芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法
2023-08-02 10:31:36
專利名稱：芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法。
背景技術：
當代，發展可持續農業已成為全人類的共識。然而，長期以來化學農業、畜牧業和工業的發展已引起嚴重的環境汙染，其中有機磷是重要的汙染源之一。農業生產中有機磷農藥、畜牧排洩物中的植酸磷及工業廢水和生活汙水中的多種有機磷等給環境造成巨大的負荷，制約了農業和水產等行業的發展。因此，消除有機磷汙染成為世界各國關注的課題。
微生物降解是消除有機磷汙染的重要途徑。自然界中有機磷的分解很大程度上取決於微生物的作用，土壤中另一類主要的磷——難溶性無機磷也必須在微生物的作用下才解離並為作物吸收利用，因此微生物在土壤磷汙染的清除和磷營養的有效化中起重要作用。但自然條件下，微生物的作用極其緩慢。利用現代技術對微生物進行改造，構建解磷工程菌，增強或誘導有機磷和無機磷的分解能力，消除磷汙染，同時為作物提供磷營養，這是目前解決磷汙染和磷營養的理想手段。改造微生物菌種，構建工程菌總體上講有兩種途徑，即誘變和雜交。
1.構建微生物工程菌的原理和方法微生物現代育種主要原理是雜交和突變，由此產生二種微生物工程菌構建方法誘變育種和雜交育種。各分述如下誘變育種 其理論基礎是誘發突變。常用的誘變劑有物理誘變劑(如射線、雷射)、化學誘變劑(如HNO2、5-溴嘧啶)及生物誘變劑(如增變基因和轉位子)等，它們大多通過改變DNA鹼基配對情況或插入、缺失一段鹼基而導致基因結構的改變，從而改變生物性狀。誘變育種又可分為體內誘變和體外誘變。體外誘變也叫定位突變，指在體外使基因的特定區域有效地產生突變。突變株通過選育可獲得多種工程菌。
體內誘變育種突變率較高，性能改良的幅度較大，而且應用方便、迅速、經濟，所以被廣泛採用，目前很多優良菌株都是用此法得到的。但是它需要強烈的物理化學因素作用，很容易嚴重損壞菌株的遺傳背景，且定向性幾乎沒有，盲目性較大，有時也會對人體造成一定的傷害。體外誘變卻具有極好的定向性，而且突變率高達百分之幾，易於人為控制，所以目前已頻頻應用於工業生產。由此可見，隨著生物技術的飛速發展和對育種要求的日益提高，體外誘變技術將進一步得到育種工作者們的青睞。
雜交育種 雜交育種的理論基礎是雜交技術。目前常用的幾種雜交育種方法有(1)原生質體融合主要用於自然狀況下不能或很難進行雜交的細胞，可以突破種的界限。
(2)細胞雜交這是一種自然條件下就可進行的雜交方式。
(3)基因工程即DNA重組技術，是分子水平的雜交育種。其過程是，在體外將不同來源的DNA分子進行重組，再轉入合適的宿主中表達。
雜交育種可以將不同來源的優良性狀組合在一起，取長補短，更趨完美。其中原生質體融合技術可克服性和種的障礙，重組頻率很高，重組子具有形形色色的種類，同時還可與其它育種方法配合使用。但此法操作過程較繁瑣，難度較大，故非直接、有效的方法。細胞雜交技術較方便，但方向性和人為控制性尚不夠理想，且無法克服性和種的障礙，所以也不是理想的途徑。現代基因工程技術不但完全突破種和親緣關係的約束，還可進行定向誘變，甚至開創全新的物種，獲得各種基因工程菌。但基因工程技術用於育種，其前提是菌株的遺傳背景必須清楚，因此對於大多生產菌，由於遺傳背景複雜，基因工程技術在原有生產菌改良上應用並不多。對於微生物肥料，因為是將活的菌體直接施入土壤和環境中，因此在我國的菌肥標準中明確限制基因工程菌的應用。
以上各種誘變育種途徑可獲得多種工程菌。比較二種育種途徑，誘變育種仍是構建工程菌的主要方式。射線(β、γ射線)、核輻射、化學誘變等是目前普遍使用的育種手段，但長期使用同一種誘變劑，菌種往往產生抗性，要想獲得更大的變異就必須採用新的誘變源。離子束、雷射、航空是最近發展起來的物種誘變方法，其中離子束是我國獨創的構建工程菌株的新技術。2.離子束作用的原理和主要特點離子束注入生物效應是我國科技人員於80年代發現，並迅速投入育種應用領域，至今已發展為一種全新的育種技術。
離子束作用的原理在離子源中，氣體(或蒸汽)放電產生等離子體，等離子體通過質量分析器分離獲得相應的相同電荷離子，再經加速器獲得不同能量的離子束，即載能離子束。目前，已經有N+、Ar+、He+、H+等多種離子束用於育種。載能離子束在靶室內(靶室必須為真空，以避免載能離子與空氣的氣體分子碰撞而發生能量損失或散射)作用於生物體，即可誘導變異。
載能離子誘發變異要經歷多個過程。首先，荷能離子進入生物體後，與其中的多種原子和電子相互作用，逐漸將動能傳給靶原子和電子，直至離子的動能完全散失並停止，這一過程稱為離子的「慢化」，這是入射離子發生能量傳遞和沉積過程。靶原子如果在碰撞中獲得足夠能量將越過勢壘而離開原來的位置，發生移位。慢化離子、移位原子可產生空位、填隙雜質原子和替代雜質原子，空位、移位原子、慢化離子與靶原子的重排和複合，可形成新的分子和基團，產生豐富的突變體。其次，電荷交換效應，入射離子在靶中慢化後，與靶原子的每一次碰撞都會失去一定的電子或從靶中俘獲電子，從而發生電荷交換。電荷交換常引起生物體表面電離基團數量、離解常數和拓撲學排列的變化，導致細胞與細胞之間的作用，Ca2+與細胞膜的相互作用和細胞膜離子通透性的改變，從而引起一系列生理變化。此外，離子注入還可引發自由基損傷。荷能離子注入生物體時，由於靶分子的激發、電離，在碰撞範圍將產生自由基。活潑的自由基容易與靶分子發生加成、抽氫和電子轉移等反應，從而引起生物體發生結構和功能改變，引起突變。可見，離子(H+、N+、Ar+等)注入細胞後，通過電、能、質的共同作用，不僅影響細胞的生理生化功能，更重要的是使細胞中的染色體畸變、DNA和RNA鏈損傷、斷裂，引起酶的突變或激活，產生多種突變，從而為工程菌的獲得提供了基礎。
離子束作用的主要特點 由於質、能、荷三因子的協同作用，離子束注入引起大量受體原子移位、重組和生物分子的變異，形成新的分子結構和基團，產生豐富的基因突變，因而離子束注入可以在損傷輕的情況下獲得較高的突變率。具體地，離子束誘變具有如下特點首先，與射線誘變類似，離子束注入具有能量沉積引起的誘變效應；與射線誘變不同，離子束注入還存在動量交換產生的級聯損傷，表現為遺傳物質原子移位、重排或基因缺失，產生基因突變；其次，類似化學誘變，離子束注入產生的慢化離子、移位原子與本底元素複合可造成化學變異；此外，離子束注入過程的電荷交換可引起生物分子電子轉移和自由基反應，引發生物誘變。可見，離子束注入兼具物理、化學和生物誘變的特性，這種複合誘變顯著提高了誘變頻率和效率，如在相同存活率下，離子束注入傷寒類沙門菌，其營養缺陷型突變頻率和誘變效率比γ射線分別提高14～45％和16～35％。總之，離子束誘變具有多種優越性，表現為高激發性、計量集中和可控性，細胞損傷輕、突變率高、突變譜廣，可進行定向誘變，已成為當代種質改良和育種的重要新手段。
離子束應用現狀 離子束在遺傳改良上應用最早的是誘變育種，其中主要是植物種質的改良。在工業微生物菌種改良上，應用離子束注入也構建不少高效工程菌，並在工業生產中發揮了重要作用。現有的生產菌株對以往常用的物理化學誘變方法往往表現不同程度的抗性，而離子束作為一種新的誘變源，表現出很好的應用效果。中國科學院等離子體物理研究所與國內數十個單位合作，以生產使用的高產菌株為出發菌，大幅度提高了多種工業微生物發酵產物的產量，已投入生產的微生物菌種有3個。通過離子束誘變，浙江農業科學研究院將糖化酶生產菌的酶活從1.5萬發酵單位提高到2萬單位；姚建銘等將利福黴素菌株的發酵水平提高了40％；許安等用此法獲得的維生素C生產菌創國內外二步法發酵糖酸轉化率新高，摩爾轉化率最高達97.5％。可見，離子束對微生物的誘變效果極為顯著。
儘管離子束誘變在工業微生物育種上獲得了許多高產工程菌，但在農業和環境微生物方面幾乎還沒有涉入。將離子束注入誘變技術應用於農業和環境微生物工程菌的構建，可望有效地突破現有菌株的性狀，獲得全新的生物工程菌，提高微生物改善土壤供肥和清除環境汙染的能力，從而開創農業和環境微生物菌株改良和育種的新途徑。
發明內容
本發明的目的是提供一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法。
構建芽孢桿菌解磷工程菌株的方法的步驟為1)在斜面上活化培養芽孢桿菌，所用培養基為牛肉膏蛋白腖培養基，活化後的細菌，直接用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫成菌懸液；2)將菌懸液離心，收集孢子，用生理鹽水或磷酸緩衝液將孢子稀釋並塗布於無菌的空白平皿或載玻片上，乾燥0.5～2h；3)將N+、H+、Ar+或He+離子束注入芽孢桿菌，所注入的離子能量為10～30KeV、劑量為5～300×1014ions/cm2，在2×10-2～6×10-3Pa真空、無菌條件下進行間歇脈衝式注入，每次脈衝間隔50～100秒；4)用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫孢子，並稀釋至一定濃度，在NBRIY培養基上進行篩選，然後經過鑑定，獲得高效分解有機磷的工程菌株。
另一種構建芽孢桿菌解磷工程菌株的方法的步驟為1)在無氮培養基斜面上活化培養芽孢桿菌，活化後的細菌，接種於產無莢膜芽孢的液體培養基中，25～30℃、150～250rpm/min培養36～72h，離心收集孢子；
2)將孢子用生理鹽水或磷酸緩衝液稀釋並塗布於無菌的空白平皿或載玻片上，乾燥0.5～2h；3)將N+、H+、Ar+或He+離子束注入芽孢桿菌，所注入的離子能量為10～30KeV、劑量為5～300×1014ions/cm2，在2×10-2～6×10-3Pa真空、無菌條件下進行間歇脈衝式注入，每次脈衝間隔50～100秒；4)用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫孢子，並稀釋至一定濃度，在NBRIY培養基上經過篩選後，在NBRIP培養基上進行復篩，最後通過鑑定，獲得高效分解有機磷、無機磷或無機鉀的工程菌株。
本發明的優點是針對目前有機磷汙染嚴重的問題，應用誘變效率高、突變幅度大的新型誘變技術——離子束注入構建工程菌，增強芽孢桿菌分解有機磷和無機磷的能力，實現土壤自淨和營養自給的雙重功能。矽酸鹽細菌是目前普遍應用於微生物鉀肥生產的芽孢桿菌，通過離子束注入，構建新的工程菌株，可增強其對土壤磷的分解，提高該菌提供有效磷和鉀的功效。通過離子束注入所構建的工程菌株對有機磷或無機磷的分解能力分別提高15～45％和10％～25％。
附圖是芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法的流程圖。
具體實施例方式
離子束誘變是目前國際上先進的誘變技術，利用該技術對芽孢桿菌進行改造，構建可分解有機磷或無機磷的工程菌，為生產可高效分解有機磷或無機磷的新型微生物磷肥或磷鉀複合肥提供優良種子，促進微生物磷肥或磷鉀複合肥的品質提高及其推廣應用，加速生態農業發展進程，同時為微生物肥料生產菌的改良和育種提供新方法。
誘變育種有兩個技術關鍵其一，創造大量有效的突變子其二，建立快速、準確而方便的高效篩選子。本發明通過特定的離子束注入進行誘變，獲得大量高突變率的變異株，然後通過有效的篩選培養基進行篩選，獲得工程菌株。具體步驟如下1、細菌孢子的培養及前處理莢膜的存在嚴重影響誘變效果。不產莢膜的芽孢桿菌的孢子直接在牛肉膏蛋白腖斜面培養基上培養獲得。產莢膜的芽孢桿菌如矽酸鹽細菌則須在特定的培養基上培養。
1.1不產莢膜的芽孢桿菌的孢子培養
1)牛肉膏蛋自腖培養基牛肉膏5.0g；蛋白腖10.0g；NaCl 5.0g；瓊脂粉18～20g；蒸餾水1000；pH7.0～7.5。
2)在牛肉膏蛋白腖培養基斜面上接種芽孢桿菌，25～30℃培養24～48h；3)用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫斜面上的菌落，5000～8000rpm/min離心3～5min，收集孢子，用生理鹽水洗1～3次，稀釋孢子至一定濃度；取該孢子懸液0.3～0.5mL塗布於無菌的空平皿上，充分塗勻後，在超淨工作檯上通風乾燥0.5～1h，立即進行離子束注入處理。
1.2芽孢桿菌的孢子培養1)菌種活化 在無氮培養基上接種種子菌，28～30℃培養24～36h；無氮培養基矽酸鋁鉀1.2～2.0g；蔗糖5.0～10g；Na2HPO41.0～2.0g；FeCl30.003～0.005g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；瓊脂18～20g；蒸餾水1000ml；pH7.0～7.5。
2)生產芽孢 無莢膜芽孢的液體生產培養基，500ml三角瓶裝培養液50ml，接種斜面洗脫的種子菌液，28～30℃振搖培養，轉速200～250轉/min，培養48～72h；無莢膜芽孢的生產培養基澱粉10～20g；(NH4)2SO41.0～2.0g；MgSO4·7H2O 0.5～1.0g；K2HPO40.5～1.0g；FeCl30.005～0.008g；蒸餾水1000ml；pH7.0～7.5。
3)前處理5000～8000rpm/min離心3～5min，收集孢子，用生理鹽水洗1～3次，稀釋孢子至一定濃度；取該孢子懸液0.3～0.5mL塗布於無菌的空平皿上，充分塗勻後，在超淨工作檯上通風乾燥0.5～1h，立即進行離子束注入處理；2、離子束注入1)離子束種類、注入劑量、出發菌株的特性都會影響誘變效率，因此必須根據具體的離子束類型、菌株種類確定最佳離子注入劑量。離子束可選擇N+、H+、Ar+或He+等離子作為注入離子，注入離子的能量為10～30KeV，劑量為5～300×1014ions/cm2。離子注入倉真空度為1×10-2～4.2×10-3Pa；間歇脈衝式注入，每次脈衝間隔55～90秒。
2)在上述注入條件下，採用系列劑量對芽孢桿菌進行離子注入處理，用生理鹽水洗脫處理過的孢子，在牛肉膏蛋白腖或無氮培養基上測定細胞活性，進行回歸分析，製作細胞存活力/劑量回歸曲線；3)根據細胞存活力/劑量回歸曲線，以55～95％致死率的相應劑量為誘變注入劑量，在無菌條件下進行離子注入處理；4)誘變後的孢子立即用生理鹽水洗脫，並稀釋至一定濃度；3、篩選方法1)篩選對誘變的芽孢桿菌接種於NBRIY篩選培養基上，25～30℃培養48～72h，有機磷降解菌將有機磷降解產生不透明圈或透明圈，因此根據不透明圈或透明圈的有無和大小就可確定菌株分解有機磷的能力。選擇不透明圈或透明圈較大的菌落作為目標菌株。
NBRIY培養基配方為葡萄糖10.0～20.0g；卵磷脂或植酸磷2.0～5.0g或有機磷農藥100～1000mg；(NH4)2SO40.5～2.0g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；KCl 0.2～0.3g；NaCl 0.2～0.3g；MnSO4·7H2O 0.003～0.005g；FeSO4·7H2O0.003～0.005g；CaCO32.0～5.0g；瓊脂18.0～20.0g；蒸餾水1000mL；pH7.0～7.5。
2)復篩芽孢桿菌經上述NBRIY培養基上篩選後，將目標菌落轉接至NBRIP培養基上復篩，該培養基是經改良的無機磷和鉀分解菌的篩選培養基，其中溴酚藍或甲基紅作為酸鹼指示劑，指示菌落產酸能力，產酸菌株出現黃色暈圈。暈圈越大，產酸能力越強，分解難溶性無機磷和鉀的能力就越強。黃色暈圈較大的菌落為目標菌落。
NBRIP培養基配方為葡萄糖10.0～20.0g；磷礦粉2.0～5.0g；(NH4)2SO40.1～0.5g；MgCl2·6H2O 2.0～5.0g；MgSO4·7H2O 0.25～0.5g；瓊脂18.0～20.0g；溴酚藍或甲基紅0.002～0.010g；蒸餾水1000mLpH7.0～7.5；3、菌株鑑定1)磷分解能力測定 對以上篩選得到的目標菌落分別進行液體培養，培養96～120h後，分別測定游離磷、生物量磷和總磷含量，即可計算分離菌株分解有機磷或無機磷的能力。磷的檢測用鉬銻抗比色法。有機磷或無機磷的分解能力顯著增強的菌株為工程菌株。
2)遺傳穩定性鑑定對工程菌株在NBRIY固體培養基上連續轉接3～7代，對第3～7代菌株分別測定分解有機磷和無機磷的能力，在3～7代以內能夠保持優良性狀的菌株表明具有較好的遺傳穩定性，可作為生產菌株。
在無氮培養基上活化KNP414，28～30℃培養30～36h後，接種至無莢膜芽孢的液體培養基中，28～30℃、200～250轉/min培養48～56h，離心收集孢子，稀釋並塗布於無菌的空平皿上，自然乾燥0.5～1h；用能量為15～25KeV、劑量為60～200×1014ions/cm2的H+在真空(真空度為3×10-2～5×10-3pa)、無菌條件下間歇脈衝式注入；然後用生理鹽水洗脫孢子，在NBRIY培養基(含卵磷脂)上進行篩選，隨即在NBRIP培養基上復篩，經過鑑定，獲得2株高效分解無機鉀、無機磷和有機磷的工程菌株KNP41401和KNP41402。KNP41401分解無機鉀、無機磷和有機磷的能力分別提高15～20％、18～25％和20～40％，KNP41402分別提高18～20％、20～25％和25～45％。
權利要求
1.一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於它的步驟為1)在斜面上活化培養芽孢桿菌，所用培養基為牛肉膏蛋白腖培養基，活化後的芽孢桿菌，直接用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫成菌懸液；2)將菌懸液離心，收集孢子，用生理鹽水或磷酸緩衝液稀釋孢子並塗布於無菌的空白平皿或載玻片上，乾燥0.5～2h；3)將N+、H+、Ar+或He+離子束注入芽孢桿菌，所注入的離子能量為10～30KeV、劑量為5～300×1014ions/cm2，在2×10-2～6×10-3Pa真空、無菌條件下進行間歇脈衝式注入，每次脈衝間隔50～100秒；4)用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫經離子束注入處理過的孢子，並稀釋至一定濃度，在NBRIY培養基上進行篩選，然後經過鑑定，獲得高效分解有機磷的工程菌株。
2.根據權利要求1所述的一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於所說的離子束注入的前處理方法為首先用生理鹽水或磷酸緩衝液清洗孢子1～3次，離心，再用生理鹽水或磷酸緩衝液懸浮，並稀釋至103～106個·L-1，然後塗布於直徑為9cm的空白平板或載玻片上，在超淨臺上通風乾燥0.5～2h。
3.根據權利要求1所述的一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於所說的工程菌株的篩選方法步驟為1)製備篩選培養基，其配方為葡萄糖10～20g；卵磷脂或植酸磷2.0～5.0g或有機磷農藥100～1000mg；(NH4)2SO40.5～2.0g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；KCl 0.1～0.3g；NaCl 0.1～0.3g；MnSO4·7H2O 0.001～0.005g；FeSO4·7H2O0.001～0.005g；CaCO31.0～5.0g；瓊脂粉18～20g；蒸餾水1000mL；pH7.0～7.5。2)將經離子束注入處理過的孢子接種於篩選培養基上，25～30℃培養48～96h。出現不透明暈圈或透明圈並且圈較大的菌落為目標菌落。
4.根據權利要求1所述的一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於所說的鑑定方法的步驟為1)將篩選獲得的單菌落接種於NBRIY液體培養基中，25～30℃、150～250轉/min，培養96～120h，離心，分別測定游離磷、生物量磷和總磷含量，有機磷的降解能力增強5～15％或以上的菌株為工程菌株。2)對以上工程菌株在NBRIY固體培養基上連續轉接3～7代，對第3～7代菌株測定分解有機磷的能力，能夠保持較高的有機磷降解能力的菌株表明具有較好的遺傳穩定性，可作為生產菌株。
5.一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於它的步驟為1)在無氮培養基斜面上活化培養芽孢桿菌，活化後的細菌，接種於產無莢膜芽孢的液體培養基中，25～30℃、150～250轉/min培養36～72h，離心收集孢子；2)將孢子用生理鹽水或磷酸緩衝液稀釋並塗布於無菌的空白平皿或載玻片上，乾燥0.5～2h；3)將N+、H+、Ar+或He+離子束注入芽孢桿菌，所注入的離子能量為10～30KeV、劑量為5～300×1014ions/cm2，在2×10-2～6×10-3Pa真空、無菌條件下進行間歇脈衝式注入，每次脈衝間隔50～100秒；4)用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫孢子，並稀釋至一定濃度，在NBRIY培養基上經過篩選後，在NBRIP培養基上進行復篩，最後通過鑑定，獲得高效分解有機磷、無機磷和鉀的工程菌株。
6.根據權利要求5所述的一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於所說的無氮培養基和產無莢膜芽孢的液體培養基配方分別為無氮培養基矽酸鋁鉀1.2～2.0g；蔗糖5.0～10g；Na2HPO41.0～2.0g；FeCl30.003～0.005g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；瓊脂18～20g；蒸餾水1000ml；pH7.0～7.5。無莢膜芽孢的液體培養基澱粉10～20g；(NH4)2SO40.5～2.0g；MgSO4·7H2O0.3～1.0g；K2HPO40.5～20g；FeCl30.005～0.010g；瓊脂粉18～20g；水1000ml；pH7.0～7.5。
7.根據權利要求5所述的一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於所說的離子束注入的前處理方法為首先用生理鹽水或磷酸緩衝液清洗孢子1～3次，離心，再用生理鹽水或磷酸緩衝液懸浮，並稀釋至103～106個·L-1，然後塗布於直徑為9cm的空白平板或載玻片上，在超淨臺上通風乾燥0.5～2h。
8.根據權利要求5所述的一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於所說的工程菌株的篩選方法步驟為1)製備篩選培養基，其配方為葡萄糖10～20g；卵磷脂或植酸磷2.0～5.0g或有機磷農藥100～1000mg；(NH4)28O40.5～2.0g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；KCl 0.1～0.3g；NaCl 0.1～0.3g；MnSO4·7H2O 0.001～0.005g；FeSO4·7H2O0.001～0.005g；CaCO31.0～5.0g；瓊脂粉18～20g；蒸餾水1000mL；pH7.0～7.5。2)將經過離子束注入處理過的孢子接種於篩選培養基上，25～30℃培養48～96h。出現不透明暈圈或透明圈並且圈較大的菌落為目標菌落。
9.根據權利要求5所述的一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於所說的復篩方法的步驟為1)製備復篩培養基，其配方為葡萄糖10～20g；鉀礦粉、磷礦粉或Ca3(PO4)22.0～5.0g；(NH4)2SO40.1～1.0g；MgCl2·6H2O 2.0～5.0g；MgSO4·7H2O0.25～0.5g；瓊脂粉18～20.0g；溴酚藍或甲基紅指示劑0.002～0.005g·L-1；蒸餾水1000mLpH7.0～7.5。2)將以上篩選培養基篩選獲得的菌落接種於復篩培養基上，28～30℃培養48～96h。出現黃色暈圈並且暈圈較大的菌落為目標菌落。
10.根據權利要求5所述的一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法，其特徵在於所說的鑑定方法的步驟為1)將復篩獲得的單菌落接種於NBRIY液體培養基中，25～30℃、150～250轉/min，培養96～120h，離心，分別測定游離磷、生物量磷和總磷含量，有機磷的降解能力增強5～15％或以上的菌株為工程菌株。2)將以上鑑定獲得的菌株接種於NBRIP液體培養基中，25～30℃、150～250轉/min培養96～120h，離心，分別檢測分解無機磷和鉀的能力，無機磷和鉀的分解能力較出發菌株分別增加5～15％或以上的菌株為工程菌株。3)對以上工程菌株分別在NBRIP和NBRIY固體培養基上連續轉接3～7代，對第3～7代菌株分別測定分解無機鉀、無機磷和有機磷的能力，能夠保持較高的無機磷、無機鉀和有機磷分解能力的菌株表明具有較好的遺傳穩定性，可作為生產菌株。
全文摘要
本發明公開了一種芽孢桿菌解磷工程菌株的構建方法。構建芽孢桿菌解磷工程菌株的方法的步驟為1)在斜面上活化培養芽孢桿菌，所用培養基為牛肉膏蛋白腖培養基，活化後的細菌，直接用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫成菌懸液；2)將菌懸液離心，收集孢子，用生理鹽水或磷酸緩衝液將孢子稀釋並塗布於無菌的空白平皿或載玻片上，乾燥；3)在真空、無菌條件下將離子束注入芽孢桿菌；4)用生理鹽水或磷酸緩衝液洗脫孢子，獲得高效分解有機磷的工程菌株。本發明應用誘變效率高、突變幅度大的新型誘變技術——離子束注入構建工程菌，增強芽孢桿菌分解有機磷和無機磷的能力，實現土壤自淨和營養自給的雙重功能。
文檔編號C12N13/00GK1410528SQ02145369
公開日2003年4月16日 申請日期2002年11月21日 優先權日2002年11月21日
發明者陳集雙, 胡秀芳, 唐愛菊, 唐駿, 陳益錦 申請人:浙江大學