家蠶Bmlp3基因啟動子及其運用的製作方法

2023-08-02 12:11:01 1

專利名稱：家蠶Bmlp3基因啟動子及其運用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及家蠶aiilp3基因啟動子及其運用。
背景技術：
家蠶是重要的經濟昆蟲，曾為中華民族文化經濟社會發展做出了極為重要的貢獻。同時，其遺傳背景清楚，遺傳資源豐富，又是國際公認的鱗翅目模式昆蟲。家蠶的重要性狀之一就是末齡幼蟲脂肪體具有高效合成蛋白質的能力，在五齡後期至化蛹這段時間內， 蠶的脂肪體非常發達，約佔體重的30%，基於這一特點，將其開發成新型生物反應器，可以利用轉基因蠶生產更多種類的有用蛋白，拓寬家蠶的應用領域，提高家蠶的應用價值，推動我國蠶學與昆蟲學科的長遠發展。自基於piggBac轉座子為介導的家蠶轉基因技術獲得成功以來，這項技術已經運用於家蠶基因功能的研究以及將轉基因家蠶作為「生物工廠」的探索，例如Ras基因功能的研究，絲心和絲膠蛋白基因啟動子的鑑定等等，這些都為本研究的工作開展打下了良好的 ■石出。30K蛋白是家蠶末齡幼蟲血液中的主要蛋白，1ρ3基因是其家族中成員之一，它的以下特徵促使將其調控元件作為開發脂肪體生物反應器的啟動子①脂肪體特異表達所有的30K蛋白基因都是在脂肪體中合成後分泌到血液中，脂肪體是其轉錄合成的場所；② 強大的轉錄效率目前鑑定的30K家族成員已達到10個之多，它們的表達水平差異很大， 1ρ3是其中表達量最高的基因之一；③時期表達相對集中1ρ3基因從五齡中後期到蛹期這段時間內轉錄合成，與脂肪體蛋白質含量最高的時期相吻合。這些特徵為利用家蠶&iilp3 基因啟動子在脂肪體表達外源蛋白提供了理論支持，而且在利用PiggBac來源的轉座子介導的家蠶轉基因的研究報導中，有關利用家蠶30K蛋白基因啟動子在脂肪體表達外源蛋白的方法未見報導。

發明內容
本發明的目的之一在於提供一種基因啟動子，該啟動子以家蠶的基因組為模板， 通過設計的1ρ3啟動子上下遊引物來擴增得到的。為實現上述目的，本發明的技術方案為
所述家蠶&iilp3基因啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 上述序列的獲得步驟為以家蠶品種P50五齡三天的基因組為模板進行PCR擴增，上遊弓I物為5' -ggaattccagtatagttacaacggctgcccc-3'，下遊弓丨物為5' -cgggatcccgcgtc gagtcctgcaatatgt-3'，擴增條件為94°C預變性4分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒， 72 °C延伸80秒，共30個循環；最後72 °C延伸10 min,4 °C保存。本發明的目的之二在於提供家蠶aiilp3基因啟動子的運用，該運用為開發家蠶脂肪體外源蛋白表達的生物反應器提供了新思路。為實現上述目的，本發明的技術方案為所述的家蠶anlp3基因啟動子在脂肪體中表達外源蛋白的運用。進一步，所述家蠶aiilp3基因啟動子在脂肪體中表達紅色螢光蛋白的運用。本發明的目的之三在於提供一種重組載體，所述重組載體注射到家蠶早期胚胎後可導致脂肪體表達外源蛋白。為實現上述目的，本發明的技術方案為
所述的家蠶anlp3基因啟動子的重組載體，所述重組載體為anlp3-DSRed-SV40片段同基礎載體 pBac [3xP3-EGFPafm]連接而成的 pBac [Bmlp3-DsRed_SV40，3xP3EGFP]顯微注射載體。本發明的目的之四在於提供一種顯微注射載體的製備方法，該方法操作簡單。為實現上述目的，本發明的技術方案為
用於家蠶脂肪體表達外源蛋白的顯微注射載體的製備方法，具體包括以下步驟
A、pMD19-Bmlp3的構建
如SEQ ID N0:1所示的家蠶anlp3基因啟動子與載體pMD19-T simple進行TA克隆後得到的重組表達載體，即pMD19-Bmlp3 ；
B、pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]的構建
分別用EcoR I和BamH I雙酶切pMD19_Bmlp3質粒，回收家蠶&iilp3基因啟動子與分別用EcoR I和BamH I雙酶切的pSL[MCS-DsRed-SV40]載體片段進行連接，構建成 pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]；
C、顯微注射載體的製備
用Asc I 酶切步驟B所得pSL[an lp3-DsRed-SV40], 將切下的 Bmlp3-DsRed-SV40片段連接到Asc I酶切的pBac [3xP3_EGFPafm]基礎載體，構建成 pBac [Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]顯微注射載體。進一步，步驟A中，以家蠶基因組為模板進行PCR擴增，其中，上遊引物為5' -gga attccagtatagttacaacggctgcccc-3『，下遊引物為5' -cgggatcccgcgtcgagtcctgcaatatg t-3'；擴增條件為94°C預變性4分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72 °C延伸80秒， 共30個循環；最後72 °C延伸10 min，得如SEQ ID NO: 1所示的家蠶&iilp3基因啟動子，將其與載體PMD19-T simple進行TA克隆後得到的重組表達載體，即pMD19_Bmlp3。本發明的目的之五在於提供pBac [anlp3-DsRed-SV40，3xP3EGFP]顯微注射載體的運用，該運用該運用為開發家蠶脂肪體外源蛋白表達的生物反應器提供了新思路。為實現上述目的，本發明的技術方案為
pBac[Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]顯微注射載體在家蠶脂肪體中表達外源蛋白的應用。有益效果1)利用家蠶脂肪體蛋白質的高效合成與儲存能力蠶的脂肪體非常發達，特別在五齡中後期至化蛹這段時間內，其脂肪體約佔體重的30%。如果按一頭蠶(五齡盛食期)平均體重為5g計算，其脂肪體蛋白含量最高可達到1. 5g左右。2)表達時期的可控性利用&iilp3基因啟動子，可實現外源蛋白在脂肪體最為發達的發育階段內進行表達；不管是在幼蟲期還是蛹期，外源蛋白的特性不會受到影響。3)下遊分離純化的簡便性脂肪體蛋白的分離純化相對較為簡單，在目前的工業生產和實驗室研究中均有比較成熟的分離純化技術體系。利用脂肪體表達的有用蛋白，甚至可不需純化而直接將蠶幼蟲或蛹加工成粉末，作為生產食品、保健品或動物飼料添加劑等的原材料；4)對傳統產業的影響小自古以來，家蠶主要被用於生產蠶絲，按目前我國年均產蠶繭80萬噸計算，每年可產生蠶蛹副產物約56萬噸。如能利用蠶蛹脂肪體生產有用蛋白，既充分利用了工業生產中廢棄的大量蠶蛹資源，又不會影響其主要的蠶絲生產，有利於顯著提高產業的綜合效益和農民養蠶收益。加之家蠶所具有的遺傳背景清楚、高等真核生物的蛋白質後修飾加工、大規模生產成本低和對人畜安全等，滿足了新一代生物反應器的基本要求，其開發潛力巨大。5)由piggBac 來源的轉座子介導的轉基因具有穩定性高、可遺傳等特徵，通過繼代飼養可迅速擴大群體， 為外源蛋白純化提供量上的保證。


圖1為包含不同長度的aiilp3啟動子的載體轉染ail E細胞後的活性分析，Luc-Fl 到LUC-F7代表包含不同長度的&ιι1ρ3啟動子的載體和pGL3-BasiC對照載體，箭頭表示轉錄起始位點與轉錄方向；長方形表示TATA框，黑方框代表非翻譯區，條紋框表示內含子；
圖2為轉基因家蠶個體的螢光觀察後的灰度處理照片，a.卵(白光下)b.卵(螢光下)c.成蟲(白光下)d.成蟲(螢光下)；
圖3為轉基因家蠶個體的Southern blot分析，1為Gl代蠶蛾DNA {Hind III酶切)，2 為Gl代蠶蛾DNA (Bgl II酶切)，3為正常蠶蛾DNA (Bgl II酶切)。
圖4為轉基因家蠶的螢光觀察的灰度處理照片，a，c, e, g, i, k為白光下觀察，b， d, f, h, j, 1為螢光下觀察；
圖5為轉基因蠶中紅色螢光蛋白在不同組織中W^festern blot分析，1 Marker, 2對照，3絲腺，4中腸，5脂肪體，6標準品。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件進行。實施例1家蠶&iilp3基因啟動子的獲得
啟動子元件的PCR擴增是以家蠶品種P50五齡三天的基因組為模板，根據設計的1ρ3 啟動子上下遊引物來擴增得到，具體構建如下
首先是啟動子元件的獲得&ιι1ρ3啟動子由1ρ3基因5'-上遊序列，外顯子1，內含子 1和外顯子2的17bp組成，它不含1ρ3基因的信號肽序列，由上下遊引物以家蠶品種P50五齡三天的基因組為模板擴增獲得，上遊引物Ρ-f含有一個EcoR I位點5' -ggaattcCAGTAT AGTTACAACGGCTGCCCC-3 『，下遊引物 Ρ-r 含有一個 BamH I 位點5 『 -cgggatccCGCGTCGAGT CCTGCAATATGT-3'，擴增條件為94°C預變性4分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72 "C 延伸80秒，共30個循環；最後72 °C延伸10 min,4 °C保存。家蠶基因組中擴增獲得的&iilp3啟動子經克隆和測序驗證，其序列長度為1 119bp。對克隆的&ιι1ρ3啟動子序列進行分析發現該序列含有ifeTA 基因的第1外顯子、第1 內含子、第2外顯子的一部分、核心啟動區域和5'端旁側區，跨於基因的-374到+745位置，其DNA序列為
權利要求
1.家蠶anlp3基因啟動子，其特徵在於，所述家蠶aiilp3基因啟動子的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
2.權利要求1所述的家蠶&ιι1ρ3基因啟動子在脂肪體中表達外源蛋白的運用。
3.根據權利要求2所述的運用，其特徵在於，所述家蠶&ιι1ρ3基因啟動子在脂肪體中表達紅色螢光蛋白的運用。
4.含有權利要求1所述的家蠶anlp3基因啟動子的重組載體，所述重組載體為anlp3-DsRed-SV40片段同基礎載體pBac [3xP3-EGFPafm]連接而成的 pBac [Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]顯微注射載體。
5.用於家蠶脂肪體表達外源蛋白的顯微注射載體的製備方法，其特徵在於，具體包括以下步驟A、pMD19-Bmlp3的構建如SEQ ID NO: 1所示的家蠶anlp3基因啟動子與載體pMD19_T simple進行TA克隆後得到的重組表達載體，即pMD19-Bmlp3 ；B、pSL [Bmlp3-DsRed-SV40]的構建分別用EcoR I和BamH I雙酶切pMD19_Bmlp3質粒，回收家蠶&iilp3基因啟動子與分別用EcoR I和BamH I雙酶切的pSL[MCS-DsRed-SV40]載體片段進行連接，構建成 pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]；C、顯微注射載體的製備用Asc I 酶切步驟B所得pSL[an lp3-DsRed-SV40], 將切下的 Bmlp3-DsRed-SV40片段連接到Asc I酶切的pBac [3xP3_EGFPafm]基礎載體，構建成 pBac [Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]顯微注射載體。
6.根據權利要求5所述的於家蠶脂肪體表達外源蛋白的顯微注射載體的製備方法，其特徵在於，步驟A中，以家蠶基因組為模板進行PCR擴增，其中，上遊引物為5' -ggaattcc agtatagttacaacggctgcccc-3『，下遊弓I物為5' _cgggatcccgcgtcgagtcctgcaatatgt_3『；擴增條件為94 V預變性4分鐘，94 V變性30秒，55 °C退火30秒，72 V延伸80秒，共30 個循環；最後72 °C延伸10 min，得如SEQ ID NO: 1所示的家蠶&iilp3基因啟動子，將其與載體pMD19-T simple進行TA克隆後得到的重組表達載體，即pMD19_Bmlp3。
7.pBac[Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]顯微注射載體在家蠶脂肪體中表達外源蛋白的應用。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，特別涉及家蠶Bmlp3基因啟動子，如SEQ ID NO:1所示，該啟動子可用於在脂肪體中表達外源蛋白，本發明還包括用於家蠶脂肪體表達外源蛋白的顯微注射載體的製備方法，具體為含有家蠶Bmlp3基因啟動子的重組表達載體、表達框的構建及顯微注射載體的製備；Bmlp3基因啟動子可實現外源蛋白在脂肪體最為發達的發育階段內進行表達，本方法可實現表達時期的可控性，由piggBac來源的轉座子介導的轉基因具有穩定性高、可遺傳等特徵，通過繼代飼養可迅速擴大群體，為外源蛋白純化提供量上的保證。
文檔編號C12N15/66GK102191249SQ20111008374
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月2日 優先權日2011年4月2日
發明者夏慶友, 徐漢福, 鄧黨軍, 馬三垣 申請人:西南大學