一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法

2023-07-30 22:19:21

一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法。它先將組織勻漿處理成乳糜狀，然後加入冷凍液混勻，分裝到含有蔗糖、DMSO和穀胱甘肽的冷凍管中，之後放置在冷凍保存盒中-80℃超低溫冰箱過夜，最後放入液氮中長期保存。解凍時依次經過解凍液、培養液離心洗滌，之後組織塊可直接接種培養或經蛋白酶消化成單個細胞後培養。本發明先將組織用勻漿機處理成乳糜狀，有利於冷凍保護劑滲透進入組織細胞內，使細胞內水分脫出；同時冷凍液中添加的非滲透性保護劑蔗糖，也有利於組織細胞內的水分脫出；加入抗氧化物質穀胱甘肽，有助於減輕氧自由基對細胞內蛋白的破壞作用。解凍後組織塊在培養瓶內直接接種，貼壁存活率在96%以上。
【專利說明】一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物冷凍保存技術，具體是一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法。
【背景技術】
[0002]隨著生物技術的快速發展，細胞培養技術已廣泛應用於生物學、醫學、畜牧學等生命科學領域，成為科研或生產中不可或缺的技術手段。目前，動物機體幾乎所有的組織經簡單機械或蛋白酶處理後接種到培養瓶中，在適宜的培養條件下都能增殖擴繁(SpierRE.Large-scale mammalian cell culture: methods, applications and products.CurrOpinBiotechnol.1991 Jun:2(3):375-9)。然而研究表明，這些細胞在體外培養的傳代次數不能過多，否則會出現細胞生長緩慢、老化以及生物學功能逐漸喪失等不良現象。因此，如果試驗或生產中要重複進行、多次培養細胞時，那就需要不斷採集新鮮組織。
[0003]由於細胞培養時所取組織應該儘可能無細菌或病毒汙染、同時具有較強的增殖活性，所以取樣時通常將組織放在含抗生素的液體如磷酸鹽緩衝液(PBS )或生理鹽水中保存，儘快(3-4小時內)送回實驗室處理。如果取樣現場距離實驗室較遠或交通不方便的情況下，組織在液體中保存時間過長，那麼會造成細胞活性降低，接種後細胞生長緩慢；而且由於取樣通常並不是在無菌環境中，時間過長也會造成液體中細菌大量增殖，培養後容易發生汙染。因此，如果能將組織進行冷凍保存，在下次細胞培養時直接解凍、復甦組織而不需再次取樣，這樣就極大地避免了麻煩及浪費，也能夠最大限度地利用材料；而且如果所取樣品為珍稀、甚至是瀕危滅絕動物的稀缺組織，冷凍保存組織的意義就更不可估量。
[0004]組織冷凍保存時，滲透性冷凍保護劑如二甲基亞碸(DMS0)、乙二醇或甘油等必須滲透進入細胞質中才能起到保護作用，防止組織細胞內冰晶的生成。然而如果組織過大，則不利於冷凍保護劑穿透進入，影響冷凍保存效果。儘管目前有組織塊冷凍保存成功的報導(孫蘇軍，安志興，彭新榮， 張湧.山羊乳腺組織塊冷凍保存實驗，西北農林科技大學學報(自然科學版)，2005，33(4):5-8)，但該冷凍方法操作過程非常繁瑣、費時，具體表現為:先加基礎液，冰上預冷15min，放入組織塊後在搖床上平衡6h ;分兩次添加DMSO ;冷凍時0°C平衡lh, _20°C平衡2h。同時保存組織塊的數量較少(每管僅凍存6塊)，而且復甦後組織塊的存活率(最高存活率為89.8%)還需進一步提高。

【發明內容】

[0005]為了解決細胞培養時組織取樣存在的問題，改善目前組織塊冷凍保存方法存在的技術缺陷，本發明提供了一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法。本發明在冷凍前先將組織處理成小的組織塊，這步處理實際上等同於細胞培養時的組織塊剪碎處理，組織塊解凍後就可直接接種到培養瓶內培養或經蛋白酶消化成單個細胞後培養。該方法操作步驟簡單、花費時間短，一次能凍存較多數量的組織塊，復甦後組織塊貼壁存活率高達96%以上。[0006]本發明的技術方案是:一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法，其特徵是，先將新取的動物組織勻漿處理成乳糜狀，然後加入冷凍液混勻，分裝到冷凍管中，之後放置在冷凍保存盒中-80°C超低溫冰箱過夜，最後放入液氮中長期保存。
[0007]具體包括以下步驟:
(1)冷凍液組分與配製
每 100ml 冷凍液含有:二甲基亞碸(DMSO) 9-11ml、Supercool X-1000 0.8-1.5 ml、胎牛血清(FBS) 15-20 ml、穀胱甘肽 0.15-0.25g、蔗糖 1-2g 和 DMEM/F12 液 75.2-67.5ml ;冷凍液經0.22微米濾膜過濾後4°C保存；
(2)組織勻漿處理
在無菌超淨臺內首先將組織放在平皿中修剪成1.0-1.2cm3的塊狀，然後用PBS液徹底衝洗5-8遍，之後把組織塊放在乾燥的平皿內沾3-5下，讓組織塊稍微乾燥後，放入組織勻漿機的無菌試管內，180-200轉/分鐘勻漿處理3-5分鐘，這時組織塊成乳糜狀；
(3)組織塊的冷凍
冷凍時，先用吸管將乳糜狀組織塊放入離心管內，根據組織塊的體積加入8-10倍量的冷凍液混勻，然後按每管5毫升分裝到凍存管中，之後放置在冷凍保存盒中_80°C超低溫冰箱過夜，次日將凍存管轉入液氮中長期保存(注:從加入冷凍液到將冷凍保存盒放置在超低溫冰箱中整個操作時間在5-8分鐘內完成，且室溫維持在22-25°C)。
[0008]解凍方法:解凍時依次經過解凍液、培養液離心洗滌，之後組織塊可直接接種培養或經蛋白酶消化成單個細胞後培養。
[0009](1)解凍液組分與配製
每100ml解凍液含有:FBS 10-15ml、穀胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖2-3g和DMEM/F12液90-85ml，經0.22微米濾膜過濾後4°C保存；
(2)解凍時，先將凍存管從液氮中取出，放在38-39°C水浴中溶解，用吸管吸取組織塊放入離心管中，加入4-5倍量解凍液輕輕混勻後靜置3-5分鐘，然後離心(800轉/分鐘、3分鐘)去掉上清液,之後再加入4-5倍量培養液輕輕混勻後離心(800轉/分鐘、3分鐘)並去掉上清液，這時可將組織塊直接接種到培養瓶中或經蛋白酶消化成單個細胞，加入培養液後放CO2培養箱內培養。
[0010]本發明的有益效果是:(1)本發明先將組織用勻漿機處理成乳糜狀，這種處理不僅比已報導的徒手切塊剪碎省時、省力，而且使單個組織塊更均勻、細小(每塊直徑在
0.1-0.2 mm之間)，有利於冷凍保護劑DMSO滲透進入組織細胞內，使細胞內水分脫出；同時冷凍液中添加的非滲透性保護劑蔗糖，也有利於組織細胞內的水分脫出，所以冷凍時能有效地防止組織細胞內冰晶的生成。(2)本發明在冷凍液和解凍液中加入抗氧化物質穀胱甘肽，有助於減輕氧自由基對細胞內蛋白的破壞作用，將冷凍損傷降到最低。解凍後組織塊如果在培養瓶內直接接種，貼壁存活率在96%以上，高於已報導的89.8%。如果用蛋白酶消化成單個細胞後經臺盼藍染色，活細胞率為92.8%，與新鮮組織消化後活細胞率為94.6%差異不顯著；(4)本發明方法已在山東省農業科學院畜牧獸醫研究所內部推廣使用，普遍認為是一種省時省力的組織冷凍保存方法。
【專利附圖】

【附圖說明】[0011]圖1為實施例1貼壁約90-100%的肌肉細胞生長圖片(相差顯微鏡下放大100倍觀察)。
[0012]圖2為實施例2貼壁約90-100%的乳腺細胞生長圖片(相差顯微鏡下放大100倍觀察)。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
1、冷凍液配製
將9毫升DMSO, I毫升Supercool X-1000、18毫升FBS,0.2克穀胱甘肽、1.2克蔗糖溶解在72毫升DMEM/F12液中，經0.22微米濾膜過濾後4°C保存備用。
[0014]2、解凍液配製
將12毫升FBS、0.2克穀胱甘肽、3克蔗糖溶解在88毫升DMEM/F12液中，經0.22微米濾膜過濾後4°C保存備用。
[0015]3、肌肉組織樣品處理
從屠宰場剪取成年魯西黃牛後肢外側肌肉組織，放在含1%青鏈黴素液的PBS液中2小時內帶回實驗室。在無菌超淨臺內首先將肌肉組織放在平皿中，修剪成I cm3塊狀，然後用PBS液衝洗8遍，衝洗時操作者左手持彎眼科鑷夾住組織塊，右手持彎眼科剪用其外側鈍端反覆擺攤開組織塊內部，之後把組織塊放在乾燥的平皿內沾3下，讓組織塊稍微乾燥後接著放入組織勻漿機的無菌試管內，180轉/分鐘勻漿處理5分鐘，這時組織塊成乳糜狀。
[0016]4、組織塊的冷凍與解凍
冷凍時室溫為25°C，先用吸管將乳糜狀的組織塊放入50毫升離心管內，每管內組織塊為3毫升,然後加入30毫升冷凍液輕輕混勻,之後按每管5毫升分裝到凍存管中,放置在冷凍保存盒中_80°C超低溫冰箱過夜，整個操作時間在5分鐘內完成。次日將凍存管轉入液氮中長期保存。
[0017]68天後解凍組織塊，先將凍存管從液氮中取出，放在38°C水浴中溶解，然後用吸管吸取組織塊放入50毫升離心管中，加入25毫升解凍液輕輕混勻後靜置4分鐘，之後離心(800轉/分鐘、3分鐘)去掉上清液，再加入25毫升培養液(添加10% FBS,0.5%青鏈黴素混合液的DMEM/F12液)輕輕混勻後離心(800轉/分鐘、3分鐘)並去掉上清液。
[0018]5、解凍後細胞培養
用吸管將組織塊直接接種到T75培養瓶中，在培養瓶的對側加入25毫升培養液後放CO2培養箱內，2小時後輕輕翻轉培養瓶，讓培養液充分浸潤組織塊並繼續培養。70小時後有細胞從組織中游離出來，98小時後有約10-20%細胞貼壁，這時在相差顯微鏡下統計組織塊貼壁存活率為96.2%，之後換入新鮮培養液，7天後有約90-100%細胞貼壁(如圖1所示)。
[0019]實施例2
1、冷凍液配製
將11毫升DMS0U.2毫升Supercool X_1000、20毫升FBS、0.15克穀胱甘肽、I克蔗糖溶解在67.8毫升DMEM/F12液中，經0.22微米濾膜過濾後4°C保存備用。
[0020]2、解凍液配製
將12毫升FBS、0.15克穀胱甘肽、2克蔗糖溶解在88毫升DMEM/F12液中，經0.22微米濾膜過濾後4°C保存備用。
[0021]3、乳腺組織樣品處理
從屠宰場剪取荷斯坦奶牛乳腺組織，放在含1%青鏈黴素液的PBS液中3小時內帶回實驗室。在無菌超淨臺內首先將乳腺組織放在平皿中，修剪成1.2 cm3塊狀，然後用PBS液衝洗6遍，衝洗時操作者左手持彎眼科鑷夾住組織塊，右手持彎眼科剪用其外側鈍端反覆擺攤開組織塊內部，之後把組織塊放在乾燥的平皿內沾5下，讓組織塊稍微乾燥後接著放入組織勻漿機的無菌試管內，190轉/分鐘勻漿處理3分鐘，這時組織塊成乳糜狀。
[0022]4、組織塊的冷凍與解凍
冷凍時室溫為23°C，先用吸管將乳糜狀的組織塊放入50毫升離心管內，每管內3.5毫升，然後加入32毫升冷凍液混勻，之後按每管5毫升分裝到凍存管中，放置在冷凍保存盒中-80°C超低溫冰箱過夜，整個操作時間在8分鐘內完成。次日將凍存管轉入液氮中長期保存。
[0023]134天後解凍組織塊，先將凍存管從液氮中取出，放在39°C水浴中溶解，然後用吸管吸取組織塊放入離心管中，加入20毫升解凍液輕輕混勻後靜置3分鐘，之後離心(800轉/分鐘、3分鐘)去掉上清液，再加入20毫升培養液(添加10% FBS,5 ng/mL表皮生長因子、0.5%青鏈黴素混合液的DMEM/F12液)輕輕混勻後離心(800轉/分鐘、3分鐘)並去掉上清液。
[0024]5、解凍後細胞培養
在離心管內加入5毫升0.25%胰酶消化液，用吸管反覆吹打組織塊後放在培養箱內，以後每隔5分鐘用吸管反覆吹打組織塊，15分鐘後組織塊呈柔軟的絲線狀，這時在離心管內加入20毫升培養液，經200目細胞篩過濾後離心(800轉/分鐘、3分鐘)去掉上清液，然後重新加入培養液調節細胞密度約為5 X IO5個/毫升，同時用臺盼藍染色統計活細胞率為92.8% (注:冷凍前已進行新鮮乳腺組織的消化處理，檢測活細胞率為94.6%)。之後按每個T75培養瓶加入25毫升細胞混合液放入CO2培養箱內培養，18小時後有約10-20%細胞貼壁，48小時後換入新鮮培養液，96小時後有約90-100%細胞貼壁(如圖2所示)。
【權利要求】
1.一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法，其特徵是，先將新取的動物組織勻漿處理成乳糜狀，然後加入冷凍液混勻，分裝到冷凍管中，之後放置在冷凍保存盒中-80°C超低溫冰箱過夜，最後放入液氮中長期保存；所述冷凍液的組分為:每100ml冷凍液含有:二甲基亞碸 9-llml、Supercool X-1000 0.8-1.5 ml、胎牛血清 15-20 ml、穀胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖l-2g和DMEM/F12液75.2-67.5ml ;冷凍液經0.22微米濾膜過濾後4°C保存。
2.如權利要求1所述的一種用於細胞培養的組織塊的冷凍保存方法，其特徵是， (1)在無菌超淨臺內首先將組織放在平皿中修剪成1.0-1.2cm3的塊狀，然後用PBS液徹底衝洗5-8遍，之後把組織塊放在乾燥的平皿內沾3-5下，讓組織塊稍微乾燥後，放入組織勻漿機的無菌試管內，180-200轉/分鐘勻漿處理3-5分鐘，這時組織塊成乳糜狀； (2)冷凍時，先用吸管將乳糜狀組織塊放入離心管內，根據乳糜狀組織塊的體積加入8-10倍量的冷凍液混勻，然後按每管5毫升分裝到凍存管中，之後放置在冷凍保存盒中-80°C超低溫冰箱過夜，次日將凍存管轉入液氮中長期保存。
3.一種用於細胞培養的組織塊的解凍方法，其特徵是，解凍時先將權利要求1或2所述的凍存管從液氮中取出，依次經過解凍液離心洗滌、培養液離心洗滌，之後組織塊可直接接種培養或經蛋白酶消化成單個細胞後培養；所述解凍液的組分為:每100ml解凍液含有:胎牛血清10_15ml、穀胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖2_3g和DMEM/F12液90_85ml，經0.22微米濾月旲過濾後4 C保存。
4.如權利要求3所述的用於細胞培養的組織塊的解凍方法，其特徵是，解凍時，先將權利要求I或2所述的凍存管從液氮中取出，放在38-39°C水浴中溶解，用吸管吸取組織塊放入離心管中，加入4-5倍量解凍液輕輕混勻後靜置3-5分鐘,然後離心去掉上清液,之後再加入4-5倍量培養液輕輕混勻後離心並去掉上清液，這時可將組織塊直接接種到培養瓶中或經蛋白酶消化成單個細胞，加入培養液後放CO2培養箱內培養。
【文檔編號】C12N5/071GK103478118SQ201310465591
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月9日 優先權日:2013年10月9日
【發明者】譚秀文, 遊偉, 靳青, 劉桂芬, 劉曉牧, 宋恩亮, 萬發春 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所