從表達腺病毒e1a蛋白的細胞中獲得唾液酸化增加的重組蛋白質的方法及由此獲得的蛋白質的製作方法

2023-07-31 09:56:31

專利名稱：：從表達腺病毒e1a蛋白的細胞中獲得唾液酸化增加的重組蛋白質的方法及由此獲得的蛋白質的製作方法
技術領域：
：本發明涉及重組蛋白質生產領域，特別涉及重組蛋白質如紅細胞生成素的糖基化，更特別涉及當在表達腺病毒E1A的細胞中生產時重組蛋白質的糖基化。
背景技術：
：如WO00/63403所示，表達至少腺病毒E1A蛋白的永生化人胚胎視網膜細胞可適用於生產重組蛋白質。在表達腺病毒E1A的細胞中產生的具有N聯糖基化的重組蛋白質具有特異性糖基化模式，例如特徵在於存在Lewis-X結構，如WO03/038100所述。在表達E1A的細胞中產生的蛋白質的另一特徵是呈現相對低的半乳糖基化及低唾液酸化的N聯聚糖(WO03/038100)。對於某些目的，這可能是有益的，但對於其它目的，較高水平的半乳糖基化及優選同時唾液酸化是有益的。例如，在表達E1A的細胞中產生的紅細胞生成素(EPO)具有顯著量的Lewis-X結構和在N聯聚糖中相對低百分比的半乳糖基化和唾液酸化(WO03/038100)，產生非常適於治療缺血/再灌注損傷但不太適合治療貧血的分子。對於治療貧血，已經確定EPO的高度唾液酸化有益於增加治療對象血清中EPO的半衰期，由此延長該物質處於活性的時間而增加紅細胞計數(Goldwasseretal.，1974)。因此，對於治療缺血/再灌注損傷，在表達E1A的細胞中表達EPO對於為此用途產生的EPO的優選糖基化模式具有潛在益處。然而，對於EPO的其它應用，不同的糖基化模式可能是有益的。對於其它蛋白質可存在類似情況，即對於某些應用，基於在表達E1A的細胞中表達而觀察到的特定糖基化模式可能是高度有益的，而對於其它目的，不同的糖基化模式也許更適合。已經對於其它細胞類型描述了在細胞中過表達唾液酸轉移酶以增加在該細胞中產生的重組蛋白質的唾液酸化(例如Grabenhorstetal.，1995；Minchetal，1995；Jenkinsetal，1998；Zhangetal，1998；Weikertetal，1999；Fukutaetal.，2000；Pratietal.，2000)。然而考慮到糖基化的複雜性及仍未清楚E1A在其中的作用(WO03/038100)，從前還未知這種方案是否在表達E1A的細胞中產生所期望的結果。特別地，在表達E1A的細胞中糖基化過程中不同糖基化轉移酶與其它參與者之間的相互影響和潛在競爭使得尚無法預料及不可預知唾液酸轉移酶在這種細胞中的過表達對因此產生的蛋白質糖基化模式方面的結果。為了拓寬在表達E1A的細胞中產生的重組蛋白質的潛在應用範圍，增加這種蛋白質的半乳糖基化和唾液酸化是有益的。本發明的一個目的是提供實現這個目的的方法。本發明進一步涉及提供得自表達E1A的細胞的新的紅細胞生成素組合物。本發明的另一目的是提供降低在細胞例如表達腺病毒E1A的細胞中重組表達的蛋白質上LacdiNAc結構的平均含量的方法。附圖簡述圖1.通過對商購EPO(EPREXTM，泳道A)、在PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10中產生的EPO(泳道B)及在PER.C6-EPO克隆25中產生的EPO(泳道C)進行等電聚焦確定的唾液酸含量。圖中也示出了每個EPO分子推定的唾液酸數目。圖2.在DMEM中，貼壁細胞培養物(A)及在無血清培養基中懸浮細胞培養物(B)中產生的PER.C6-EPO的去唾液酸化N聯糖的MALDI-MS譜。圖3.對在VPRO培養基中無血清懸浮培養物中不過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO(泳道1)、在VPRO中無血清懸浮培養物中過表達α-2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞(即PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10)中產生的EPO(泳道2)及商購的EPO即EPREXTM(泳道3)通過等電聚焦確定的唾液酸含量。圖4.如實施例5所述通過HPLC離子交換方法分析由不過表達α-2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞產生的EPO(PER.C6-EPO，組A)及過表達α-2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞產生的EPO(PER.C6-ST-EPO，組B)的每N聯糖的唾液酸數目。圖中標記出具有0、1、2、3或4個唾液酸的糖的洗脫位置。圖5.對不同PER.C6-EPO製品和Eprex的等電聚焦。PER.C6-EPO表示由不過表達α-s，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞產生的EPO分子的總數；PER.C6-ST-EPO表示由過表達α-s，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞產生的EPO分子總數。分級分離的PER.C6-ST-EPO表示使用實施例6所述分級分離/純化方案得自泳道2示出的材料的高度唾液酸化的EPO。Eprex表示商購的EPO製品。圖6.使用實施例6所述的方法獲得的分級分離的、高度唾液酸化的PER.C6-EPO的去唾液酸化N聯糖的MALDI-MS譜。圖7.如本申請所述具有不同唾液酸含量的EPO同種型。1由不過表達唾液酸轉移酶的PER.C6產生的EPO(實施例2)。2由過表達α-2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6產生的EPO(實施例3)。3分級分離的高度唾液酸化的EPO(實施例6)。4Eprex(商購的EPO)。見實施例8所述。圖8.pCP-EPO和pEPO-ST3表達載體的質粒圖譜。CMV＝巨細胞病毒啟動子，BGHp(A)＝牛生長激素聚腺苷酸化序列，f1ori＝f1複製起點，SV40＝猿猴病毒40啟動子，Neo＝新黴素抗性標記，SV40p(A)＝猿猴病毒40聚腺苷酸化序列，EPO＝紅細胞生成素，ColE1＝ColE1複製起點，Amp＝氨苄青黴素抗性標記。見實施例9所述。圖9.在瞬時轉染後，在PER.C6細胞中產生的EPO(pCP-EPO)及伴隨人α-2，3-唾液酸轉移酶過表達在PER.C6細胞中產生的EPO(pEPO-ST3)的等電聚焦(IEF)凝膠。見實施例10詳述。圖10.對表達EPO和人α-2，3-唾液酸轉移酶(ST3)的穩定克隆的IEF分析。泳道1EprexTM(對照，商購的EPO)；2EPO-ST3克隆118；3EPO-ST3克隆150；4EPO-ST3克隆165；5EPO-ST3克隆176；6EPO-ST3克隆183；7在不過表達ST3的PER.C6中產生的EPO(對照)；8EprexTM(對照，商購的EPO)；9EPO-ST3克隆185；10EPO-ST3克隆186；11EPO-ST3克隆199；12EPO-ST3克隆213；13EPO-ST3克隆028；14EPO-ST3克隆059；15在不過表達ST3的PER.C6中產生的EPO(對照)。見實施例11詳述。圖11.親和純化的2，3EPO的去唾液酸化的N聯糖的MALDI-MS譜(將實施例12詳述)。圖12.EPO製品的IEF分析。泳道1PER.C6-EPO(平均唾液酸含量3.1)，泳道2EprexTM(對照，商購的EPO，平均唾液酸含量12.4)，泳道32，3EPO-1(Ultrodex純化的，見實施例14所述，平均唾液酸含量13.6)，泳道32，3EPO-2(Ultrodex純化的，見實施例14所述，平均唾液酸含量14.3)。發明描述本發明提供了一種包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，特徵在於所述聚糖平均包含a)每個EPO分子至少0.5個、優選至少1個LewisX結構，和b)每個EPO分子至少6個唾液酸部分。優選地，所述聚糖平均包含每個EPO分子至少7個、更優選至少8、更優選至少9、更優選至少10、更優選至少11個唾液酸部分。在某些實施方案中，所述聚糖平均包含a)每個EPO分子1-2個Lewisx結構，和b)每個EPO分子8-10個唾液酸部分。在其它實施方案中，所述聚糖平均包含a)每個EPO分子0.5-1個Lewisx結構，和b)每個EPO分子11-13個唾液酸部分。在某些實施方案中，EPO是具有三個N聯聚糖的人EPO。本發明進一步提供了一種獲得包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物的方法，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖平均包每個EPO分子至少6個唾液酸及0-2個Lewisx結構，所述方法包括a)提供含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列及進一步含有可表達形式的編碼EPO的核酸的真核細胞，其中所述細胞進一步含有在異源啟動子控制下的編碼唾液酸轉移酶、優選α-2，6-唾液酸轉移酶或α-2，3-唾液酸轉移酶的核酸序列；b)在無血清培養基中培養所述細胞，使得EPO在所述細胞中表達；c)從所述細胞和/或培養基中收穫表達的EPO；及d)純化並分級分離EPO以獲得每個EPO分子的N聯聚糖的平均唾液酸含量增加的級分，由此獲得包含一或多種同種型EPO的組合物，所述EPO包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖平均包含每個EPO分子至少6個唾液酸及0-2個Lewisx結構。在某些實施方案中，所述含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列的真核細胞衍生自人胚胎視網膜細胞，優選衍生自如於1996年2月29日在ECACC中以96022940號保藏的PER.C6細胞。在某些優選的實施方案中，所述聚糖平均包含每個EPO分子少於1個的Lewisx結構及至少10個唾液酸。在進一步優選的實施方案中，所述聚糖平均包含每個EPO分子少於一個的Lewisx結構及10-15個唾液酸，優選檢測不到Lewisx結構。在其它優選的實施方案中，所述聚糖平均包含每個EPO分子少於0.3個Lewisx結構及13-15個唾液酸，優選檢測不到Lewisx結構。在某些實施方案中，所述組合物包含4種或更少的EPO同種型，其一共佔所述組合物中存在的EPO的至少70％。技術人員了解EPO是一種包含N聯聚糖的蛋白質的模型蛋白質，因此很明顯這些方法也可用於其它糖基化的蛋白質。本發明因此進一步提供了一種在表達至少一種腺病毒E1A蛋白的細胞中產生感興趣的糖基化蛋白質的方法，所述方法包括a)提供表達至少一種腺病毒E1A蛋白及進一步含有可表達形式的編碼感興趣的蛋白質的核酸的細胞，其中所述細胞進一步含有在異源啟動子控制下的編碼唾液酸轉移酶、優選α-2，6-唾液酸轉移酶或α-2，3唾液酸轉移酶的核酸序列；b)在無血清培養基中培養所述細胞並使得感興趣的蛋白質在所述細胞中表達；c)從所述細胞和/或培養基中收穫表達的感興趣的蛋白質；和d)純化並分級分離感興趣的蛋白質以獲得每個感興趣分子的蛋白質N聯聚糖的平均唾液酸含量增加的級分。本發明進一步提供了一種降低在細胞中重組表達的蛋白質上的LacdiNAc結構的平均含量的方法，所述方法包括在所述細胞中過表達α-2，3-唾液酸轉移酶。在某些實施方案中，所述細胞是含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列的真核細胞。在某些實施方案中，所述方法進一步增加所述蛋白質的平均唾液酸含量。在某些實施方案中，所述蛋白質是紅細胞生成素。發明詳述本發明發現並描述了作為含有N聯聚糖的蛋白質的一種模型蛋白質的紅細胞生成素(EPO)，當在表達E1A的細胞優選PER.C6細胞中產生時，可以獲得唾液酸化顯著增強的組合物，本發明還揭示了獲得這種EPO組合物的方法。本發明揭示的實施方案提供了從表達E1A的細胞中獲得EPO的方法，其中獲得的EPO含有令人驚奇的每個EPO分子的高平均唾液酸含量(13-15)，及令人驚奇的使用本發明的方法可獲得與商購製品相似體內生物學活性的EPO。這是迄今為止在表達E1A的細胞中產生EPO的糖基化模式的描述中未曾預料的結果(WO03/038100)。本發明示出在表達E1A的細胞如永生化人胚胎視網膜細胞中表達的重組蛋白質的糖基化可以通過代謝和遺傳工程而加以改變，以增加半乳糖基化及任選唾液酸化。這個發現在本發明中通過提供在表達E1A的細胞中生產重組蛋白質、獲得產生的蛋白質的希望的新的糖形(glycoforms)的新方法而實施。當與在這種細胞中通過已知方法產生的相同蛋白質比較時，這些蛋白質的新的糖形可用於其它目的。因此，在本發明的某些方面中，提供了在細胞中產生感興趣的蛋白質的方法，所述細胞表達至少腺病毒E1A蛋白及從編碼所述感興趣的蛋白質的核酸序列中表達所述感興趣的蛋白質，所述核酸序列在異源啟動子的控制下，所述細胞進一步從在異源啟動子控制下的編碼所述糖基轉移酶的核酸序列中表達至少一種糖基轉移酶，所述感興趣的蛋白質包含至少一個N聯聚糖，所述方法包括在無血清培養基中優選以懸浮方式培養所述細胞，使得重組蛋白質在所述細胞中表達。所述糖基轉移酶優選是哺乳動物糖基轉移酶，更優選是人糖基轉移酶。在優選的實施方案中，所述糖基轉移酶是唾液酸轉移酶，優選選自α-2，6-唾液酸轉移酶和α-2，3-唾液酸轉移酶。可以使用的及涵蓋在本發明術語「表達E1A的細胞」或者「含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列的細胞」範圍內的表達腺病毒E1A的細胞優選是哺乳動物細胞，包括人來源的細胞，且優選是永生化的。在優選的實施方案中，這些細胞也表達腺病毒的E1B。例子是包含E1的A549細胞(見例如WO98/39411)、293細胞(Grahametal.，1977)、表達E1的羊水細胞(Schiedneretal.，2000；見用腺病毒E1序列對原代羊水細胞進行永生化的美國專利6,558,948)、及表達E1的視網膜細胞如PER.C6細胞(美國專利5,994,128)。它們可優選衍生自胚胎視網膜細胞。優選地，本發明的細胞是人細胞。本發明最優選的細胞衍生自原代人視網膜細胞(人胚胎視網膜細胞，也稱作HER細胞)。用腺病毒E1序列對這種細胞的永生化例如在美國專利5,994,128、Byrdetal，1982，1988及Gallimoreetal，1986中描述。原代HER細胞可分離自胎兒(Byrdetal，1982，1988)。永生化HER細胞，包括優選的PER.C6細胞，是通過使用質粒轉染原代HER細胞而產生的，所述質粒含有在人磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子控制下的腺病毒血清型5(Ad5)E1A-和E1B-編碼序列(Ad5核苷酸459-3510)(見美國專利5,994,128)。在優選的實施方案中，所述細胞進一步含有可表達形式的編碼至少一種腺病毒E1B蛋白、優選E1B55K和E1B19K這兩種蛋白質的核酸。E1B蛋白質的表達可阻止細胞凋亡。為了通過細胞培養而實現重組蛋白質的大規模(連續)生產，優選所述細胞不需要貼壁就能生長。本發明的細胞具有這種能力。對於本發明的方法和應用最優選的細胞是PER.C6細胞。用於本申請目的的PER.C6細胞應是在ECACC中以96022940號保藏的細胞的上遊或下遊傳代或者上遊或下遊傳代的後代的細胞(見例如美國專利5,994,128)。PER.C6細胞與例如也已經用腺病毒E1區永生化的轉化人293細胞相比在操縱性能方面更好一些。對PER.C6細胞已經進行了鑑定並且廣泛證實，因為它們在方法升級、懸浮生長和生長因子非依賴性方面表現明顯更好。特別是PER.C6細胞可以高度可再生方式懸浮培養，使其非常適於大規模生產。另外，已經鑑定了在可以生長至極高密度的生物反應器中生長的PER.C6細胞系。PER.C6細胞在工業方法中的應用已經廣泛描述，例如Nicholsetal，2002及特別針對重組蛋白質產生，例如Yallopetal，2005a和2005b所述。本發明的細胞、特別是PER.C6細胞具有的另外優勢是其可以在沒有動物或人衍生的血清或者動物或人衍生的血清成分的情況中培養。因此較容易分離，同時由於培養物中沒有額外的人或動物蛋白質而增加了安全性，該系統非常可靠(合成培養基的再現性極佳)。另外，如本文所示，無血清培養基的使用對產生的重組蛋白質的糖基化模式具有陽性影響。另外，腺病毒早期區域1A(E1A)的存在與沒有該特定基因的(人)細胞系相比又增加了額外優勢。已知作為轉錄激活物的E1A增強從CMV立即早期基因的增強子/啟動子的轉錄(Oliveetal.，1990，Gormanetal.，1989)。當要產生的重組蛋白質在CMV增強子/啟動子的控制下時，在所述細胞中表達水平增加而在無E1A的細胞中則不增加。E1A的表達影響在這種細胞中產生的蛋白質的糖基化(WO03/038100)。N聯聚糖是與多肽的天冬醯胺殘基共價連接的糖鏈(Varkietal.1999)。N糖基化過程始於多萜醇寡糖前體與天冬醯胺前體的附著。這種前體隨後被修飾為高甘露糖雜合體或者複雜類型的寡糖。在複雜類型的N聯糖中，α3-和α6-連接的甘露糖殘基均被N-乙醯基-葡糖胺(GlcNAc)殘基取代。複雜類型的N-聚糖可含有稱作天線(antennae)的2-5個具有GlcNAc的分支。複雜類型的N聯糖的最終結構依賴於其附著的蛋白質、宿主細胞及培養宿主細胞的條件並變化很大。具有GlcNAc的分支可以用半乳糖(Gal)或N-乙醯-半乳糖胺(GalNAc)修飾，形成所謂的LacNAc或LacdiNAc結構。同樣，具有GlcNAc的分支可含有多個LacNAc結構，形成所謂的多聚乳糖胺結構。末端半乳糖可以用α2，3-或α2，6-連接的唾液酸修飾，而末端N-乙醯-半乳糖胺僅可以用α2，6-連接的唾液酸修飾。將唾液酸加入末端Gal或GalNAc是通過唾液酸轉移酶介導的。人基因組編碼大概有20種以上的不同唾液酸轉移酶(Harduin-Lepersetal.，2001)。它們在底物特異性、組織分布和多種生物化學參數方面不同。目前還沒有描述人唾液酸轉移酶可以連接唾液酸與α1，3-連接的巖藻糖修飾的LacNac或LacdiNAc結構。這種巖藻糖與GlcNAc殘基連接，從而形成所謂的Lewisx結構。然而，唾液酸化的Lewisx(唾液酸-Lewisx)結構可能存在；它們是通過其中在用α1，3-連接的巖藻糖修飾GlcNAc之前將所述唾液酸與糖附著的方法形成的。唾液酸-Lewisx結構的形成依賴於巖藻糖基轉移酶的類型。一些巖藻糖基轉移酶僅使用非唾液酸化的LacNac或LacdiNAc結構作為底物，其它僅使用唾液酸化的LacNAc作為底物，第三組的α1，3巖藻糖基轉移酶可以使用這兩種結構作為底物。在表達E1A的細胞如PER.C6細胞中產生的重組蛋白質如重組人紅細胞生成素(EPO)由於Gal的摻入低及由於存在α1，3-連接的巖藻糖而有時唾液酸化較差。本發明提供了一種增加在表達E1A的細胞如PER.C6細胞中產生的蛋白質的唾液酸含量的方法。在兩個步驟中獲得唾液酸化水平增加第一步包括增加半乳糖基化水平以為唾液酸化提供更多的(接受)位點。當調試PER.C6細胞適於在無血清培養基中懸浮生長時，發現半乳糖基化水平增加。第二步包括增加細胞催化唾液酸化過程的潛力，這通過過表達唾液酸轉移酶而實現。由於在PER.C6細胞中表達的重組蛋白質的N聯糖可能含有僅可以用α2，6-連接的唾液酸修飾的LacdiNAc結構，因此首先使用α2，6-唾液酸轉移酶增加唾液酸化水平。然而，如下文示出，本文令人驚奇地發現並揭示了也可以使用α-2，3-唾液酸轉移酶，這樣導致產生的蛋白質上的LacdiNAc結構減少。因此，兩方面看起來與增加在表達腺病毒E1A蛋白的細胞中產生的蛋白質的唾液酸化相關半乳糖基化的改良增加唾液酸化底物數目，並增加可利用的Gal和GalNAc底物的唾液酸化。本發明改良了目前描述的在表達E1A的永生化HER細胞中生產蛋白質的方法，這通過在這些細胞中過表達糖基化酶、優選唾液酸轉移酶(遺傳工程化)及通過在無血清培養基中優選懸浮培養這種細胞(代謝工程化)而實現。與目前描述的在不存在糖基轉移酶過表達及在含血清培養基中以貼壁方式培養的細胞中進行的生產方法相比，通過組合這些措施，唾液酸化的成熟N聯糖的形成可以顯著改良。這兩種措施即參與蛋白質翻譯後修飾的酶的過表達及細胞在無血清培養基中懸浮生長中的每一種措施均有助於改良的最終結果，因此本發明還包括其中每次僅採用這兩種措施中的一種措施的實施方案。當希望獲得具有高度半乳糖基化及末端唾液酸化的N聯糖的蛋白質時，最好組合本發明的這些措施。技術人員將明了這些措施可用於增加在本發明的細胞中產生的包含N聯糖的任何蛋白質的N聯糖的唾液酸化。在一個實施方案中，紅細胞生成素(EPO)或其片段、其突變蛋白或其衍生物是根據本發明的方法產生的感興趣的蛋白質。根據這種方法產生的EPO具有比在表達腺病毒E1A的細胞中產生的EPO更高的唾液酸含量，並因此更類似商購的EPO製品。商業的EPO製品通常是在CHO或BHK細胞中重組產生的，且分離的是含有高度唾液酸化的級分，因為增加的唾液酸化有益於所述蛋白質的半衰期，因此有益於發揮其提高血紅蛋白和紅細胞計數的治療作用。因此，本發明的新細胞和方法提供了使用表達E1A的細胞如表達E1A的人胚胎視網膜細胞如PER.C6細胞重組產生半衰期增加的EPO的可能性。另外，所述方法得益於可以在本發明的細胞中的高水平生產。當然，在過表達唾液酸轉移酶的表達E1A的細胞中產生的EPO或其它蛋白質也可以進行分級分離以進一步獲得具有更高的唾液酸含量的級分，對於EPO商業製品也如此進行。一方面，本發明產生的EPO經陰離子交換柱純化以獲得高度唾液酸化的級分。本文示出使用這種方法，可以自表達E1A的細胞、特別是自表達E1A的永生化HER細胞獲得具有令人驚奇的高平均唾液酸含量的EPO。在宿主細胞中產生蛋白質的方法已經充分確立並為本領域技術人員所已知。為此目的表達E1A的HER細胞的應用在WO00/63403中描述。通常，在宿主細胞中重組蛋白質的產生包括將可表達形式的核酸導入宿主細胞中，在有益於所述核酸表達的條件下培養該細胞，使得所述核酸在所述細胞中表達。或者，在希望的宿主細胞中天然表達但水平不足的蛋白質可以通過導入合適的調節序列如與希望的基因可操縱地連接的強啟動子而增加其表達水平(見例如WO99/05268所述，其中內源EPO基因通過在人細胞中所述基因上遊導入強啟動子而被過表達)。所述蛋白質可以在細胞內表達，但優選分泌進培養基中。天然分泌的蛋白質如用於藥物學應用的許多感興趣的蛋白質含有引起產生的蛋白質分泌的分泌信號。如果需要，分泌信號也可以通過本領域已知的方法加入某些蛋白質中。編碼蛋白質的可表達形式的核酸可以是表達盒形式，通常需要能引起所述核酸表達的序列，如增強子、啟動子、聚腺苷酸化信號等。幾種啟動子可用於表達重組核酸，其包括病毒啟動子、哺乳動物啟動子、合成啟動子等。在某些實施方案中，驅動感興趣的核酸表達的啟動子是CMV立即早期啟動子，例如包含CMV立即早期基因增強子/啟動子的-735至+95位核苷酸，這個啟動子已經示出在表達腺病毒E1A的細胞中提供高表達水平(見例如WO03/051927所述)。感興趣的核酸可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA、這些DNA組合等等。細胞培養基可得自多個供應商，現在無血清培養基經常用於細胞培養，因為它們比含有血清的培養基更明確。本發明的細胞在含血清培養基以及在無血清培養基中均生長良好。通常需要短時期使PER.C6細胞從含血清培養基如DMEM+9％FBS至適應無血清培養基。非常適用於本發明的無血清培養基的一個例子是EX-CELLTMVPRO培養基(JRHBiosciences，編號14561)。另一個例子是HyQCDM4RetinoTM(HyClone)。可以獲得並使用其它的無血清培養基。本發明的細胞通常在含血清培養基中貼壁生長，但在無血清培養基中非常適應懸浮生長至高細胞密度(10×106細胞/ml及更高)，這意味著它們不需要附著的表面，而是在大多數時間保持彼此及與培養容器壁的相對游離。將本發明細胞培養至高密度和/或從這些細胞中獲得極高產物產量的方法已經有描述(WO2004/099396)。改變細胞中產生的重組蛋白質的糖基化的遺傳工程觀念已經充分確立，例如在美國專利5,047,335中詳細描述。在該專利中論述了遺傳改變糖基化的一般觀念，需要向宿主細胞中導入能表達至少一種酶的至少一個基因，所述酶選自糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、β-乙醯半乳糖胺轉移酶、N-乙醯糖胺轉移酶基及磺基轉移酶(在此統稱作糖基化酶)，在所述細胞中表達足量的至少一種所述酶從而改變所述細胞產生的蛋白質的糖基化。在這個文獻的實施例中，CHO細胞的糖基化被改變，這通過轉染的大鼠α-2，6-唾液酸轉移酶基因的重組表達、導致NeuAc-alfa-2，6Gal序列存在於細胞表面碳水化合物上而實現，而在沒有轉染的基因時，僅NeuAc-alfa-2，3Gal序列在這些細胞中產生。隨後的研究確定糖基化工程可用於在宿主細胞中產生重組蛋白質(例如Grabenhorstetal.，1995；Minchetal，1995；Jenkinsetal，1998；Zhangetal，1998，Weikertetal，1999；Fukutaetal.，2000；Pratietal.，2000)。因此，如此的糖基化遺傳工程方法充分確立並為本領域技術人員所已知，可為本發明有益地應用。本文示出表達E1A的細胞也可以被遺傳工程化，因此可獲得具有令人驚奇的高平均唾液酸含量的、作為糖基化蛋白質模型的重組EPO蛋白質的組合物。為此，將可表達形式的編碼希望的糖基化酶的核酸導入本發明的細胞中，在本發明細胞培養期間當感興趣的蛋白質被表達時所述希望的糖基化酶被表達。這導致與無重組糖基化酶在細胞中表達的情況相比，感興趣的蛋白質的糖基化模式被改變。在優選的實施方案中，所述糖基化酶是唾液酸轉移酶，更優選α-2，3-唾液酸轉移酶和/或α-2，6-唾液酸轉移酶。優選地，編碼的糖基化酶是哺乳動物酶，更優選是人的酶。編碼希望的糖基化酶的核酸優選在異源啟動子控制下，所述啟動子在本發明細胞中應是有活性的或者具有被調節的可能性。優選地，將編碼糖基化酶的核酸整合進細胞基因組中，以保證穩定遺傳，並為所述酶在隨後的細胞世代中提供穩定表達。本文描述了將糖基化酶導入表達E1A的永生化HER細胞中。從實施例中可以看出，唾液酸轉移酶的表達增加了在這些細胞中重組蛋白質的唾液酸化。另外，當表達唾液酸轉移酶的表達E1A的細胞在本發明的無血清培養基中懸浮生長時，觀察到在這些細胞中表達的重組蛋白質的N聯聚糖的唾液酸化清楚顯著增加，從下文實施例3可見。因此，在本發明方法的優選實施方案中，本發明的細胞包含可表達形式的編碼糖基化酶、優選唾液酸轉移酶如α-2，6-唾液酸轉移酶的核酸，其例如在異源啟動子即不是編碼所述糖基化酶的基因的天然啟動子的啟動子的控制下。合適的α-2，6-唾液酸轉移酶是人α-2，6-唾液酸轉移酶，其序列由Grundmannetal，1990描述。在另一優選的實施方案中，所述細胞包含可表達形式的編碼α-2，3-唾液酸轉移酶的核酸，例如在異源啟動子的控制下。所述α-2，3-唾液酸轉移酶可例如是人α-2，3-唾液酸轉移酶，稱作SIAT4C或STZ(Genbank登記號L23767，也見於美國專利5,494,790)。如上述及WO03/038100所述，包含LewisX結構的EPO分子可以在表達腺病毒E1A序列的細胞如PER.C6細胞中適當產生。存在於糖蛋白如EPO的N聯聚糖上的LewisX結構是在乳糖胺類型天線結構中包含與N-乙醯葡糖胺附著的α1，3-連接的巖藻糖的結構。有兩種類型的LewisX結構一種具有末端半乳糖，一種具有末端N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)殘基。這些末端基團可以或不與唾液酸連接；當與唾液酸連接時，LewisX結構是唾液酸-LewisX結構。因此，對於本發明，唾液酸-LewisX結構是LewisX結構的亞型。在WO03/038100中描述的包含具有LewisX結構的N聯聚糖的蛋白質的一個優勢是這種結構可有助於所述蛋白質與某些選擇蛋白結合併提供抗炎性質。然而如上文所述，如果這種蛋白質包含增加的末端唾液酸化則對於增加半衰期及因此蛋白質在某些治療應用中的效力也是有益的。例如，如WO03/038100所述在PER.C6細胞中產生的紅細胞生成素(EPO)包含LewisX結構，但唾液酸水平低(見實施例8，表4)。本發明所述方法提供了獲得包含LewisX結構及與其糖結構附著的唾液酸部分數目增加的蛋白質分子的可能性。本發明因此提供了一種包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子至少1個LewisX結構，及b)每個EPO分子至少6個唾液酸部分。這種同種型的混合物可以通過在無血清培養基中懸浮培養的、進一步過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生EPO而獲得。先前揭示的在PER.C6細胞中產生EPO的方法(WO03/038100)產生包含LewisX結構但唾液酸量明顯較低的EPO(見表4第1條)。所述組合物通常作為EPO同種型的混合物獲得，但是本領域技術人員可以分離出單獨的同種型，如美國專利5,856,298特別是其實施例1所述。在更優選的實施方案中，所述組合物平均包含每個EPO分子至少7個唾液酸部分，更優選每個EPO分子至少8個唾液酸部分。唾液酸部分主要作為末端唾液酸存在於N聯聚糖上，但一些唾液酸可存在於O聯聚糖上並組成所述組合物的平均唾液酸含量。在某些實施方案中，本發明的EPO分子包含3個N聯聚糖。在某些實施方案中，本發明的EPO分子包含3個N聯聚糖和1個O聯聚糖。LewisX結構存在於EPO分子的N聯聚糖上。本文示出在過表達唾液酸轉移酶及在無血清培養基中懸浮培養的PER.C6細胞中表達時，獲得平均具有每個EPO分子大約1.2-1.8個LewisX結構和大約9個唾液酸的EPO分子的組合物(見表4第2條)。在某些實施方案中，本發明因此提供了一種包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子1-2個LewisX結構，及b)每個EPO分子8-10個唾液酸部分。這種組合物可用於進一步純化及獲得更優選的平均唾液酸含量仍較高的組合物。本發明因此還提供了包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子至少0.5個LewisX結構，及b)每個EPO分子至少10個唾液酸部分。優選地，這種組合物平均包含每個EPO分子至少11個唾液酸部分。本文示出分離時可以獲得平均包含每個EPO分子大約0.6個LewisX結構及大約12.6個唾液酸部分的EPO級分(見表4第3條)。在某些實施方案中，本發明因此提供了一種包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子0.5-1個LewisX結構，及b)每個EPO分子11-13個唾液酸部分。對比之下，以同樣方式分析的商購EPO製品不包含LewisX結構，平均每個EPO分子含有大約12.4個唾液酸(見表4第3條)。本發明提供了更優選的EPO組合物，其平均包含少於1個、優選少於0.5個、更優選少於0.3個Lewisx結構，在優選的實施方案中不包含Lewisx結構(或者至少在如本文所揭示方法的檢測低限之下)，同時進一步平均包含每個EPO分子12-15、更優選13-15個唾液酸。在某些實施方案中，所述EPO平均含有每個EPO分子少於0.3個Lewisx結構至使用本發明所述方法不可檢測到Lewisx結構及14-15個唾液酸。本發明的組合物優選包含5或更少個EPO同種型，其一共佔所述組合物中存在的EPO的至少70％、優選至少80％，更優選包含4或更少個EPO同種型，其一共佔所述組合物中存在的EPO的至少70％、優選至少80％。所述EPO組合物可以根據本文揭示的方法製備，根據本發明可以獲得多種EPO組合物，其體內生物學活性各不相同，從少於10％至大約100％的EPOBRP標準或商購EPO製品。在某些實施方案中，根據Pharmacopoiea(PHEUR)標準方法測定由此獲得的EPO具有1％-20％的體內生物學活性。在其它實施方案中，獲得這些數值為20％-40％的製品，在另外的實施方案中，這些數值為40％-120％，優選60％-120％，更優選80％-120％。因此可以提供具有不同體內生物學紅細胞生成活性和/或不同藥動學的EPO製品系列。較低的紅細胞生成形式(具有相對低的唾液酸含量)可適用於細胞保護目的，而較高的紅細胞生成形式(具有相對高的唾液酸含量)適於紅細胞生成以及細胞保護目的。對於後者而言，可有利地應用較高的唾液酸化形式，因為其半衰期延長及藥動學性質改良，同時紅細胞生成活性可被或不被削弱。具有削弱的紅細胞生成活性的EPO的例子是如Leistetal(2004)所述EPO突變蛋白，例如EPOS100E或R103E，其不具有明顯的紅細胞生成活性但在細胞保護中仍具有作用這種EPO也可以根據本發明揭示的方法製備，從而改良施用後的半衰期。紅細胞生成素優選是人紅細胞生成素、人紅細胞生成素的片段或人紅細胞生成素的突變蛋白。這種紅細胞生成素應優選是生物學活性的，這意味著其應具有至少一種如下活性a)導致骨髓細胞增加網織紅細胞和紅細胞的產生，增加血紅蛋白合成或鐵的吸收(見例如美國專利4,703,008)(統稱作紅細胞生成活性)，和/或b)選自如下的應答性細胞保護性活性保護、維持、增強或恢復應答的哺乳動物細胞、組織或器官的功能或生存力(在本文有時統稱作細胞保護性活性)，例如在WO00/61164和WO02/053580中所揭示。人紅細胞生成素的序列已熟知(例如美國專利5,441,868；歐洲專利0411678，cDNAGenbank登記號MI1319)。結合EPO受體及具有與EPO相關的一些活性的EPO突變蛋白、類似物、肽或片段例如在美國專利5,457,089、4,835,260、5,767,078、5,856,292、4,703,008、5,773,569、5,830,851、5,835,382及國際出版物WO95/05465、WO97/18318和WO98/18926中描述，為了揭示具有生物學活性的EPO片段和EPO突變蛋白的目的，所述文獻均併入本文作參考。本發明的EPO也可以被修飾，例如WO02/053580所述，通過對EPO分子中的一或多個賴氨酸進行氨甲醯化而修飾(見例如WO02/053580，Leistetal，2004)，這種修飾的EPO無紅細胞生成活性，但保留其組織保護性活性。也已經發現某些EPO突變體具有這些性質(Leistetal，2004)，如在第100位的絲氨酸突變為穀氨酸的EPO(EPO-S100E)及第103位的精氨酸突變為穀氨酸的EPO(EPO-R103E)。這些及其它EPO突變體的目錄在WO2004/003176中揭示，所述文獻在此併入作參考。所有這些修飾的EPO分子及所有這些突變蛋白均包括在本發明紅細胞生成素的範圍中。在某些實施方案中，EPO是人EPO，其含有4個碳水化合物鏈。其中三個含有與天冬醯胺的N鍵，一個含有與絲氨酸殘基的O-鍵。糖基化在EPO生物學活性中的重要性已經充分證實(Delormeetal.1992；Yamaguchietal.1991)。上述EPO組合物可以使用本文揭示的新方法獲得。本發明因此進一步提供了一種獲得包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物的方法，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖包含平均每個EPO分子至少6個唾液酸及0-2個Lewisx結構，所述方法包括a)提供含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列及進一步含有可表達形式的編碼EPO的核酸的真核細胞，其中所述細胞進一步含有在異源啟動子控制下的編碼唾液酸轉移酶、優選α-2，6-唾液酸轉移酶或者α-2，3-唾液酸轉移酶的核酸序列；b)在無血清培養基中培養所述細胞並使得EPO在所述細胞中表達；c)從所述細胞和/或培養基中收穫表達的EPO；及d)純化並分級分離EPO以獲得每個EPO分子N聯聚糖的平均唾液酸含量增加的級分，獲得包含一或多種同種型EPO的組合物，所述EPO包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖包含平均每個EPO分子至少6個唾液酸及0-2個Lewisx結構。所述唾液酸轉移酶和所述E1A蛋白在細胞培養期間也被表達。在這個方法的某些實施方案中，使用本文例證的方法在EPO組合物中檢測無Lewisx結構，意味著在分離自所述組合物的N聯聚糖的MALDI-MS譜的平均值中沒有10％或更高強度的峰包含Lewisx結構。在某些實施方案中，少於5％及在某些實施方案中獲得的EPO製品中無一聚糖包含Lewisx結構。在其它實施方案中，獲得本文所述多種EPO組合物之一。純化及進一步分級分離EPO組合物、富集每個EPO分子平均唾液酸含量增加的EPO的方法[本發明方法步驟d)]為本領域技術人員所已知，包括例如陰離子交換層析、製備性等電聚焦(IEF)、層析聚焦、親和層析例如使用凝集素的親和層析、毛細管區帶電泳(CZE)等。例如通過過表達糖基轉移酶對本發明細胞系進行工程化的另一優勢是由工程化的細胞產生的蛋白質上存在的聚糖天線(antennarity)通常增加，即通常存在更多的三或四天線結構。另外，由此產生的蛋白質上聚糖的複雜性(異質性)通常降低。這是有益的，因為增加的天線可改良蛋白質如EPO的半衰期和/或生物學活性(Takeuchietal，1989)，及對於調節和經濟目的而言，希望產生的蛋白質上的聚糖混合物的複雜程度較低。因此，本發明還提供了一種增加在細胞中重組產生的蛋白質的聚糖的天線和/或降低異質性的方法，所述方法特徵在於在所述細胞中過表達唾液酸轉移酶。在某些實施方案中，所述細胞是表達腺病毒E1A的細胞，如表達E1A的HER細胞，如PER.C6細胞。在某些實施方案中，所述糖基轉移酶是唾液酸轉移酶，在某些實施方案中其選自α-2，3-唾液酸轉移酶和α-2，6-唾液酸轉移酶。所述唾液酸轉移酶可以是人唾液酸轉移酶，例如稱作SIAT4C或STZ的人α-2，3-唾液酸轉移酶(Genbank登記號L23767，也見美國專利5,494,790)。未曾預料地觀察到如本文所述的糖基化工程化提供了有力的細胞培養方法，因為如此產生的重組蛋白質的糖基化性質在細胞培養條件改變時並不明顯改變，而對於未工程化的細胞，培養條件改變通常會導致糖基化性質降低。因此，本發明一方面提供了增加糖蛋白在細胞中重組表達的過程的力度的方法，所述方法特徵在於在所述細胞中過表達唾液酸轉移酶。在某些實施方案中，所述細胞是表達腺病毒E1A的細胞，如表達E1A的HER細胞，如PER.C6細胞。在某些實施方案中，糖基轉移酶是唾液酸轉移酶，在某些實施方案中其選自α-2，3-唾液酸轉移酶和α-2，6-唾液酸轉移酶。所述唾液酸轉移酶可以是人唾液酸轉移酶，例如稱作SIAT4C或STZ的人α-2，3-唾液酸轉移酶(Genbank登記號L23767，也見美國專利5,494,790所述)。另外，本文示出與預期的相反，表達腺病毒E1A的細胞如PER.C6細胞(其產生在這種細胞中表達時通常在其聚糖中包含所謂LacdiNAc結構的重組蛋白質)可以通過過表達α-2，3-唾液酸轉移酶而被工程化，由此觀察到產生的蛋白質上高水平的唾液酸化而未觀察到LacdiNAc結構。這是未曾預料的，因為認為LacdiNAc結構的形成不依賴於唾液酸化而發生。事實上，LacdiNAc在潛在地加入唾液酸之前形成。本文描述的新發現因此表明α-2，3-唾液酸轉移酶的過表達間接抑制LacdiNAc結構的形成。本發明因此提供了一種降低在細胞中重組表達的蛋白質上LacdiNAc結構的平均含量及任選增加唾液酸平均含量的方法，所述方法包括在所述細胞中過表達α-2，3-唾液酸轉移酶。在某些實施方案中，所述細胞是表達腺病毒E1A的真核細胞，如表達E1A的HER細胞，如PER.C6細胞。唾液酸轉移酶的過表達可以如上述完成。在如上述培養所述細胞期間，所述細胞中唾液酸轉移酶的過表達及感興趣的蛋白質一起表達。所述感興趣的蛋白質是當表達時含有至少一個N聯聚糖的蛋白質。當在所述細胞類型中表達時，在其N聯聚糖上含有至少可檢測量的LacdiNAc結構，例如在如此產生的至少10％的蛋白質的至少一個N聯聚糖上含有至少一個LacdiNAc結構。優選地，所述蛋白質上LacdiNAc結構的平均含量降低至少20％、更優選至少50％、更優選至少80％。最優選地，所述降低是所得蛋白質在其N聯聚糖上含有使用本文所述的方法不可檢測到量的LacdiNAc結構，例如在對分離自所述蛋白質的N聯聚糖進行的MALDI-MS譜的平均值中，沒有具有10％或更高強度的峰包含LacdiNAc結構。唾液酸轉移酶優選由在異源啟動子控制下的編碼α-2，3-唾液酸轉移酶的核酸編碼，該核酸優選整合進細胞的基因組中。本發明的唾液酸轉移酶在某些實施方案中是人α-2，3-唾液酸轉移酶，如已知的SIAT4C或STZ(Genbank登記號L23767，也見美國專利5,494,790所述)。為了例證本發明，提供了如下實施例，但非限制本發明的範圍。實施例實施例1通過過表達α2，6-唾液酸轉移酶增加PER.C6細胞產生的EPO的唾液酸化為了確定α2，6-唾液酸轉移酶的過表達對於在PER.C6細胞中產生的EPO的唾液酸化的作用，在過表達α2，6唾液酸轉移酶的PER.C6細胞系PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10(見WO03/048348的實施例2所述，在此併入作參考)及不過表達α2，6-唾液酸轉移酶的親代細胞系PER.C6-EPO克隆25的貼壁培養物中產生EPO。首先將細胞在T形瓶中在DMEM+10mMMgCl2+9％FBS中培養。在細胞生長至60-70％鋪滿時，將含有血清的培養基用無血清的DMEM+10mMMgCl2更換。然後在37℃和10％CO2條件下繼續培養3-4天。之後收穫培養上清，使用WO03/038100(所述內容全文併入本文作參考)所述方法純化及分析EPO。通過等電聚焦確定PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10及其親代細胞系產生的EPO的唾液酸含量。從圖1所示結果中可觀察到，過表達α2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO的唾液酸含量高於不過表達α2，6-唾液酸轉移酶的親代PER.C6細胞系產生的EPO的唾液酸含量，表明α2，6-唾液酸轉移酶的過表達導致PER.C6-產生的EPO的唾液酸化增加。實施例2通過將細胞適應在無血清培養基中懸浮生長使PER.C6細胞產生的EPO的半乳糖基化和巖藻糖基化水平增加使用產生EPO的穩定PER.C6細胞系PER.C6-022評價當貼壁培養細胞(使用實施例1所述方法)及當使細胞適應在無血清培養基中生長時EPO的半乳糖基化水平。對於後者，揭示了一種方法以在無血清培養基中懸浮培養PER.C6細胞以產生EPO。所述方法在下文描述及應用於一些產生EPO的PER.C6細胞系。使用PER.C6-EPO-022細胞產生具有N聯聚糖結構的EPO，所述結構對於未修飾的PER.C6細胞是典型的，如WO03/038100所述。為了產生PER.C6-EPO，將上述細胞系適應無血清培養基，即Excell525(JRHBiosciences)。因此，首先在T80培養瓶中在DMEM+9％FBS+10mMMgCl2中培養細胞至形成70％-90％鋪滿的單層，之後根據常規培養技術用PBS洗滌及經胰蛋白酶消化。隨後將細胞懸浮於DMEM+9％FBS+10mMMgCl2中並在臺式離心儀中在1000rpm離心5分鐘。棄去上清，將細胞再懸浮於無血清培養基Excell525+4mML-穀氨醯胺中，細胞密度為0.3×106細胞/ml。將25ml細胞懸浮液置於250ml搖瓶中，以100rpm在37℃及5％CO2條件下搖動。在達到≥1×106細胞/ml的細胞密度之後，將細胞進行亞培養。因此，將細胞在1000rpm旋轉5分鐘，懸浮於新鮮的Excell525+4mML-穀氨醯胺中，細胞密度為0.2或0.3×106細胞/ml，在搖瓶中在37℃、5％CO2及100rpm條件下進一步培養。為了產生EPO，將細胞移至無血清生產培養基即VPRO(JRHBiosciences)中，所述培養基支持PER.C6細胞生長至極高細胞密度(通常在一批培養物中＞107細胞/ml)。為此，首先將細胞在Excell525中培養至≥1×106細胞/ml，然後以1000rpm旋轉5分鐘，隨後懸浮於VPRO培養基+6mML-穀氨醯胺中至密度為1×106細胞/ml。然後將細胞在搖瓶中在37℃、5％CO2及100rpm條件下培養7-10天。在此期間，細胞生長至＞107細胞/ml的密度。在細胞存活力開始下降之後收穫培養基。將細胞以1000rpm旋轉5分鐘，使用上清量化和純化EPO。EPO的濃度使用ELISA(RDsystems)確定，由PER.C6-EPO-022產生的EPO為14,044eU/ml。之後，如先前所述(WO03/038100，併入本文作參考)使用抗EPO抗體通過親和層析純化EPO。對由PER.C6細胞產生的EPO上N聯聚糖的組成使用MALDI-MS進行分析。因此，使用MilliporeMicrocon10濃縮儀對糖蛋白樣品進行濃縮並用20mM磷酸鈉(pH7.2)緩衝置換，獲得終濃度為大約1μg/μl。隨後，將所述糖蛋白用PNGaseF消化，釋放N聯聚糖，將樣品與神經氨酸酶一起保溫，除去唾液酸殘基。使用MALDI-MS分析不用進一步純化的去唾液酸化的聚糖集合。以反射模式(reflectormode)在AppliedBiosystemsVoyagerDEPro質譜儀上進行陽離子MALDI-MS；使用2，5-二羥基苯甲酸作為基質(DHB，10mg/ml於50/50/0.1乙腈/水/三氟乙酸中)。使用DataExplorer軟體中的函數和參數對用上述方法獲得的質譜進行平滑化(smoothed)。首先，使用高級基線校正工具(peakwidth32，flexibility0.5，degree0.1)對質譜進行基線校正。之後，使用NoiseRemoval函數(stddevtoremove＝2)降低質譜中的噪音。圖2示出在PER.C6細胞貼壁培養物及在無血清培養基中的PER.C6懸浮細胞培養物中產生的EPO上N聯聚糖的代表性質譜模式。所述質譜顯然不同，示出在懸浮培養物中產生的N聯糖的質譜通常遠大於在貼壁培養物中產生的那些，表明EPO在無血清培養基中懸浮培養的PER.C6細胞中更充分的糖基化。為了獲得對在不同細胞培養條件下糖基化差異的更深入的了解，使用GlycoMod軟體(www.expasy.ch/tools/glycomod)將聚糖組成和碳水化合物結構歸於在質譜中觀察到的峰。這個軟體基本上預測了具有任何特定觀察到的質量的聚糖結構上的N-乙醯-氨基己糖(HexNAc)、己糖(Hex)和脫氧己糖(dHex)的數目。使用這種方法，可以正確地將複雜類型的碳水化合物組成歸於強度≥10％的所有峰。無跡象表明強度≥10％的任何峰均含有磷酸鹽或硫酸鹽。為了進一步預測碳水化合物的結構，假定N聯糖均含有兩個HexNAcs(2×GlcNAc)、三個己糖(3×甘露糖)和一個dHex(1×巖藻糖)的一個基本核心結構。這種假設基於通常已知的複雜類型N聯糖的巖藻糖基化的核心結構(Varkietal.，1999)及基於如WO03/038100(併入本文作參考)所述的PER.C6產生的EPO上N-聚糖的序列數據，證實PER.C6產生的EPO上基本上所有N聯聚糖均含有一個巖藻糖基化核心結構。PER.C6產生的EPO的質譜圖(見例如圖2)示出觀察到的所有種類的糖均具有大於僅具有巖藻糖基化核心的相應糖的質量。因此，PER.C6產生的EPO的N-聚糖除了這種巖藻糖基化的核心結構之外，還含有其它HexNAc和/或Hex和/或dHex殘基。這些殘基形成複雜的N聯糖的天線。假定任何額外的dHex殘基均是α1，3-連接的巖藻糖，任何額外的Hex殘基均是半乳糖，任何額外的dHex殘基均是GlcNAc或GalNAc。這種假設基於由哺乳動物和人細胞產生的複雜類型的N聯糖的通常已知結構(Varkietal.，1999)，基於如WO03/038100(併入本文作參考)所述的PER.C6產生的EPO上N-聚糖的序列數據及基於觀察到PER.C6產生的EPO上N聯糖可含有GalNAc(也在WO03/038100中描述，併入本文作參考)。基於上述假設，將推定的聚糖結構歸於質譜中存在的強度≥10％的所有峰。隨後使用相對峰高度確定不同種類聚糖的相對出現。由於參與GlcNAc-Gal(LacNAc)結構中的Gal殘基的數目可以從推定的聚糖結構中推導出，因此可以計算PER.C6-EPO上存在的每個N聯聚糖的Gal殘基的平均數目(EPO含有3個N聯聚糖，因此獲得的數目可以乘以3以獲得每個EPO分子這種殘基的平均數)(見表1所示)。表1示出在適應無血清培養基(VPRO(S))中懸浮生長的細胞中產生的EPO中Gal殘基的平均數明顯高於在存在血清下(DMEM)貼壁生長的細胞產生的EPO中的相應殘基數。因此可以推斷半乳糖基化水平通過使細胞適應在無血清培養基中懸浮生長而被顯著增加。表1示出參與GlcNAc-GalNAc(LacdiNAc)結構中的GalNAc殘基的平均數目明顯不受培養條件改變的影響。形成所謂Lewisx結構的推定的α1，3-連接的巖藻糖的平均數目適應在無血清培養基中懸浮培養的細胞中顯著增加。這可以部分由這樣的事實解釋即在這些條件下半乳糖基化增加，由此導致其中可以加入α1，3連接的巖藻糖的更多GlcNAc-Gal序列形成。向其中可以加入α1，3連接的巖藻糖的另一結構是GlcNAc-GalNAc(LacdiNAc)。然而，增加的α1，3-巖藻糖基化似乎不是歸因於LacdiNAc結構的出現增多，因為GalNAc殘基的平均數不明顯受改變培養條件的影響。Gal+GalNAc殘基的平均數相應於可以向其中潛在地加入α1，3-連接的巖藻糖的LacNAc和LacdiNAc結構的平均數。當確定了Gal+GalNAc(LacNAc和LacdiNAc結構的一部分)的出現與Lewisx結構的出現之間的比率時(見表1)，可以推斷當細胞在無血清培養基中懸浮生長時與細胞在存在血清下貼壁培養時相比，參與Lewisx結構的可用Gal+GalNAc殘基多兩倍以上。這表明在無血清培養基中懸浮培養的細胞中(α1，3)巖藻糖基化增加。實施例3在過表達α2，6-唾液酸轉移酶並在無血清培養基中懸浮培養的細胞中唾液酸化水平進一步增加我們論述了在無血清培養基中懸浮培養物中半乳糖基化水平增加有益於在過表達α2，6-唾液酸轉移酶的細胞中獲得較高水平的唾液酸化，因為增加的半乳糖基化導致更多的唾液酸可以與之連接的GlcNAc-Gal結構形成。因此，使PER.C6-EPO克隆25-3.10適應在無血清培養基中懸浮培養，及如實施例2所述在VPRO培養基中產生EPO。基本如WO03/038100所述，使用等電聚焦分析EPO的唾液酸含量。不用Western印跡分析觀察EPO，而將EPO用膠體藍(colloidalblue，Novex)染色。條帶代表含有每個EPO分子不同量的唾液酸的EPO同種型。將在過表達α2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO的唾液酸含量與Eprex及不過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞產生的EPO進行對比(圖3)。結果表明過表達大鼠α2，6唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO較不過表達唾液酸轉移酶的PER.C6中產生的EPO含有明顯更多的唾液酸。特別地，在Eprex中存在的高度唾液酸化的EPO同種型在衍生自過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞的EPO製品中充分再現，而這些同種型在普通PER.C6細胞(即不過表達唾液酸轉移酶)產生的EPO中未充分再現或不存在。也呈現出衍生自在VPRO中產生的PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10(該細胞已經適應在無血清培養基中懸浮生長)的EPO的唾液酸含量高於衍生自未適應無血清培養基的同樣細胞系的EPO的唾液酸含量(圖1與圖3對比)。這表明適應在無血清培養基中懸浮生長及過表達α2，6-唾液酸轉移酶均有助於唾液酸化水平的增加。實施例4PER.C6細胞中α2，6唾液酸轉移酶的過表達導致α1，3巖藻糖基化降低在過表達α2，6-唾液酸轉移酶的細胞即PER.C6-EPO-ST25-3.10細胞的無血清懸浮培養物及在其不過表達唾液酸轉移酶的親代細胞系即PER.C6-EPO克隆25中產生EPO以分析α2，6-唾液酸轉移酶的過表達對於EPO的糖基化的作用。生產和分析N聯聚糖的方法如實施例2所述。對聚糖的分析(表2)示出由過表達α2，6-唾液酸轉移酶的細胞產生的EPO平均每個N聯聚糖含有0.4-0.6個Lewisx結構，而由不過表達唾液酸轉移酶的親代細胞系產生的EPO平均每個N聯聚糖含有0.9個Lewisx結構。這示出唾液酸轉移酶的過表達導致α1，3-巖藻糖基化降低。提示負責加入α1，3-連接的巖藻糖的巖藻糖基轉移酶與唾液酸轉移酶競爭修飾末端GlcNAc-Gal和GlcNAc-GalNAc序列。實施例5α2，6唾液酸轉移酶的過表達導致每N聯聚糖具有高唾液酸含量為了確定α2，6-唾液酸轉移酶的過表達對於PER.C6產生的EPO(PER.C6-EPO)的各個N聯糖的唾液酸化的作用，監測PER.C6-EPO的N聯糖的唾液酸含量。因此，基於電荷分離PER.C6-EPO的N聯糖以區分含有0、1、2、3或4個唾液酸的糖。為此，濃縮衍生自過表達或不過表達α2，6-唾液酸轉移酶的細胞的PER.C6-EPO樣品，用20mM磷酸鈉(pH7.2)緩衝置換，使用MilliporeMicrocon10濃縮儀濃縮至濃度為大約0.25-0.5μg/μl。隨後，將糖蛋白用PNGaseF消化，釋放N聯聚糖。將釋放的聚糖通過乙醇沉澱(75％v/v，4℃)從蛋白質中分離，在室溫於SpeedVac離心機中乾燥。接著，將所述聚糖於含有1M硼氫化氰(cyanoborohydride)的二甲亞碸-冰乙酸(30％v/v)的10μl鄰氨基苯甲酸中溶解及用鄰氨基苯甲酸(AA)標記。反應在65℃進行2小時，之後將標記混合物加到玻璃支持物中的纖維素平皿(直徑1-cm)上。將該平皿用1ml96％(v/v)乙腈洗滌5次以除去AA及其它反應物。將標記的聚糖用水(0.5ml)洗滌3次而洗脫，在室溫於SpeedVac離心機中乾燥，之後進行分析。使用弱陰離子交換柱(Vydac，301VHP575P)在HPLC上以0.4ml/分鐘的流速分離AA標記的聚糖，二元梯度為A(於水中20％的乙腈)和B(500mM乙酸銨pH5.0，20％乙腈)。使用這種方法，分離無、單、二、三和四唾液酸化的聚糖，這已經用已知的寡糖標準如NA2、A1、A2[F]、A3和A4F(GlykoInc.，OxfordGlycoSciences，amdDextra-Labs)證實。圖4中的結果示出在過表達α2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的N聯糖與在不過表達α2，6-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO的N聯糖相比含有明顯更多的唾液酸。這表明α2，6唾液酸轉移酶的過表達與α2，6-唾液酸轉移酶未過表達相比產生具有較多唾液酸含量的N聯糖。實施例6通過離子交換層析分離高唾液酸化的PER.C6-EPO由PER.C6產生的高唾液酸化的EPO的分離基於離子交換(特別是陰離子交換)層析，在此期間將高唾液酸化的EPO分子從較低唾液酸化的分子中分離。首先，將根據實施例3所述方法由PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10細胞產生的EPO通過親和層析純化，如WO03/038100所述使用EPO特異性E14單克隆抗體進行。在這個步驟中，將EPO用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脫，通過加入磷酸鉀緩衝液(pH8.0)立即中和。所得緩衝液隨後使用Hiprep26/10脫鹽柱置換為20mMTris、20μMCuSO4(pH7)。然後，將純化的EPO加樣於HiTrapQHP柱(Pharmacia)。首先將該柱用加樣緩衝液(20mMTris，20μMCuSO4(pH7))洗滌，然後用濃度逐步增加的洗脫緩衝液(20mMTris，20μMCuSO4，1MNaCl)逐步洗脫。含有低或中等唾液酸含量的EPO首先用11.5％洗脫緩衝液(115mMNaCl)洗脫，高唾液酸化的EPO用25％洗脫緩衝液(250mMNaCl)洗脫。所得EPO級分的唾液酸含量使用實施例3所述的等電聚焦分析。圖5示出分級分離的和未分級分離的PER.C6-EPO的唾液酸含量。結果示出分級分離程序使得高唾液酸化的EPO分子得以純化和富集。圖6示出為了進行質譜分析進行去唾液酸化的高唾液酸化的PER.C6-EPO級分的MALDI-MS質譜。基於實施例2所述假設對所述質譜進行的解釋表明分級分離的、高唾液酸化的PER.C6-EPO製品主要含有四天線的、完全半乳糖基化的N聯糖。對每個N聯聚糖的Gal、GalNac和Lewisx結構的平均數進行量化表明源自EPO分子總集合中的分級分離的EPO分子含有較高平均數的Gal殘基，但含有較低平均數的GalNAc和Lewisx結構(見表3所示)。這示出當使用離子交換層析對高唾液酸化的EPO分子基於其電荷進行分級分離和富集時，可以選擇具有Gal殘基數增加而GalNAc和Lewisx殘基數減少的EPO分子。實施例7高唾液酸化的PER.C6-EPO的紅細胞生成活性為了揭示PER.C6-EPO的唾液酸含量增加導致紅細胞生成活性增加，在大鼠中研究如根據實施例4產生的高唾液酸化的PER.C6-EPO的紅細胞生成活性。重組人EPO刺激紅細胞產生的潛力可以在由Barboneetal.(1994)描述的齧齒動物模型中監測。根據這個模型，網織紅細胞計數的增加用作重組人EPO製品的生物學活性的測量標準。網織紅細胞是紅細胞的前體，其應答EPO的產生可用作EPO刺激紅細胞產生的潛力的測量標準。接著，紅細胞的產生增加導致較高的血細胞比容值。在6組3隻Wag/Rij大鼠中對比高唾液酸化的PER.C6-EPO與Eprex的活性。在第0、1和2天經陰莖靜脈通過靜脈內注射不同劑量的PER.C6-EPO、Eprex和用作陰性對照的稀釋緩衝液。施用PER.C6-EPO和Eprex的劑量為1、5、25或者125eU(Elisa單位)，根據商購的EPO特異性RDElisa試劑盒確定。將所有EPO製品在總體積為500μl的PBS/0.05％Tween80中稀釋為合適的濃度。在第3天，通過舌穿刺取250μl的EDTA血樣。同一天，確定總紅細胞群中網織紅細胞的百分比。或者，根據EuropeanPharmacopoeia(PHEUR01/20021316)所述在Normocythaemic小鼠中在體內生物學分析中測定紅細胞生成活性(見實施例13所述)。實施例8通過等電聚焦和光密度分析確定PER.C6產生的EPO的唾液酸含量使用等電聚焦分析多種親和純化的PER.C6產生的EPO樣品的唾液酸含量，所述分析在浸泡在含有8M尿素的pH3-10的兩性電解質溶液中的IsoGel瓊脂糖IEF平板(Cambrex)上進行。用膠體藍(Novex)觀察EPO條帶。如圖7所示，條帶表示含有每個EPO分子不同數目唾液酸的EPO同種型。每個同種型的相對量使用光密度分析條帶而確定。每個EPO分子的唾液酸殘基的平均數使用下式計算n=0-15(An*n)]]>A＝每個同種型的相對量n＝同種型數目(相應於每個EPO分子唾液酸殘基的數目)使用這種方法，發現由克隆PER.C6-EPO-022產生的EPO(如實施例2所述)及由PER.C6-EPO-ST細胞系克隆25-3.10產生的EPO(如實施例3所述)及在分級分離高唾液酸化的PER.C6-EPO-ST分子之後獲得的EPO(如實施例6所述)以及EPREX的平均唾液酸含量分別為3.0、9.0、12.6和12.4。也可以使用另外的計算重組EPO級分的唾液酸含量的方法，例如美國專利5,856,298的實施例2所述方法，或者CA2309810A1的實施例5所述方法，或者Jourdianetal，JBiolChem.246，430(1971)所述方法，或者對本領域技術人員已知的這些方法的修改方法。實施例9EPO-ST3表達載體的構建為了構建同時表達EPO和α2，3-唾液酸轉移酶的表達載體，將EPO編碼序列通過PCR擴增(正向引物5』-CCAGGCGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCC-3』(SEQ.ID.NO.1)，反向引物5』-CCGGGTTAACTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3』(SEQ.ID.NO.2))。將所得PCR片段用AscI和HpaI消化，插入表達質粒pcDNA3002Neo的相同限制位點中，產生載體pCP-EPO(圖8A)。將人α2，3-唾液酸轉移酶編碼序列(稱作SIAT4C或STZ的基因；GenBank登記號no.L23767，也見美國專利5,494,790所述)通過PCR擴增(正向引物5』-GGACTAGTGGATCCGCCACCATG-3』(SEQ.ID.NO.3)，反向引物5』-GCTCTAGATCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3』(SEQ.ID.NO.4))，用BamHI和XbaI消化，插入pCP-EPO的BamHI和NheI位點中。所得載體稱作pEPO-ST3(圖8B)。實施例10pEPO-ST3在PER.C6細胞中的瞬時表達在轉染前一天，將PER.C6細胞以3千5百萬個細胞/瓶的密度接種在T175培養瓶中，在含有10mMMgCl2和9％胎牛血清的DMEM中、在37℃和10％CO2條件下培養。利用本領域技術人員已知的技術，根據廠商指導使用Lipofectamine(Gibco)，用28μg/瓶的pEPO-ST3(見實施例9，圖8B)或者pCP-EPO(作為對照；見實施例9，圖8A)進行轉染。在轉染3或4天後，收穫培養上清，通過離心和過濾澄清。上清中的EPO濃度通過ELISA(使用購自RDsystems的試劑盒)確定，將EPO通過親和層析純化。純化的EPO樣品的濃度通過HPLC確定，隨後將18μg純化的EPO樣品通過等電聚焦(IEF)分析，以分離EPO同種型(圖9)。發現用pEPO-ST3構建體瞬時轉染的PER.C6細胞產生唾液酸化水平顯著增加的EPO(與沒有α2，3-唾液酸轉移酶的對照構建體pCP-EPO相比)。這表明與α-2，6-唾液酸轉移酶相同，α2，3-唾液酸轉移酶的共表達也可用於增加在PER.C6細胞中產生的EPO的唾液酸化水平。實施例11pEPO-ST3在PER.C6細胞中的穩定表達親代克隆的轉染、分離和篩選通過從單一質粒pEPO-ST3中表達人EPO及人α-2，3唾液酸轉移酶而生產可產生高唾液酸化的紅細胞生成素(EPO)的PER.C6克隆(見實施例9)。為了獲得穩定克隆，用構建體pEPO-ST3進行基於lipofectAMINE的轉染。在補加了10％胎牛血清的含有選擇劑Geneticin(終濃度為0.5mg/ml)的DMEM(Gibco)中選擇穩定克隆。在開始轉染3周後，長出Geneticin-抗性克隆。選擇共479個克隆進行分離。將分離的克隆在選擇培養基中培養，直至在96孔平板中達到70-90％鋪滿。在從96孔平板向24孔平板傳代期間，收穫上清並在2-8℃貯存直至進行篩選。使用EPO特異性ELISA(QuantikineIVDHumanEpoImmunoassay，manufacturersprotocol)對346個克隆的上清篩選EPO的產生。發現克隆之間的表達水平在背景水平之間變化，超過400eU/ml/天。選擇15％的最高等級克隆和15％的隨機選擇的克隆(產生超過50eU/ml/天但低於15％最高生產者的克隆)進行亞培養，產生共103個克隆。在細胞擴增期間，確定選擇的克隆的平行培養物以確定EPO水平。使用這個第二次篩選的信息選擇50個克隆。克隆在含血清培養基中的生產力和性質在T80培養瓶中開始對這些克隆進行貼壁培養，以產生進行純化/分析的材料。將細胞在補加了10％胎牛血清的DMEM中培養3-5天。然後，收穫材料。培養上清中存在的EPO的量為541-3783eU/ml。在通過親和層析純化EPO之後，通過如前述等電聚焦凝膠電泳分析樣品。代表性結果示於圖10。一些克隆未顯示出EPO的唾液酸化水平明顯增加(例如第9-12泳道)，但可以看出一些分析的克隆產生的EPO與未過表達α-2，3-唾液酸轉移酶產生的EPO相比具有明顯改良的唾液酸化(即平均更多的EPO同種型具有高數目的唾液酸)(例如泳道2、3，特別是泳道13和14)。顯然，對一些克隆進行篩選足以鑑別具有希望的唾液酸化水平增加的克隆。總之，從單一質粒中共表達人EPO和人α-2，3-唾液酸轉移酶與僅表達EPO的克隆相比產生EPO分子的唾液酸化水平增加的克隆。實施例12過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中EPO在無血清培養基中的穩定表達產量及性質在穩定轉染的PER.C6細胞中2，6EPO和2，3EPO的產生在這個實施例中，EPO是在無血清懸浮培養的、穩定轉染的過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞(α-2，6-唾液酸轉移酶或α-2，3-唾液酸轉移酶，見上述實施例；這種細胞被稱作PER.C6-ST細胞)中重組產生的。將產生的EPO製品分別稱作2，6EPO和2，3EPO，而在不過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO稱作PER.C6-EPO。預培養將含有冷藏的產生EPO的PER.C6-ST細胞的安瓿在含有Mab培養基的Erlenmeyer搖瓶中解凍。將搖瓶培養物保持在軌道搖床上的溼化溫箱中(37℃、5％CO2、100RPM)。每2-3天將細胞通過離心用完全培養基更新進行亞培養。每次傳代的目標接種密度為0.2-0.3×106存活細胞/ml。製備分批方法中生產接種物為了製備接種物，在VPRO培養基中進行最後的預培養傳代。將在Mab培養基中預培養的表達EPO的PER.C6-ST細胞通過離心進行亞培養，並將完全培養基更換為VPRO培養基。目標接種細胞密度為0.4-0.6×106存活細胞/mL，將搖瓶培養物保持在軌道搖床上的溼化溫箱中(37℃、5％CO2、100RPM)。在保溫3-4天後，將培養物用作分批生產的接種物。或者，在Mab培養基中製備接種物。在這種情況中，將在Mab培養基中預培養的細胞通過離心及以0.2-0.3×106存活細胞/mL的目標細胞密度接種在含有Mab培養基的搖瓶或生物反應器中進行亞培養。將搖瓶培養物保持在軌道搖床上的溼化溫箱中(37℃、5％CO2、100RPM)。生物反應器的設定如下溫度保持在37℃，溶解氧濃度(dO2)通過噴射O2控制在50％空氣飽和度，接種時培養物pH通過在頂部加入CO2控制在7.3以下。pH值無低限。在保溫2-3天後，將培養物用作分批生產的接種物。分批生產在VPRO培養基中的分批培養是通過將在VPRO培養基中製備的接種物在新鮮VPRO培養基中稀釋、或者在接種物是在Mab培養基中製備的情況中通過離心將完全培養基更換為VPRO培養基而起始。分批培養是在搖瓶或生物反應器中以0.2-0.4×106存活細胞/mL的目標接種密度開始。將搖瓶培養物保持在軌道搖床上的溼化溫箱中(37℃、5％CO2、100RPM)。生物反應器的設定如下溫度保持在37℃，溶解氧濃度(dO2)通過噴射O2控制在50％空氣飽和度，接種時培養物pH通過在頂部加入CO2控制在7.3以下。pH值無低限。收穫在達到最大存活細胞密度之後1天收穫表達EPO的PER.C6-ST細胞培養物；典型地在開始分批培養後5-9天之間收穫。通過ELISA根據細胞系、特定克隆及培養形式確定的EPO濃度範圍在大約1000-10000ELISA單位/mL(1ELISA單位(eU)相應於大約5-10ng)。材料的收穫通過在300g離心5分鐘(Heraeus，Multifuge)，隨後經一次性粗淨化濾膜(Millipore，ClarigardOpticapXL，3μm)澄清及一次性細濾膜(Sartorius，Sartopore2，0.8/0.45μm)過濾，從粗製的分批收穫物中除去細胞。純化及陰離子交換在與CNBr-激活的Sepharose4B(AmershamBiotech)柱結合的90mlCV小鼠單克隆抗-EPO(IgG1)上以5ml/分鐘的流速從過濾的批次中純化EPO。如實施例6所述通過陰離子交換進行洗脫和分級分離。將所有分級分離的和未分級分離的材料通過大小排阻層析柱(HiPrep26/10)均移至標準貯存緩衝液(StandardStorageBuffer，於PBS中的0.03％Tween80、0.5％甘氨酸，pH7.4)中。在緩衝置換後，將樣品經0.2μm濾膜(Pall，AcrodiscPN4908)過濾滅菌。Source15Q分級分離將純化的材料使用Hiprep26/10脫鹽柱(GEHealthcare)經20mMTris/20μMCuSO4pH8.0緩衝置換。在加樣之後，用20mMTris/20μMCuSO4、50mMNaClpH6.0洗滌Source15Q柱(Amersham)，隨後用增加量的於20mMTris/20μMCuSO4pH6.0中的(1M)NaCl洗脫。使用5-15％、15-25％、25-30％、30-50％及50-100％梯度。集合在250-300mMNaCl洗脫的級分。使用如實施例3所述IEF分析EPO級分的唾液酸含量。分析後，集合級分。如此獲得的2，6EPO的平均唾液酸含量為12.1，如此獲得的2，3EPO的平均唾液酸含量為12.7。MALDI分析根據實施例2所述方法產生並分析2，3EPO的MALDI譜(見圖11)。表5示出與PER.C6-EPO的相比，2，3EPO的N聯糖的一些特性。對N聯糖進行分析表明與PER.C6-EPO相比，2，3EPO含有相對更多的三和四天線糖。這表明α-2，3-唾液酸轉移酶的過表達導致N聯糖的更完全的分支。另外，在2，3EPO中不能檢測到Lewisx，表明α-2，3-唾液酸轉移酶的過表達導致α-1，3-巖藻糖基化實際上被完全抑制。此外，發現PER.C6-EPO含有大量的二天線巖藻糖基化的LacdiNAc結構(m/z值為2185.05，見實施例2)，這些結構在2，3EPO中不存在。這表明α-2，3-唾液酸轉移酶的過表達導致LacdiNAc結構的形成被抑制。分級分離的2，3EPO和2，6EPO的分析通過SDS-PAGE分析表明與商購的EPO(EprexTM)相比略低的表觀分子量，通過PNGaseF除去N聯聚糖後這種差異消失。另外，通過大小排阻層析(HP-SEC)分析表明與Eprex相比，2，6EPO和2，3EPO的保留時間略增加，除去N聯聚糖後這種差異消失。如實施例2所述方法製備MALDI譜。與2，6EPO和PER.C6EPO相反，在2，3EPO中在≥10％強度未觀察到含有LewisX的峰。在2，3EPO和2，6EPO中在≥10％強度未檢測到含有乳糖胺重複的峰。實施例13EPO的生物學活性測試PER.C6EPO(於無血清培養基中的不過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞產生，如實施例2所述)及2，3EPO和2，6EPO(如實施例12產生)的體外和體內生物學活性。體外生物學活性通過測定與EPOBRP(EPO參考標準)相比刺激UT-7細胞增殖的能力而測試。與EPO-BRP相比，PER.C6EPO、PER.C62，3EPO和PER.C62，6EPO分別具有60％、129％和94％的相對能力，提示產生的EPO在體外的全部功能性。PER.C6EPO、PER.C62，3EPO和PER.C62，6EPO的體內生物學活性根據EuropeanPharmacopoeia(PHEUR01/20021316)所述在Normocythaemic小鼠中在體內生物分析中測試。如表6所示，PER.C6EPO的體內活性低於檢測極限，而2，6EPO和2，3EPO的體內活性分別為EPOBRP(參考標準)的15％和32％。這些製品的藥動學與體內活性一致，2，3EPO和2，6EPO的曲線介於PER.C6EPO(最低曲線)與EPOBRP(最高曲線)之間，2，3EPO與2，6EPO(未示出)相比具有較長的半衰期(及在曲線下較大的面積)。顯然，在過表達α-2，6-唾液酸轉移酶或α-2，3-唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO與在不過表達唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO相比具有明顯增加的體內生物學活性。實施例14獲得並測試唾液酸含量增加的EPO在實施例13中所示，獲得的α-2，3-唾液酸化增加的EPO(2，3EPO)具有改良的體內生物學活性，但與具有相似唾液酸含量的標準(EPOBRP)相比仍然活性較低。測試具有仍然進一步增加的唾液酸含量的級分是否可以得自在PER.C6-ST細胞中產生的材料，及這種級分與起始物相比是否示出進一步改良的體內生物學活性。如實施例12所述產生一批新的2，3EPO及進行親和純化。為了富集具有較高唾液酸含量的級分，使用如下所述的兩種可選擇的製備性等電聚焦(IEF)方法。或者使用製備性大小排阻層析(HP-SEC)。Ultrodex純化將親和純化的材料在製備性IEF凝膠上以低pH範圍((Ultrodex，pH3-5；AmershamBiosciences)在存在5M尿素的條件下進一步分離。樣品被分離成同種型。從Ultrodex中通過用0.5MTris-HClpH8.0洗脫提取同種型。集合級分並用PBS透析。加入Tween-80和甘氨酸至終濃度分別為0.03％(v/v)和0.5％(w/v)，將製品過濾滅菌(0.22μmMillex-GV濾膜，Millipore)。Rotofor純化或者，使用製備性IEF(Rotofor，Biorad)進一步分離親和純化的材料。將2.5-5mg純化的EPO加樣於Rotofor中，在低pH範圍pH2-4於5M尿素中分離同種型。這樣產生最多10種具有不同同種型的級分。集合適當的級分。將這些集合的級分用PBS透析。加入Tween-80和甘氨酸至終濃度分別為0.03％(v/v)和0.5％(w/v)，將製品過濾滅菌(0.22μmMillex-GV濾膜，Millipore)。使用如實施例3所述的IEF分析EPO不同級分的唾液酸含量，示於下表。在製備性IEF或HP-SEC之後具有平均SA(唾液酸)含量的樣品在IEF凝膠上，樣品2，3EPO-1和2，3-EPO-2在PER.C6EPO(平均SA為3.1)和Eprex(平均SA為12.4)旁邊電泳，如圖12所示。根據PHEUR01/20021316所述，在Normocythaemic小鼠中在體內生物分析中測試如此獲得的唾液酸含量為14.3的EPO(PER.C62，3EPO-2，大約產量為3％)的體內生物學活性。這種製品的特異性活性為113.881IU/mg[95％置信區間94836-139361IU/mg]，這個結果與測試的商購Epo製品(EprexTM，其在活性和唾液酸含量方面與EPOBRP標準類似)相似。這些實驗表明使用表達E1A的細胞和本發明的方法可以獲得具有與商業EPO製品相似體內生物學活性的EPO。表表1表1PER.C6-產生的EPO上存在的每個N聯聚糖的Gal、GalNAc和Lewisx結構的平均數。EPO是以貼壁培養(DMEM)或在無血清VPRO培養基(VPRO[S])中懸浮培養產生的。最後一列表示末端Gal+GalNac殘基的平均數與Lewisx結構的平均數的比率。表2表2過表達α2，6唾液酸轉移酶的PER.C6細胞(即PER.C6-EPO-ST克隆25-3.20)或不過表達α2，6唾液酸轉移酶的PER.C6細胞(即PER.C6-EPO克隆25)中產生的EPO上存在的每個N聯聚糖的Lewisx結構的平均數。表3表3在無血清懸浮培養的過表達α2，6唾液酸轉移酶的PER.C6細胞中產生的EPO分子總和及在其高唾液酸化的EPO級分中發現的每個N聯聚糖的Gal、GalNAc和Lewisx結構的平均數，使用實施例4所述方法獲得。表4.表4不同EPO製品的聚糖上LewisX和唾液酸含量(見實施例8)。含量是對於每個EPO分子而言。表5表5如實施例2和12所述，從親和純化的PER.C6-EPO和2，3EPO的MALDI譜中計算的每個EPO分子的N聯聚糖的天線及平均Lewisx含量。表6.表6.在Normocythaemic小鼠中的體內活性(見實施例13)CI置信區間參考文獻ByrdP，BrownKW，GallimorePH.1982.Malignanttransformationofhumanembryoretinoblastsbyclonedadenovirus12DNA.Nature29869-71.ByrdPJ，GrandRJA，GallimorePH.1988.DifferentialtransformationofprimaryhumanembryoretinalcellsbyadenovirusE1regionsandcombinationsofE1A+ras.Oncogene2477-484.DelormeE，LorenziniT，GiffinJ，MartinF，JacobsenF，BooneT，ElliotS(1992)Roleofglycosylationonthesecretionandbiologicalactivityoferythropoietin.Biochemistry31，9871-9876.FukutaK，AbeR，YokomatsuT，KonoN，AsanagiM，OmaeF，MinowaMT，TakeuchiM，MakinoT(2000)Remodelingofsugarchainstructuresofhumaninterferon-γ.Glycobiology4412-430.Gallimore，P.H.，Grand，R.J.A.andByrd，P.J.(1986).Transformationofhumanembryoretinoblastswithsimianvirus40，adenovirusandrasoncogenes.AntiCancerRes.6，p499-508.GoldwasserE，EliasonJF，SikkemaD(1975)Anassayforerythropoietininvitroatthemilliunitlevel.Endocrinology97，315-23.GormanCM，GiesD，McCrayG，HuangM(1989)Thehumancytomegalovirusmajorimmediateearlypromotercanbetrans-activatedbyadenovirusearlyproteins.Virology171，377-385.GrabenhorstE，HoffmannA，NimtzM，ZettlmeisslG，andConradtHS(1995)ConstructionofstableBHK-21cellscoexpressinghumansecretoryglycoproteinsandhumanGal(β1-4)GlcNAc-Rα2，6-sialyltransferase.Eur.J.Biochem.232718-725.GrahamFL，SmileyJ，RusellWCandNaimR(1977)CharacteristicsofahumancelllinetransformedbyDNAfromhumanadenovirustype5.J.Virol.36，59-74GrundmannU，NehrlichC，ReinT，ZettlmeisslG(1990)CompletecDNAsequenceencodinghumanbeta-galactosidealpha-2，6-sialyltransferase.NucleicAcidsRes.18667.Harduin-LepersA，Vallejo-RuizV，Krzewinski-RecchiMA，Samyn-PetitB，JulienS，andDelannoyP(2001)Thehumansialyltransferasefamily.Biochimie83727-737.JenkinsN，BuckberryL，MarcA，MonacoL(1998)Geneticengineeringofalpha2，6-sialyltransferaseinrecombinantCHOcells.BiochemSocTrans.26，S115.LeistM，etal(2004)Derivativesoferythropoietinthataretissueprotectivebutnoterythropoietic.Science305，239-242.MinchSL，KallioPT，BaileyJE(1995)TissueplasminogenactivatorcoexpressedinChinesehamsterovarycellswithalpha(2，6)-sialyltransferasecontainsNeuAcalpha(2，6)Galbeta(1，4)Glc-N-AcRlinkages.BiotechnProg.11，348-351.NicholsWW，LardenoieR，LedwithBJ，BrouwerK，ManamS，VogelsR，KaslowD，ZuidgeestD，BettAJ，ChenJandothers.2002.Propagationofadenoviralvectors；useofPER.C6cells.InCurielD，DouglasJT，editors.Adenoviralvectorsforgenetherapy.SanDiegoElsevier.p129-167.OliveDM，Al-MullaW，SimsekM，ZarbanS，al-NakibW(1990)Thehumancytomegalovirusimmediateearlyenhancer-promoterisresponsivetoactivationbytheadenovirs-513SE1Agene.ArchVirol.112，67-80.PratiEGP，MatasciM，SuterTB，DinterA，SburlatiAR，andBaileyJE(2000)Engineeringofcoordinatedup-anddown-regulationoftwoglycosyltransferasesoftheO-glycosylationpathwayinChinesehamsterovary(CHO)cells.Biotech.andBioeng.68239-244.SchiednerG，HertelSandKochanekS(2000)EfficienttrarsformationofprimaryhumanamniocytesbyE1functionsofAd5generationofnewcelllinesforadenoviralvectorproduction.Hum.Gene.Ther.11，2105-2116.TakeuchiM，InoueN，StricklandTW，KubotaM，WadaM，ShimizuR，HoshiS，KozutsumiH，TakasakiS，KobataA(1989)RelationshipbetweensugarchainstructureandbiologicalactivityofrecombinanthumanerythropoietinproducedinChinesehamsterovarycells.ProcNatlAcadSciUSA.86，7819-7822.VarkiA，CummingsR，EskoJ，FreezeH，HartGandMarthJ(1999)Essentialsofglycobiology.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork.WeikertS，PapacD，BriggsJ，CowferD，TomS，GawlitzekM，LofgrenJ，MehtaS，ChisholmV，ModiN，EpplerS，CarrollK，ChamowS，PeersD，BermanP，KrummenL(1999)EngineeringChinesehamsterovarycellstomaximizesialicacidcontentofrecombinantglycoproteins.NatureBiotechnology17，1116-1121.YallopC，CrowleyJ，CoteJ，Hegmans-BrouwerK，LagerwerfF，CagneR，MartinJC，OosterhuisN，OpsteltenDJ，BoutA.2005a.PER.C6cellsforthemanufactureofbiopharmaceuticalproteins.InKnableinJ，editor.ModemBiopharmaceuticals.WeinheimWiley-VCHVerlagGmbHCo.KGaA.p779-807.YallopC，RaamsmanM，ZuijderwijkM，VanNoordenburgY，VooysA，KeehnenR，vanMontfortB，JansenM，LagerwerfF，DijkstraRandothers.2005b.HighlevelproductionofrecombinantIGGinthehumancelllinePER.C6.InGodiaF，FusseneggerM，editors.AnimalcelltechnologymeetsgenomicsSpringer.p533-536.YamaguchiK，AkaiK，KawanishiG，UedaM，MasudaS，SasakiR(1991)Effectsofsite-directedremovalofN-glycosylationsitesinhumanerythropoietinonitsproductionandbiologicalproperties.JBiolChem.266，20434-20439.ZhangX，LokSH，KomOL(1998)Stableexpressionofhumanalpha-2，6-sialyltransferaseinChinesehamsterovarycellsfunctionalconsequencesforhumanerythropoietinexpressionandbioactivity.BiochemBiophysActa.27，441-452.序列表110克魯塞爾荷蘭公司120從表達腺病毒E1A蛋白的細胞中獲得唾液酸化增加的重組蛋白質的方法及由此獲得的蛋白質1300127WO00ORD150US11/026,5181512004-12-30150US11/102,0731512005-04-081604170PatentInversion3.3210121134212DNA213Artificial220223forwardEPOprimer4001ccaggcgcgccaccatgggggtgcacgaatgtcc34210221130212DNA213Artificial220223reverseEPOprimer4002ccgggttaactcatctgtcccctgtcctgc30210321123212DNA213Artificial220223forwardalfa-2，3-sialyltransferaseprimer4003ggactagtggatccgccaccatg23210421130212DNA213Artificial220223reversealfa-2，3-sialyltransferaseprimer4004gctctagatcagaaggacgtgaggttcttg30PCT/R0/134表權利要求1.一種包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，特徵在於所述聚糖平均包含a)每個EPO分子至少1個LewisX結構，及b)每個EPO分子至少6個唾液酸部分。2.權利要求1的組合物，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子至少1個LewisX結構，及b)每個EPO分子至少7個唾液酸部分。3.前述任一項權利要求的組合物，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子至少1個LewisX結構，及b)每個EPO分子至少8個唾液酸部分。4.前述任一項權利要求的組合物，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子1-2個LewisX結構，及b)每個EPO分子8-10個唾液酸部分。5.一種包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，特徵在於所述聚糖平均包含a)每個EPO分子至少0.5個LewisX結構，及b)每個EPO分子至少10個唾液酸部分。6.權利要求5的組合物，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子至少0.5個LewisX結構，及b)每個EPO分子至少11個唾液酸部分。7.權利要求5或6的組合物，其中所述聚糖平均包含a)每個EPO分子0.5-1個LewisX結構，及b)每個EPO分子11-13個唾液酸部分。8.前述任一項權利要求的組合物，其中所述紅細胞生成素是人紅細胞生成素、人紅細胞生成素的片段或者人紅細胞生成素的突變蛋白。9.前述任一項權利要求的組合物，其中所述聚糖包含三個N聯聚糖。10.一種獲得包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物的方法，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖平均包含每個EPO分子至少6個唾液酸及0-2個Lewisx結構，所述方法包括a)提供含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列及進一步含有可表達形式的編碼EPO的核酸的真核細胞，其中所述細胞進一步含有在異源啟動子控制下的編碼唾液酸轉移酶、優選α-2，6-唾液酸轉移酶或α-2，3-唾液酸轉移酶的核酸序列；b)在無血清培養基中培養所述細胞，使得EPO在所述細胞中表達；c)從所述細胞和/或從培養基中收穫表達的EPO；和d)純化及分級分離EPO，以獲得每個EPO分子的N聯聚糖的平均唾液酸含量增加的級分，獲得包含一或多種同種型的EPO的組合物，所述EPO包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖平均包含每個EPO分子至少6個唾液酸及0-2個Lewisx結構。11.權利要求10的方法，其中含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列的所述真核細胞衍生自人胚胎視網膜細胞，優選衍生自如在ECACC中以96022940號保藏的PER.C6細胞。12.權利要求10或11的方法，其中所述聚糖平均包含每個EPO分子少於1個的Lewisx結構及至少10個唾液酸。13.權利要求10-12任一項的方法，其中所述聚糖平均包含每個EPO分子少於1個的Lewisx結構及10-15個唾液酸，優選檢測不到Lewisx結構。14.權利要求10-12任一項的方法，其中所述聚糖平均包含每個EPO分子少於0.3個的Lewisx結構及13-15個唾液酸，優選檢測不到Lewisx結構。15.權利要求14的方法，其中所述組合物包含4種或更少的EPO同種型，其一共佔所述組合物中存在的EPO的至少70％。16.一種在表達至少一種腺病毒E1A蛋白的細胞中生產感興趣的蛋白質的方法，所述方法包括a)提供表達至少一種腺病毒E1A蛋白並進一步含有可表達形式的編碼感興趣的蛋白質的核酸的細胞，其中所述細胞進一步含有在異源啟動子控制下的編碼唾液酸轉移酶、優選α-2，6-唾液酸轉移酶或α-2，3-唾液酸轉移酶的核酸序列；b)在無血清的培養基中培養所述細胞，使得感興趣的蛋白質在所述細胞中表達；c)從所述細胞和/或培養基中收穫所表達的感興趣的蛋白質；和d)純化並分級分離感興趣的蛋白質以獲得每個感興趣的蛋白質分子的N聯聚糖的平均唾液酸含量增加的級分。17.一種降低在細胞中重組表達的蛋白質上LacdiNAc結構的平均含量的方法，所述方法包括在所述細胞中過表達α-2，3-唾液酸轉移酶。18.權利要求17的方法，其中所述細胞是含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列的真核細胞。19.權利要求18的方法，其中所述細胞衍生自人胚胎視網膜細胞，優選衍生自在ECACC中以96022940號保藏的PER.C6細胞。20.權利要求17-19任一項的方法，其中所述方法進一步增加了所述蛋白質上唾液酸的平均含量。21.權利要求17-20任一項的方法，其中所述蛋白質是紅細胞生成素。全文摘要本發明提供了包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，特徵在於所述聚糖包含LewisX結構及每個EPO分子平均至少6個唾液酸部分。本發明進一步提供了獲得包含一或多種同種型紅細胞生成素(EPO)的組合物的方法，所述紅細胞生成素包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖包含平均每個EPO分子至少6個唾液酸及0－2個Lewisx結構，所述方法包括a)提供含有可表達形式的編碼腺病毒E1A蛋白的核酸序列及進一步含有可表達形式的編碼EPO的核酸的真核細胞，其中所述細胞進一步含有在異源啟動子控制下的編碼唾液酸轉移酶、優選α－2，6－唾液酸轉移酶或α－2，3－唾液酸轉移酶的核酸序列；b)在無血清培養基中培養所述細胞，使得EPO在所述細胞中表達；c)從所述細胞和/或培養基中收穫表達的EPO；及d)純化並分級分離EPO以獲得每個EPO分子N聯聚糖的平均唾液酸含量增加的級分，獲得包含一或多種同種型EPO的組合物，所述EPO包含與其連接的聚糖，其中所述聚糖包含每個EPO分子平均至少6個唾液酸及0－2個Lewisx結構。文檔編號C07K14/505GK101090973SQ200580045170公開日2007年12月19日申請日期2005年12月28日優先權日2004年12月30日發明者D·J·E·奧普斯泰爾滕申請人:克魯塞爾荷蘭公司