採用mdck細胞系生產禽流感病毒二價滅活疫苗的方法

2023-07-31 16:41:46

採用mdck細胞系生產禽流感病毒二價滅活疫苗的方法
【專利摘要】本發明提供一種採用MDCK細胞系生產禽流感病毒（H5亞型+H9亞型）二價滅活疫苗的方法。包括如下步驟：（1）MDCK細胞系的傳代與培養；（2）病毒接種與繁殖；（3）病毒液的滅活與收穫；（4）配製疫苗。利用MDCK細胞系生產禽流感病毒滅活疫苗具有無外源因子汙染，易於規模化生產，能較好的維持病毒抗原穩定等優點，並能縮短疫苗研發周期與生產周期，具備突發疫情中疫苗供應應急的能力。
【專利說明】採用MDCK細胞系生產禽流感病毒二價滅活疫苗的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物製品【技術領域】，具體地說，涉及一種採用MDCK細胞系生產禽流感病毒(H5亞型和H9亞型)二價滅活疫苗的方法。
【背景技術】
[0002]目前，我國生產禽流感病毒滅活疫苗的方式主要是利用9-11日齡健康雞胚進行培養。該培養方法是通過將病毒接種到雞胚尿囊腔中進行病毒繁殖，這種生產方式不能滿足未來我國對禽流感疫病的預防與控制需求，主要表現在以下幾個方面:(1)生產周期長，難以在短時間內實現大規模疫苗生產；(2)受雞胚等原輔材料的限制；(3)生產工藝落後，勞動力密集，生產成本高。禽流感病毒(H5亞型+H9亞型)二價滅活疫苗在我國禽流感疫病防控過程中具有舉足輕重的作用，採用MDCK細胞的生產方式具有無外源因子汙染，易於規模化生產、能較好的維持病毒抗原穩定等優點，並能縮短疫苗研發周期與生產周期，並具備突發疫情中疫苗供應應急的能力，是未來禽流感疫苗生產的發展趨勢。

【發明內容】

[0003]本發明旨在克服現有技術中存在的缺陷，提供一種採用MDCK細胞系生產禽流感病毒(H5亞型和H9亞型)二價滅活疫苗的方法。
[0004]為了實現本發明目的，本發明的一種採用MDCK細胞系生產禽流感病毒二價滅活疫苗的方法，包括以下步驟:
[0005](I)MDCK細胞系的傳代與培養:MDCK細胞系經胰酶-EDTA消化分散，用細胞生長液稀釋成一定濃度後，接種至合適的容器內，待細胞長滿後進行傳代或接種病毒；
[0006](2)病毒接種與繁殖:用病毒生長液分別將H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒進行適當稀釋後，分別接種用PBS清洗(清洗3次)的MDCK細胞，待MDCK細胞完全病變
後，停止培養；
[0007](3)病毒液的滅活與收穫:向上述細胞培養液中加入甲醛溶液滅活後，分別收穫H5亞型禽流感病毒抗原和H9亞型禽流感病毒抗原；
[0008](4)配製疫苗:將H5亞型禽流感病毒抗原和H9亞型禽流感病毒抗原混入吐溫_80後製成水相，與油相一同乳化，分裝後製成成品疫苗。
[0009]優選地，步驟(2)中所述的H5亞型禽流感病毒為重組禽流感病毒H5N1亞型Re_4株或重組禽流感病毒H5N1亞型Re-6株，H9亞型禽流感病毒為重組禽流感病毒H9N2亞型Re_2 株。
[0010]優選地，步驟(2)中所述的MDCK細胞為平面貼壁培養的細胞或採用生物反應器進行懸浮培養的細胞。
[0011]優選地，步驟(1)中所述的細胞生長液中含有90-95%體積的DMEM液和5_10%體積的胎牛血清組成，PH值7.0-7.4。
[0012]優選的，步驟(4)中所述的水相包含46.5份H5亞型禽流感病毒抗原、46.5份H9亞型禽流感病毒抗原和7份吐溫-80 ;油相包含93份白油、5份司盤-80和2份硬脂酸鋁。進行乳化時水相1份，油相2份(所述份數為質量比重)。
[0013]優選地，步驟(1)中細胞培養條件為37°C，5%C02。
[0014]優選地，步驟(2)中所述的病毒生長液為含有5 μ g/mL TPCK處理胰酶和0.2%牛血清白蛋白組分V的DMEM液，pH值7.2-7.4。
[0015]優選地，步驟(2)中細胞培養條件為34°C，5%C02。
[0016]優選地，步驟(2)中接種時H5亞型禽流感病毒接種量為M0I10-4-10_6，H9亞型禽流感病毒接種量為MOIKT5-1O'
[0017]優選地，步驟(3)中所述甲醛溶液的濃度為0.1%。
[0018]優選地，步驟(3)中滅活條件為37°C，滅活24h。[0019]本發明至少具有下列優點及有益效果:
[0020]本發明首次採用MDCK細胞系生產禽流感病毒(H5亞型+H9亞型)二價滅活疫苗，為禽流感疫病的防控提供了新的技術。禽流感病毒(H5亞型+H9亞型)二價滅活疫苗長期佔據我國禽流感疫苗市場巨大的份額，在我國禽流感疫病的防控過程中起到了重要的直至關重要的作用。採用MDCK細胞進行禽流感病毒(H5亞型+H9亞型)二價滅活疫苗的生產，極大的提高了疫苗的生產工藝。具體表現為無外源因子汙染，易於規模化生產，能較好的維持病毒抗原穩定等優點，並能縮短疫苗研發周期與生產周期，並具備突發疫情中疫苗供應應急的能力。
【具體實施方式】
[0021]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0022]本發明中涉及到的百分號「％」，若未特別說明，是指質量百分比；但溶液的百分t匕，除另有規定外，是指IOOmL溶液中含有溶質的克數；液體之間的百分比，是指在20°C時容量的比例。
[0023]實施例1重組禽流感病毒H5N1亞型Re_4株的平面貼壁培養
[0024]包括以下步驟:
[0025](I)採用850cm2的轉瓶培養MDCK細胞，選擇細胞形態良好的單層MDCK細胞作為
病毒培養用細胞。
[0026](2)用 0.01mol/L, ρΗ7.2-7.4 的 PBS 清洗 MDCK 細胞 3 遍。
[0027](3)用病毒生長液(含5 μ g/mL的TPCK處理胰酶、0.2%牛血清白蛋白組分V的DMEM液，pH值7.2-7.4)將重組禽流感病毒H5N1亞型Re_4株稀釋至含病毒MOIKT4-1O'
[0028](4)將稀釋好的病毒液接種至步驟(2)中清洗後的MDCK細胞中，置於34°C，5%C02中培養2-4天，測定病毒HA效價，加入0.1%甲醛溶液於37°C滅活24小時，收穫病毒抗原。
[0029]實施例2重組禽流感病毒H5N1亞型Re_4株的生物反應器懸浮培養
[0030]包括以下步驟:
[0031](I)利用TideCell-010潮汐式高密度細胞培養系統進行MDCK細胞灌注式懸浮培養:
[0032]TideCell-OlO潮汐式高密度細胞培養系統接種1000OmL適宜濃度的細胞(I X 106-4X 106個細胞/mL)。將細胞培養瓶連接含40000mL細胞生長液的培養袋(液體罐)進行培養。細胞生長液培養為95%體積百分比的DMEM液和5%體積百分比的胎牛血清，pH值7.2-7.4。通過調節細胞培養系統中各培養條件:溶氧量為50%-100%、CO2濃度為5%，葡萄糖含量為500-4500mg/L，pH值7.2-7.4，細胞培養溫度37 °C，培養高密度的MDCK細胞。培養至第2天，以每天灌注I個工作體積的速率進行灌注式培養，共培養4-6天。
[0033](2)重組禽流感病毒H5N1亞型Re_4株的大規模培養: [0034]將潮汐式高密度細胞培養系統的細胞生長液棄去，用PBS清洗3遍後，接種含適量病毒的病毒生長液(含重組禽流感病毒H5N1亞型Re-4株MOI為10_4-10_6，含5 μ g/mL的TPCK處理胰酶、0.2%牛血清白蛋白組分V的DMEM液，pH值7.2-7.4，病毒培養溫度為34°C )，繼續培養。
[0035](3)接種後2-4天，測定病毒HA效價，加入終濃度為0.1%的甲醛溶液於37°C滅活24h後，無菌收穫病毒抗原。
[0036]實施例3重組禽流感病毒H5N1亞型Re_6株的平面貼壁培養
[0037]包括以下步驟:
[0038](I)採用850cm2的轉瓶培養MDCK細胞，選擇細胞形態良好的單層MDCK細胞作為
病毒培養用細胞。
[0039](2)用 0.01mol/L, ρΗ7.2-7.4 的 PBS 清洗 MDCK 細胞 3 遍。
[0040](3)用病毒生長液(含5 μ g/mL的TPCK處理胰酶、0.2%牛血清白蛋白組分V的DMEM液，pH值7.2-7.4)將重組禽流感病毒H5N1亞型Re_6株稀釋至含病毒MOIKT4-1O'
[0041](4)將稀釋好的病毒液接種至步驟(2)中清洗後的MDCK細胞，置34°C，5%C02中培養2-4天，測定病毒HA效價，加入0.1%甲醛溶液於37°C滅活24h，收穫病毒抗原。
[0042]實施例4重組禽流感病毒H5N1亞型Re_6株的生物反應器懸浮培養
[0043]包括以下步驟:
[0044](I)利用TideCell-010潮汐式高密度細胞培養系統進行MDCK細胞灌注式懸浮培養:
[0045]TideCell-010潮汐式高密度細胞培養系統接種1000OmL適宜濃度的細胞(I X 106-4X 106個細胞/mL)。將細胞培養瓶連接含40000mL細胞生長液的培養袋(液體罐)進行培養。細胞生長液培養為95%體積百分比的DMEM液和5%體積百分比的新生牛血清，pH值7.2-7.4。通過調節細胞培養系統中各培養條件:溶氧量為50%-100%、C02濃度為5%、葡萄糖含量為500-4500mg/L，pH值7.2-7.4，細胞培養溫度37°C，培養高密度的MDCK細胞。培養至第2天，以每天灌注I個工作體積的速率進行灌注式培養，共培養4~6天。
[0046](2)重組禽流感病毒H5N1亞型Re_6株的大規模培養:
[0047]將潮汐式高密度細胞培養系統的細胞生長液棄去，用PBS清洗3遍後，接種含適量病毒的病毒生長液(含重組禽流感病毒H5N1亞型Re-4株MOI為10_4-10_6，含5 μ g/mL的TPCK處理胰酶、0.2%牛血清白蛋白組分V的DMEM液，pH值7.2-7.4，病毒培養溫度為34°C )，繼續培養。
[0048](3)接種後2-4天，測定病毒HA效價，加入終濃度為0.1%的甲醛溶液於37°C滅活24h後，無菌收穫病毒抗原。
[0049]實施例5重組禽流感病毒H9N2亞型Re_2株的平面貼壁培養[0050]包括以下步驟:
[0051](I)採用850cm2的轉瓶培養MDCK細胞，選擇細胞形態良好的單層MDCK細胞作為
病毒培養用細胞。
[0052](2)用 0.01mol/L, ρΗ7.2-7.4 的 PBS 清洗 MDCK 細胞 3 遍。
[0053](3)用病毒生長液(含5 μ g/mL的TPCK處理胰酶、0.2%牛血清白蛋白組分V的DMEM液，pH值7.2-7.4)將重組禽流感病毒H5N1亞型Re_6株稀釋至含病毒MOIKT5-1O'
[0054](4)將稀釋好的病毒液接種至步驟(2)中清洗後的MDCK細胞，置於34°C，5%C02中培養2-4天，測定病毒HA效價，加入0.1%甲醛溶液於37°C滅活24h，收穫病毒抗原。
[0055]實施例6重組禽流感病毒H9N2亞型Re_2株的生物反應器懸浮培養
[0056]包括以下步驟:
[0057](I)利用TideCell-010潮汐式高密度細胞培養系統進行MDCK細胞灌注式懸浮培養:
[0058]TideCell-010潮汐式高密度細胞培養系統接種1000OmL適宜濃度的細胞(I X 106-4X 106個細胞/mL)。將細胞培養瓶連接含40000mL細胞生長液的培養袋(液體罐)進行培養。細胞生長液培養為95%體積百分比的DMEM液和5%體積百分比的新生牛血清，pH值7.2-7.4。通過調節細胞培養系統中各培養條件:溶氧量為50%-100%、C02濃度為5%，葡萄糖含量為500-4500mg /L，pH值7.2-7.4，細胞培養溫度37°C，培養高密度的MDCK細胞。培養至第2天，以每天灌注I個工作體積的速率進行灌注式培養，共培養4~6天。
[0059](2)重組禽流感病毒H9N2亞型Re_2株的大規模培養:
[0060]將潮汐式高密度細胞培養系統的細胞生長液棄去，用PBS清洗3遍後，接種含適量病毒的病毒生長液(含重組禽流感病毒H5N1亞型Re-4株MOI為10_4-10_6，含5 μ g/mL的TPCK處理胰酶、0.2%牛血清白蛋白組分V的DMEM液，pH值7.2-7.4，病毒培養溫度為34°C )，繼續培養。
[0061](3)接種後2-4天，測定病毒HA效價，加入終濃度為0.1%的甲醛溶液於37°C滅活24h後，無菌收穫病毒抗原。
[0062]實施例1-6中禽流感病毒培養結果如表1所示。
[0063]表1禽流感病毒培養結果
~重組禽流感病毒~重組禽流感病毒Η5Ν1 ~重組禽流感病毒~
Η5Ν1亞型Re-4株亞型Re-6株H9N2亞型Re-2株
平面貼壁懸浮培養平面貼壁懸浮培養平面貼壁懸浮培養
[0064]-^1-------
70ml/瓶 50L/次 70ml/瓶 50L/次 70ml/瓶 50L/次
收穫S_______
~HA
效價 IOlog2 IOlog2 I Olog2 IO1g2 IOlog2 IO1g2
[0065]實施例7禽流感病毒(H5N1亞型Re_4株+H9N2亞型Re_2株)二價滅活疫苗的免疫試驗
[0066]包括以下步驟:
[0067](I)疫苗配製:將46.5份重組禽流感病毒H5N1亞型Re_4株抗原和46.5份重組禽流感病毒H9N2亞型Re-2株抗原混入7份無菌的吐溫_80後製成水相；將93份白油、5份司盤-80和2份硬脂酸鋁充分混勻至透明後高壓滅菌製成油相。取2份油相和1份水相進行乳化(所述份數為質量比重)，分裝後製成疫苗。
[0068](2)疫苗免疫:疫苗通過胸部肌肉注射3-4周齡SPF雞10隻，接種劑量為每隻雞
0.3mL。5隻雞不注射作為對照。接種21天後，採血分離血清，用禽流感病毒H5亞型抗原和H9亞型抗原檢測HI效價。
[0069]實施例8禽流感病毒(H5N1亞型Re_6株+H9N2亞型Re_2株)二價滅活疫苗的免疫試驗
[0070]包括以下步驟:
[0071](I)疫苗配製:將46.5份重組禽流感病毒H5N1亞型Re_6株抗原和46.5份重組禽流感病毒H9N2亞型Re-2株抗原混入7份無菌的吐溫_80後製成水相；將93份白油、5份司盤-80和2份硬脂酸鋁充分混勻至透明後高壓滅菌製成油相。取2份油相和1份水相進行乳化(所述份數為質量比重)，分裝後製成疫苗。
[0072](2)疫苗免疫:疫苗通過胸部肌肉注射3-4周齡SPF雞10隻，接種劑量為每隻雞
0.3ml。5隻雞不注射作為對照。接種21天後，採血分離血清，用禽流感病毒H5亞型抗原和H9亞型抗原檢測HI效價。
[0073]實施例7和8的疫苗免疫試驗結果如表2所示。
[0074]表2疫苗免疫試驗結果
【權利要求】
1.採用MDCK細胞系生產禽流感病毒二價滅活疫苗的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)MDCK細胞系的傳代與培養:MDCK細胞系經胰酶-EDTA消化分散，用細胞生長液稀釋成一定濃度後，接種至合適的容器內，待細胞長滿後進行傳代或接種病毒； (2)病毒接種與繁殖:用病毒生長液分別將H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒進行適當稀釋後，分別接種用PBS清洗的MDCK細胞，待MDCK細胞完全病變後，停止培養； (3)病毒液的滅活與收穫:向上述細胞培養液中加入甲醛溶液滅活後，分別收穫H5亞型禽流感病毒抗原和H9亞型禽流感病毒抗原； (4)配製疫苗:將H5亞型禽流感病毒抗原和H9亞型禽流感病毒抗原混入吐溫-80後製成水相，與油相一同乳化，分裝後製成成品疫苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的H5亞型禽流感病毒為重組禽流感病毒H5N1亞型Re-4株或重組禽流感病毒H5N1亞型Re_6株，H9亞型禽流感病毒為重組禽流感病毒H9N2亞型Re-2株。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的MDCK細胞為平面貼壁培養的細胞或採用生物反應器進行懸浮培養的細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中所述的細胞生長液中含有90-95%體積的DMEM液和5-10%體積的胎牛血清，pH值7.0-7.4。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(4)中所述的油相包含白油、司盤-80和硬脂酸鋁。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中細胞培養條件為37°C，5%C02。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的病毒生長液為含有5 μ g/mL TPCK處理胰酶和0.2%牛血清白蛋白組分V的DMEM液，pH值7.2-7.4。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中細胞培養條件為34°C，5%C02。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中接種時H5亞型禽流感病毒接種量為Μ0Ι10-4-10Λ Η9亞型禽流感病毒接種量為MOIKT5-1O'
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中所述甲醛溶液的濃度為0.1%，滅活條件為371:，滅活2411。
【文檔編號】A61K39/295GK103536913SQ201310452808
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】王賀民, 黃文強, 周蕾蕾, 張翼, 陳秋閣, 嚴石, 李浩鵬, 李愛君, 萬桂清 申請人:乾元浩生物股份有限公司