的修復和再生以及骨骼再形成的方法；採用剪切力的例子有專 利文獻3中公開的細胞、組織培養裝置；釆用拉伸力的例子有專利文 獻4中公開的細胞、組織培養裝置；採用壓縮力的例子有專利文獻5 中公開的細胞、組織培養裝置；採用剪切力的例子有專利文獻6中公 開的細胞培養裝置；採用拉伸力的例子有專利文獻7中公開的使用矽 膠帶的培養細胞用伸縮刺激負荷裝置；並用拉伸力和剪切力的例子有 專利文獻8中公開的對組織、合成或天然血管移植片進行滅菌、接種、 培養、保存、運輸以及^r查的裝置和方法。專利文獻9中公開了通過 膜體使保持膜體狀的細胞產生變形的培養方法等。專利文獻10和專 利文獻11中公開培養中利用半透膜。人們對於各種物理性作用和 刺激的施加或利用半透膜的細胞等的培養進行了嘗試。 專利文獻1:日本特開2001-238663號公報(摘要等) 專利文獻2:日本特表2004-512031號公報(摘要等) 專利文獻3:日本特開2002-315566號公報(摘要等) 專利文獻4:日本特開2003-061642號公報(摘要等) 專利文獻5:日本特開2003-180331號公報(摘要等) 專利文獻6:日本特開平09-313166號公報(摘要等) 專利文獻7:日本特開平10-155475號公報(摘要等) 專利文獻8:日本特表平11-504216號公報(摘要等) 專利文獻9:日本特開2005-143343號公報(摘要等) 專利文獻10: WO 2006-015304A2 (摘要等) 專利文獻11:日本特表2000-513214號公報(摘要等)
發明內容發明所要解決的課題
但是，人體存在承受各種應力的部位，這些部位的修復中所使用 的組織根據其部位不同而不同。例如，在推間板、半月板、骨骼、纖 維軟骨、心臟瓣膜處，在體內承受彎曲力。該彎曲力與單純的壓力、 壓縮、拉伸、剪切等不同。對於所述承受彎曲力的部位，採用通過單 純的壓力、壓縮、拉伸、剪切等刺激因素培養的組織並不足夠。
因此，本發明人等認識到，作為施加給要培養的細胞或組織的刺 激或負荷，彎曲對於細胞或組織的增殖等極為有利。本發明是基於上 述認識而完成的，關於所述彎曲，專利文獻1~11中沒有公開，也沒 有任何啟示。
因此，本發明的目的在於涉及含有細胞和/或組織的培養物的培養 方法，提供適合人等身體部位的細胞和/或組織的培養方法。 解決課題的方法
為實現上述目的，本發明涉及含有細胞和/或組織的培養物的培養 方法，通過使彎曲力作用於含有細胞和/或組織的培養物，使培養物彎 曲、具體來說，通過彎曲，在從其凹陷部分至凸起部分的厚度方向上 產生連續的壓縮和伸長，對培養物負荷以往的加壓、剪切、拉伸中無 法得到的物理性刺激或變形，由此可以獲得適合於伴有彎曲的部位的 組織修復的培養物。
因此，為實現上述目的，本發明的第一方面是含有細胞和/或組織 的培養物的培養方法，該方法含有對上述培養物負荷彎曲運動的步 驟。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述彎曲運動含有使上 述培養物形成彎曲狀態的處理。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選含有在可彎曲的培養床 上設置上述培養物的步驟，上述彎曲運動以上述培養床作為^!某介來進 行。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述培養床是可移動地
6支撐其兩端、通過對中央部負荷載荷來使其彎曲。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述培養物用半透膜密封。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述彎曲運動周期性或 斷續性地進行。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述培養物中含有細胞、 細胞載體、上述細胞產生的胞外基質、培養液的任意種類。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述培養物是接種了細 胞的三維培養載體。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述培養物是含有凝膠 狀物質。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述三維培養載體為生 物體吸收性材料。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選上述凝膠物質是生物體 吸收性材料。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選含有下述處理的任意形
式對上述培養物施加連續的張力的處理；對上述培養物施加斷續的 張力的處理；或者對上述培養物周期性地施加連續或斷續的張力的處 理。
為實現上述目的，上述培養方法中，優選含有將上述培養物加壓 的處理，該加壓可以是連續或斷續、或者周期性變化或不規則變化。 發明效果
根據本發明，可以得到以下效果。
(1) 對正在培養的培養物施加彎曲等位移(應力)，因此可促進培養 物的培養，例如可用於推間板等體內承受彎曲力的組織的再生。
(2) 有望防止幹細胞分化、組織細胞去分化。
(3) 組織結構等具有方向性時，可以使其排列方向一致，可獲得 與體內組織同等的培養物。(4) 排除壓力等其它物理作用或使其最小化，通過彎曲作用可以 培養所需的組織。
(5) 有望使細胞移動變得容易。
(6) 可使營養物、氧滲透至三維細胞構成體的內部。
(7) 容易排出代謝廢物。
(8) 如果通過半透膜將細胞存在的部分和培養液的部分進行分 離，則可以排除培養液的液流產生的剪切力，可以以限定為彎曲或 壓力的作用進行培養。
(9) 如果用半透膜將存在細胞的部分和培養液的部分進行分離， 則即使沒有載體細胞也可以成為球體化，可實現三維組織化。
附圖簡述


圖1是表示實施方式1的培養床的構成例的圖。 圖2是表示培養的處理順序的流程圖。 圖3是表示進行培養處理的細胞構成體的形態的圖。 圖4A是表示將細胞構成體載放於培養床上的狀態的圖。 圖4B是表示將細胞構成體載放於培養床上的狀態的圖。 圖5A是表示對細胞構成體施加彎曲運動及其解除的圖。 圖5B是表示對細胞構成體施加彎曲運動及其解除的圖。 圖6A是涉及對彎曲狀態下細胞構成體的受力和位移的相關分析 的圖。
圖6B是涉及對彎曲狀態下細胞構成體的受力和位移的相關分析 的圖。
圖7A是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。 圖7B是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。 圖7C是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。 圖8A是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。 圖8B是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。圖8C是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。 圖9A是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。 圖9B是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。 圖9C是涉及高度位置下的凝膠圓柱內部位移的分析圖。 圖10是表示實施方式2的細胞構成體的形態的圖。 圖11是表示將細胞構成體載放於培養床上的狀態的圖。 圖12是表示實施方式3的細胞構成體的形態的圖。 圖13是表示實施方式4的細胞或組織培養系統的圖。 圖14是表示實驗例的圖。 圖15是表示實驗例的圖。 圖16是表示實驗例的圖。 圖17是表示實驗例的圖。 圖18是表示實驗例的圖。 符號說明
2細力包構成體 4培養床 6載放部 14、 16支撐面 26、 28把持部 32管
36培養小室(culture chamber) 38培養液 40支撐部件
實施發明的最佳方式
實施方式1
對本發明的實施方式1的細胞或組織的培養方法進行說明。 該細胞或組織的培養方法是使用細胞構成體2 (圖3)作為培養物的一個例子。該細胞構成體2含有細胞、細胞載體(scaffold)、上述細 胞產生的胞外基質的任意種類，還可以根據需要添加培養液或其它添 加物、生長因子或藥品等。例如可以是使細胞懸浮的培養液、接種了 細胞的三維載體和凝膠狀物質或其它載體複合而成，還可以將它們封 入半透膜制的袋或管中。三維載體和凝膠狀物質例如由生物體吸收性 材料等構成。
密封上述細胞構成體2的半透膜可一艮據可通過的分子的大小來制 備。例如可從透過分子量為100 [Da](道爾頓)~ 1000 [kDa]的半透膜 中選擇使用。即，選擇可透過培養液中的營養成分、必需的氧等氣體 或細胞產生的代謝廢物等低分子物質等，但不能透過細胞或高分子的 胞外基質的半透膜，只要可以鎖住細胞，則可以防止細胞或胞外基質 的流失，同時可以使營養成分和氧的供給成為可能，可實現高效率培 養。
該細胞構成體2的培養使用培養床4。圖1是表示該培養床的構 成例的圖。
該培養床4是支撐細胞構成體2、同時對細胞構成體2施加運動 的裝置，該培養床4構成功能部，即將位移動作傳遞至保持的細胞構 成體2，通過培養床4所具有的彈性，使細胞構成體2恢復至位移動 作前的狀態。
培養床4具備可平行載放兩個細胞構成體2的載放部6，該載放 部6是具有將兩個細胞構成體2平行載放的面積和形狀，且由用於 對各細胞構成體2施加彎曲運動的彈性材料形成的板狀部。彈性材料 例如可使用彈簧用不鏽鋼鋼板或其它彈性高的材料。此時，可以用彈 性材料形成培養床4全體，也可以用彈性材料形成可彎曲運動的載放 部6或其一部分。載放部6並不限定於平板狀，也可以是網狀。載放 部6可以是載放單一的細胞構成體2的構成，也可以是可載放3個以 上細胞構成體2的構成。
該載放部6為長方形狀，在其長度方向的端部形成長方形狀的豎直壁部8、 10,各豎直壁部8、 10與載放部6成直角，同時形成與各 細胞構成體2對應的橢圓形的透孔部12。這些透孔部12固定細胞構 成體2的兩端。另外，各豎直壁部8、 10可以根據各細胞構成體2的 尺寸設定為規定高度h。
在各豎直壁部8、 IO的頂部，作為平行面，與載放部6平行地形 成具有一定寬度的支撐面部14、 16，各支撐面部14、 16上，將一部 分彎折，與各豎直壁部8、 IO平行地形成彎折部18,各彎折部18可 以使各支撐面部14、 16和各豎直壁部8、 IO得到補強。即，即使用 與含有薄板狀部的載放部6相同的板材形成各支撐面部14、 16和各 豎直壁部8、 10，也可得到足夠的強度，同時可實現培養床4的重量 減輕。該實施方式的培養床4中，為了固定支撐面部14 一側，形成 與未圖示的定位銷對應的U字形的缺陷部2 0 。
載放部6的中間邊緣部位形成支撐所載放的細胞構成體2的側面 部的支撐壁部22、 24，各支撐壁部22、 24的頂部形成覆蓋細胞構成 體2的上面部的把持部26、 28。各支撐壁部22、 24是與載放部6垂 直相交的壁部，其高度與上述豎直壁部8、 IO同樣。另外，各把持部 26、 28與載放部6構成平行面。細胞構成體2配置在載放部6和各把 持部26、 28的間隔內。各把持部26、 28的終端部構成曲面部，兩者 之間設定用於拆卸細胞構成體2的間隔30。
下面，參照圖2、圖3、圖4A、圖4B、圖5A和圖5B，對細胞 構成體2的培養方法進行說明。圖2是表示培養的處理順序的流程圖， 圖3是表示進行培養處理的細胞構成體的形態的圖，圖4A和圖4B是 表示將細胞構成體設置於培養床上的圖，圖5A和圖5B是表示對細胞 構成體施加彎曲運動及其解除的圖。
如圖2所示，細胞構成體2的培養處理含有前處理(步驟S1)、培 養處理(步驟S2)和後處理(步驟S3)。前處理中含有細胞構成體2的形 成、半透膜的封入處理等。培養處理含有彎曲運動處理，反覆進行彎 曲處理(步驟S21)、彎曲解除(步驟S22)、彎曲處理(步驟S23).......彎曲解除(步驟S2N)。後處理含有將結束培養的細胞構成體2從培養床4 中取出等。
(1)前處理(步驟S1)
在細胞構成體2的形成中，由體內取出組織或細胞，然後將取出 的組織用酶等分解，進行必需的細胞篩選。另外，需要增加篩選的細 胞數時，可在前處理階段通過單層培養等進行細胞數的增加處理。對 於所得細胞，將培養液、水凝膠、凝膠狀載體組合，製備細胞構成體 2。除此之外，作為不定形構成體，可以使細胞懸浮在培養液或水凝 膠中，或使細胞與凝膠狀載體混合。作為定形構成體，可以使細胞懸 浮在培養液中，將其加入到膠原海綿、殼聚糖海綿等細胞載體中，使 細胞附著，或者是以溶膠狀態將細胞混入載體，將其加入到膠原海綿、 殼聚糖海綿等細胞載體中，使細胞附著，同時實現凝膠化。還可以根
據需要添加生長因子或藥劑等。
如圖3所示，將作為培養物的細胞構成體2密封到筒狀的半透膜 制的管32中進行培養。在半透膜制的管32的一端例如設置由半透膜 製成的密封栓34,由另一端加入上述的細胞構成體2,同樣用密封栓 34密封，由此可密封細胞構成體2。封入了細胞構成體2的管32的 大小可根據要培養的物質的目的、以及細胞構成體2的種類等而變化。
如圖4A和圖4B所示，將密封在管32中的細胞構成體2載放於 培養床4的載放部6上。在培養床4上的載放處理是將封入了細胞構 成體2的管32穿過在把持部26、 28之間設置的間隔30,使管32的 兩端通過設置於各豎直壁部8、 10的透孔部12，同時使管32的中間 部位於載放部6和把持部26或28之間。在該實施方式中，是將兩根 管32並列載放，其根數並沒有特別限定。該實施方式中，是將管32 的兩端插入透孔部12進行固定，但也可以根據管的大小，例如用專 用夾子等支撐在培養床4上。
通過所述栽^L,後述的培養處理中，例如通過對培養床4的底部 一側施加的力卩吏培養床4彎曲及其解除，與此相對，管32被各透孔部12和把持部26、 28支撐，可與培養床4一起進行彎曲和恢復動作，
可以實現彎曲運動。
(2)培養處理(步驟S2)
培養處理中，如圖5A所示，將密封在管32中的細胞構成體2與 培養床4 一起轉移至作為培養空間的培養小室36，將培養液38供給 該培養小室36內。設置在培養小室36中之後，為了防止培養液38 等流出或者由外部混入雜菌，例如可以通過外罩等使培養小室36處 於密封狀態。另外，設置在培養小室36中的培養床4，其支撐面14、 16由支撐部件40支撐。由此，即使由後述的背面一側施加力F，培 養床4也不會發生上下挪移，可以使培養床4和管32彎曲。所述培 養小室36可以具有保持密封狀態，同時在培養處理中使培養液38循 環供給的構成。這種情況下，培養液38可以是在培養小室36中連續 地循環的構成，也可以是定期交換的構成。
由培養床4的背面一側例如通過未圖示的控制杆等負荷力F，則 如圖5B所示，培養床4的載放部6由於力F而向上方彎曲，通過該 彎曲，載放部6上的管32也彎曲。即，細胞構成體2中產生彎曲。 由該彎曲狀態解除力F，則培養床4的載放部6由於彈性而恢復成原 形狀，變得平坦，因此載放部6上的細胞構成體2也轉移為平坦狀態， 再次成為圖5A所示狀態。這種情況下，管32的上面部存在培養床4 的把持部26、 28,向上方突起變形的管32根據載放部6的復原而穿 過管32兩端的透孔部12和被把持部26、 28把持，根據載放部6的 原狀復原而變得平坦。如上所述，通過透孔部12和4巴持部26、 28, 可以對密封到管32中的細胞構成體2施加與培養床4的彎曲和平坦 化的位移量同等程度的位移量，因此通過控制所施加的力F帶來的移 動量，也可以控制施加給細胞構成體2的彎曲運動量。
這樣，反覆進行所述彎曲運動(步驟S21 步驟S2N)，經過必要 的培養時間，細胞在管32內增殖，同時生產胞外基質等，可以再生 不定形的或定形的新生組織。彎曲動作的周期或大小、動作程序、培
13養小室36內的溫度設定等可在培養處理開始前預先設定最佳方式等，
除此之外也可以根據細胞或組織的培養狀態任意設定。還可以根據需
要在培養小室36內施加壓力進行培養的構成。
如上所述，培養中使用半透膜制的管32時，可以防止培養液與 培養物之間產生的剪切力的發生、且防止細胞或胞外基質的流失，同 時使營養成分和氧的供給成為可能，可實現高效率培養。但是，由於 營養物的通過阻力，可能對營養物的供給產生障礙。但是如上所述， 通過施加彎曲動作，內部位移主動升高，產生壓力差，營養成分容易 移動，同時對於細胞施加物理性刺激。由此，在沒有血管的階段的細 胞構成體2或沒有血管的組織中，彎曲動作可以代替血管或心臟的運 動進行培養。 (3)後處理(步驟S3)
結束培養的細胞構成體2與培養床4 一起從培養小室36 (圖5A) 中取出。由培養床4中取出密封了細胞構成體2的管32，取出在其內 部增殖的細胞或生產的胞外基質等新生組織。對取出的新生組織進行 品質檢查等，在用於人體等治療之前進行保存。
培養的新生組織如果是定形組織，則可通過縫合等方法直接移植 到人體中，如果為不定形組織，則可通過注入到缺損部，或者結合組 織的形狀進行塗布或成型並固定等處理，在體內與周圍的組織融合， 可以實現組織化。
接著，參照圖6A和圖6B,對細胞構成體2的培養方法中的彎曲 運動和培養進行說明。圖6A和圖6B是用於在彎曲狀態下對圓柱狀細 胞構成體所承受的力和位移進行分析的圖。
如上所述，培養床4是在培養小室36內、在規定位置支撐，使 上下等不偏移，細胞構成體2也被固定在培養床4上，因此如圖5B 所示，從培養床4的背面一側附加力F,則培養床4的載放部6向上 方彎曲，細胞構成體2也隨著培養床4一起變形。
使物體彎曲時產生彎曲應力(Bending stress)。物體彎曲，則產生
14彎曲應變(Bending strain)。彎曲的物體內部產生各種應變。即，如圖 6B所示，在彎曲的外周一側(圖6B的上側)，拉伸力作用於其上，使 其伸長，在內周一側(圖6B的下側)，則相反是壓縮力作用於其上，使 其，壓縮。考慮到物體內部的微小部分，則微小部分之間在相鄰的位 置上產生伸長或壓縮的位移差異，因此產生剪應力(Shearing stress), 由此產生剪應變(Shearingstrain)。如圖6A粗線所示，在物體的一部分 上沒有伸縮位移的(O)面是所謂的中立面，包括該中立面，在所有的位 置均產生剪應變。剪應變在一定的方向上產生。
由於彎曲，使截面積發生變化，導致內部壓力發生變化。通過變 化截面形狀，則在物體內部產生壓力升高部分和降低部分。並且外周 被拉伸、內周被壓縮，因此內周部分壓力高，外周附近壓力降低。
即，彎曲是內部拉伸、壓縮、剪切、壓力等各種作用的結果。使 彎曲運動作用於細胞構成體2,則通過拉伸、壓縮、剪切、壓力，細 胞構成體2的內部微妙變形。這裡，因壓力而產生的液體的收縮率是 可忽視的微量，因此彎曲運動產生的應變與反覆對細胞構成體2施加 壓力的方法相比，可以產生非常大的應變。由此，彎曲作用可以進一 步增大細胞或營養、氧、代謝廢物等的移動、供給等的效果，同時， 相對於彎曲方向以某一特定方向產生拉伸或壓縮的剪切力，因此可以 使所形成的組織排列 一致。
因此，如果是適合彎曲運動的細胞，則可促進增殖，同時可以培 養直至組織排列也可仿真生物體內的組織的組織。並且，與彎曲並行 地使用壓力時，可以擴大效果。
因此，可參照圖6A和圖6B,對使作為細胞構成體2的模型的凝 膠圓柱彎曲時產生的伸長等進行分析。
如圖6A中斜線所示，對表示彎曲之前的直徑為d的凝膠圓柱長 度方向的截面的圖6B進行研究。變形前橫向長度為L，相對於凝膠 圓柱的中心線，彎曲至曲率半徑為r。彎曲前的凝膠圓柱高度為d (= 直徑)，將該d由彎曲的內側向外側分成m個區。以凝膠圓柱的中心線為0，朝向內側為-n號，朝向外側為+n號，設置斷面(Section)。圖 6B中， 一個例子是將凝膠圓柱分成IO個斷面，以分割該凝膠圓柱的 各線與凝膠圓柱的側面的切點作為位移的計算位置，由彎曲的內側向 外側表示為1 ~ 11的位置斷面。
沿長度方向的伸長為ALn,沿厚度方向的位移為ARn，總位移為 Dn。對於彎曲產生的長度方向(圓周方向)的位移進行分析。長度L的 凝膠在彎曲的內周收縮，在外周伸長。以彎曲前的圓柱中心線作為中 立面，則壓縮應力和拉伸應力相等。第n號的斷面的曲率半徑rn為 [數l]
第n號斷面的弦長為 [數2]
丄w-丄x— ..............
因此，長度方向的拉伸ALn為 [數3]
= Zw—厶=丄x t—丄
將式(1)代入到式(3)中，則形成 [數4]
(1)
(2)
=丄
"，、
--1.、
(3)
乂
Z " 、
r + —d
附
一l
=丄
w '屍
(4)
接著，對於厚度方向(曲率半徑方向)的位移ARn進行分析。自彎 曲時成為最內側的部分起，有n個斷面彎曲，則變形前為長方形的該部分保持該面積而形成扇形。使凝膠圓柱彎曲，則如上所述，長度方 向發生變化，因此只有這部分的厚度變化。由該考慮方法可以計算厚
度方向的位移。彎曲時，由中心至成為最內側的面的距離ro為 [數5]
f0 =廠 一丄d (5)2 。
由最內側至第n號斷面的長方形面積Sns為 [數6]
& =-^-d,丄 ...............(6)
附
由最內側至第n號斷面的扇形面積Sn為 [數7]
& =丄(;^"2-,2) ............... (7〉
2;rr 、 ,
Sns和Sn保持相同面積(Sns二Sn),則由式(6)、式(7)得到 [數8]
17formula see original document page 18(8)
附
這裡，將式(5)代入式(8),則得到: [數9]
formula see original document page 18
加
formula see original document page 18
對於彎曲前的第n號斷面，由曲率中心至此的距離r。為: [數10]
r" = r+—d ............... (io)
由此彎曲時的位移ARn為 [數11]formula see original document page 19
因此，綜合位移Dn可由以下求出 [數12]
formula see original document page 19 ............... (12)
利用以上分析，圖7A、圖7B、圖7C、圖8A、圖8B、圖8C、 圖9A、圖9B和圖9C分別表示凝膠圓柱內部的位移。圖7A、圖7B 和圖7C是涉及高度為10 (-直徑d，斷面數=10)的位置中央部的凝膠 圓柱內部位移的分析圖，圖8A、圖8B和圖8C是涉及高度為8(斷面 數=8)的位置(偏離中央的位置)的凝膠圓柱內部位移的分析圖。圖9A、 圖9B和圖9C是涉及高度為4 (斷面數=4)的位置(更加偏離中央的位置) 的凝膠圓柱內部位移的分析圖。
具體來說，對於將直徑10(d-10)的凝膠圓柱以曲率半徑50(r=50) 彎曲時的變化進行分析，將圓柱以縱、橫為10的斷面區分，長度的 位移是相對於10(L-10)的值。由圓柱的圓形面一側觀察位移，對高度 為10 (對圓中心進行區分的斷面，圖7A)時、高度為8(圖8A)時和高 度為4(圖9A)時的位移分別製圖。各圖均是橫軸為表示位移理論位置 的斷面位置，縱軸為總位移(Dn)、厚度方向上的位移(ARn)、長度方向 上的伸長(ALn),高度為位移量。
由上述分析結果顯示，將圓柱彎曲，則該圓形截面上的某一點與 相鄰的點之間一定會產生位移的大小和方向上的差異。由於該差異， 在圓柱的所有部分產生剪切力。不過在某一點的長度方向的線上產生 同等位移和應力。 實施方式2
接著，參照圖IO和圖11對本發明的實施方式2的細胞或組織的培養方法進行說明。圖10是表示實施方式2的細胞構成體的形態的 圖，圖11是表示將細胞構成體2載放於培養床4上的狀態的圖。圖 10、圖11中，與實施方式1相同部分和相同構成採用相同符號。
該實施方式中，在實施方式1的培養方法中，將不定形的細胞構 成體2密封入半透膜制的管42中進行培養。例如，對於細胞懸浮於 培養液或水凝膠中、或者將細胞混合到凝膠狀載體中所得的不定形的 細胞構成體2，半透膜制的管42不會成為模框(frame)，因此培養後也 形成不定形組織，可以培養適合注入到生物體組織間等用途的組織。 上述凝膠狀物質例如由生物體吸收性材料構成。
所述細胞構成體2(圖IO)中，可以使用上述的培養方法(圖2)，同 樣地進行培養，但是，此時，前處理是使用柔軟性高的管42,因此其 開口截面形狀為不定形，管42的兩端開口的密封是利用管42所具有 的柔軟性，同時用專用的夾子44密封，以此代替密封栓34(圖3)。即， 為防止細胞構成體2從管42中流出，實施將管42的兩端彎折、將重 疊部分用夾子44密封等處理。另外，為防止彎曲運動導致的管42的 破裂、或使管42內的細胞構成體2產生移動空間等，細胞構成體2 在管42中的密封必須密封適量，以不至於形成滿載狀態。根據培養 的目標量而不同，例如可以密封成半透膜制的管42的截面為橢圓形 狀。
如上所述，密封到管42中的細胞構成體2如圖ll所示，安裝於 培養床4上。培養床4上的載放處理與實施方式1相同，將密封了細 胞構成體2的管42穿過設於把持部26、 28之間的間隔30，使管42 的兩端穿過設於各豎直壁部8、 10的透孔部12中，同時管42的中間 部配置成位於載放部6和把持部26、 28之間的位置。通過所述載放， 通過上述培養處理中的彎曲運動，根據培養床4載放部6的彎曲及其 解除，可以使細胞構成體2產生彎曲運動。
所述構成中，通過與實施方式1同樣地實施培養處理，如上所述， 可培養不定形的細胞構成體2。關於細胞構成體2與培養床4的固定，除上述之外，例如可以是 用夾子44將管42與培養床4 一起夾持的構成；或者是將培養床4的 固定用夾與夾子44 一起使用的構成。 實施方式3
接著，參照圖12對本發明的實施方式3的細胞或組織的培養方 法進行說明。圖12是表示實施方式3的細胞構成體2的形態的圖。 圖12中，與實施方式1相同部分或相同構成採用相同符號。
該實施方式中，相對於實施方式1的培養方法，是將細胞接種於 定形的細胞載體(三維載體)48中、製備定形的細胞構成體2、封入半 透膜制的管32中進行培養的構成。具體來說，可以將細胞懸浮在培 養液或水凝膠中，或者將細胞混入凝膠狀載體中。定形構建體是使細 胞懸浮在培養液中，將其加入到膠原海綿、殼聚糖海綿等細胞載體中， 使細胞附著，或者在溶膠狀態下將細胞混入載體，或將其加入到膠原 海綿、殼聚糖海綿等細胞載體中，使細胞附著，同時進行凝膠化。三 維載體和凝膠狀物質例如由生物體吸收材料等構成。培養方法可以與 上述實施方式l相同，因此省略其說明。
通過上述構成，通過使用預先定形的細胞構成體2，可以培養所 需形狀或大小的新生組織。 實施方式4
以下，參照圖13對本發明的實施方式4的細胞或組織的培養系 統進行說明。圖13是表示細胞或組織的培養系統的圖。圖13中，與 實施方式1相同部分或相同構成採用相同符號，省略其說明。
該實施方式中，在實施方式1至實施方式3的細胞或組織的培養 方法中，構成了在進行培養液的循環或隨時供給新鮮的培養液的同 時，控制培養室的溫度或壓力、所供給的混合氣體G的濃度等進行培 養的培養系統50。
培養系統50可使用作為培養裝置的培養箱52。該培養箱52的培 養室53中設置有培養單元54、培養迴路56、調節器58、溫度調節器60、氣體濃度調節器62、加壓裝置64，它們通過在培養箱52的外部 的控制裝置66來控制。
培養單元54是對細胞構成體2施加壓力或上述力F等進行培養 的培養裝置，在其內部形成作為上述培養空間的培養小室36。加壓裝 置通過控制裝置66進行控制，壓力P作用於培養小室36內的培養床 4的下面一側。
培養迴路56是對培養裝置進行培養液38等的供給和循環的裝 置，培養迴路56由儲存培養液38的培養液儲存器70、向培養液38 或培養室53供給混合氣體G(氮、氧、二氧化碳等)的氣體交換部72、 泵74、逆止閥76和將培養單元54與調節培養室53或培養小室36內 的壓力的壓力調節器78連接的循環管80構成。
泵74可使用活塞式泵、汽缸式泵、蠕動泵。泵74的驅動、壓力 調節閥78的開閉、其開合程度等可通過控制裝置66調節。調節器58 是培養單元54用於對細胞構成體2施加力F的驅動源。溫度調節器 60調節培養室53和培養小室36內的溫度。氣體濃度調節器62進行 供給培養液存儲器70或培養液38的混合氣體G (氮、氧、二氧化碳 等)的濃度調節。控制裝置66進行上述各功能部的控制，具體來說， 將溫度調節或氣體濃度的調節等匯總控制，除此之外還進行培養液存 儲器70的循環或泵74的動作、調節器58的動作等的控制。
通過所述培養系統50進行上述培養處理，則可以進行負荷彎曲 運動的培養處理，同時，可以通過培養迴路56向培養小室36內供給 培養液38以及代謝廢物等的排除。通過加壓裝置64，可以連續地、 斷續地或周期性地等控制對培養單元54的加壓，可以使溫度或壓力 保持所需狀態進行培養。結果可以進行高效率且可靠性高的培養。
該培養系統50中，在培養箱52的內部設置培養液存儲器70、調 節器58、泵74,但並不限於此，可以使它們的全部或部分處於培養 箱52的外部。另外，調節器58的動作可以與通過加壓裝置64對培 養小室36的加壓、供給培養液38的泵74等動作連動，另外，如果
22在培養處理的中途中斷，周期性地或斷續地施加彎曲運動，則可以對
細胞施加有效的刺激。
其它實施方式
上述實施方式中，對於作為培養物的細胞構成體2，由培養床4的背面一側施加力F，使培養床4向上方彎曲，由此使細胞構成體2彎曲，也可以對培養床4或細胞構成體2本身施加規定的彎曲位移。該處理中，可以連續地或斷續地施加，或者可以周期性地施加連續或斷續的張力。所述構成也可以對細胞構成體2實施規定的彎曲。實驗結果
下面，參照圖14 ~圖18，對使用本發明的培養方法的實驗結果進行說明。
圖14表示細胞構成體。該細胞構成體是將懸浮在培養液中的細胞加入到半透膜的管中而構成，如圖15所示，細胞構成體固定在培養床上，收納於培養小室內。此時，驅動部可與培養小室分離。
來自調節器的加壓作用於培養單元，使彎曲動作施加於細胞構成體。調節器放置在培養室之外，電纜貫穿培養室的門，與驅動部連接。調節器的動作狀態可通過顯示裝置確認。
調節器可以通過曲柄將馬達的旋轉運動變換為直線運動，通過選擇曲柄臂的長度，可以調節線杆的進退幅度，由此可以調節對細胞構成體施加的彎曲的大小。
該實驗中，加壓動作是只限定於彎曲動作，保持大氣壓，進行培養液循環。壓力和調節器產生的彎曲動作可以分別無關係地單獨施加。該實驗中，例如可以施加0.5 [MPa]以上的加壓。
圖16~圖18表示脊推器官的培養實驗(出生2天的小鼠的脊推器官培養(Vertebrae organ culture of 2 days old mouse))。 實驗是將乂人出生後兩天的小鼠中取出的脊推設置在培養床上(圖16),以0.1 [Hz]的頻率施加彎曲動作，實施10天的培養。該實驗中未進行加壓。
比較例是進行靜置培養。圖17和圖18表示IO天的靜置培養。IO天后，將器官的截面用曱苯胺藍染色，觀測細胞的存活狀況。圖中，著色部分未能明確標識，但是亮度降低的部分(染色部分)表示存在存活的細胞。靜置培養中，推間板內部的細胞密度沒有提高，可見基質
的變性(圖17a)。
與此相對，施加了彎曲動作、位移的脊推中，可見推間板內部細胞的增生以及新生基質的蓄積(圖18b)。
由該實驗結果可知，施加彎曲動作的培養與靜置培養比較，可見細胞的增生和新生基質的堆積，由此可以推斷該彎曲動作可以對細胞構成體產生刺激，同時促進物質移動。
如上所述，對本發明的最優選的實施方式進行了說明，但本發明並不限定於上述記載。根據權利要求中請求保護的範圍或說明書所公開的發明內容，本領域技術人員可以進行各種變形或變更，所述變形或變更當然也包含在本發明的範圍內。
產業實用性
本發明涉及細胞或組織的培養方法，通過將彎曲運動的刺激施加給細胞構成體，促進沒有血管的新生組織內的物質移動，由此促進細胞的增殖，除此之外可以模仿生物體內組織狀態進行培養，因此本發明是有用的。
權利要求
1. 含有細胞和/或組織的培養物的培養方法，其特徵在於該培養方法含有對上述培養物負荷彎曲運動的步驟。
2. 權利要求1所述的培養方法，其特徵在於上述彎曲運動含 有使上述培養物形成彎曲狀態的處理。
3. 權利要求1所述的培養方法，其特徵在於該培養方法含有 在可彎曲的培養床上設置上述培養物的步驟，上述彎曲運動以上述培 養床作為媒介來進行。
4. 權利要求3所述的培養方法，其特徵在於上述培養床的兩 端被可移動地支撐，通過對該培養床的中央部負荷載荷來使其彎曲。
5. 權利要求1、 2、 3或4所述的培養方法，其特徵在於上述 培養物用半透膜密封。
6. 權利要求1所述的培養方法，其特徵在於上述彎曲運動周 期性或斷續性地進行。
7. 權利要求1所述的培養方法，其特徵在於上述培養物中含 有細胞、細胞載體、上述細胞產生的胞外基質、培養液的任意種類。
8. 權利要求1所述的培養方法，其特徵在於上述培養物是接 種了細胞的三維培養栽體。
9. 權利要求1所述的培養方法，其特徵在於上述培養物含有 凝膠狀物質。
10. 權利要求8所述的培養方法，其特徵在於上述三維培養載 體為生物體吸收性材料。
11. 權利要求9所述的培養方法，其特徵在於上述凝膠狀物質 為生物體吸收性材料。
12. 權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，該培養方法含有 下述任意形式的處理對上述培養物施加連續的張力的處理；對上述 培養物施加斷續的張力的處理；或者對上述培養物周期性地施加連續或斷續的張力的處理。
13.權利要求1所述的培養方法，其特徵在於該培養方法含有 將上述培養物加壓的處理，該加壓可以是連續或斷續、或者周期性變 化或不規則變化。
全文摘要
本發明涉及細胞或組織等培養物的培養方法，該培養方法是含有細胞或組織的培養物(細胞構成體2)的培養方法，包括對該培養物施加彎曲運動。使彎曲力作用於細胞或組織等的培養物(細胞構成體2)，使培養物彎曲，由此可以使從其凹陷部分至突起部分的厚度方向上產生連續的壓縮和伸長，培養物可負荷以往的加壓、剪切、拉伸無法得到的物理性刺激或變形，可以獲得適合伴隨有彎曲的部位的組織修復的培養物。
文檔編號C12M3/00GK101484571SQ200780025260
公開日2009年7月15日 申請日期2007年6月22日 優先權日2006年7月10日
發明者水野秀一, 渡邊節雄 申請人:高木產業株式會社;布裡格哈姆及韋門斯醫院