使用磁性產生的機械壓力進行組織培養的製作方法

2023-08-02 02:36:46

專利名稱：使用磁性產生的機械壓力進行組織培養的製作方法
技術領域：
本發明涉及培養細胞的方法，更具體涉及(但並不局限於)培養細胞生成人類或動物組織替代物的方法。本發明甚至更具體涉及，但並不局限於，機械應答組織的培養方法。
體外培養人類和動物的替代組織是一個重要的發展，該技術是使取自患者的細胞生長為組織，因而該替代組織不會引起排斥問題。可用於替代治療的替代組織的實例包括結締組織、骨、軟骨、肌腱、胰腺。
替代組織不一定僅限於由同一類型的細胞組成，因為該組織除要實現替代外還必須具有符合要求的、儘可能複雜的三維形狀。這樣，替代組織通常生長在形狀合適的支架上或內部，該支架浸沒在生物反應器的培養基質中。支架是細胞生長的支撐，其提供了使組織生長為所需的三維形狀。培養基質在生物反應器內流動(通常恆定)，保證了在支架上或內部的組織生成細胞持續得到營養的供應，並且細胞的代謝廢物被清除。和靜態的培養瓶相比，生物反應器中的培養基質的量的增加，使得適合許多不同組織生長的各種不同大小範圍的支架可以浸沒在培養基質中。培養基質充滿了支架，使得支架結構內的所有細胞得益於生存和生長的良好環境。
此外，尤其是在對機械力反應的組織中，在培養成為具有全功能組織的過程中，很有必要使組織生成細胞經受機械壓力。這樣，比如，一些結締組織如骨、軟骨、韌帶和肌腱，應該在培養過程中經受機械壓力，以獲得所需的機械性能。
所需壓力的大小根據所用細胞類型和所需組織類型而變化，產生這些壓力的各種方式是本領域中已知的，包括對細胞的直接機械刺激和水力加壓系統。所述前一方法用滾筒或類似物壓迫細胞，而後一方法在培養基質中增加脈衝壓力，給生物反應器中的細胞提供機械刺激。但是，以機械方式刺激細胞產生功能組織的已知方法還沒有一種可令人十分滿意地用於多種類型組織，如骨、肌腱和韌帶等。直接的機械刺激方法很麻煩，給細胞培養所需的無菌條件造成了困難。水力壓縮方法通常無效。而且，所有以前的方法都有一個缺點，即在任一時刻，施加在所有培養細胞上的壓力大小只有一種，(通常比細胞水平所需的壓力要大得多)，而且細胞生長所用的支架自身必須有相當大的機械抵抗力來承受施加在其上的壓力。
所以本發明的一個目標是消除或減小上述的缺點。
按照本發明的一個方面，本發明提供了一種組織培養的方法，該方法包括組織生成細胞生長的同時，向該細胞施加由磁性產生的機械壓力。
這樣按照本發明，磁性產生的壓力被施加到組織生成細胞上，以保證生產出全功能的組織。
本發明的方法可以用於體外培養患者移植用組織。
如果在體外實施，最好將組織生成細胞在三維支架上或其內部培養，較優選的方式是培養在有組織培養基流動穿過的生物反應器中。其它類型的組織培養容器也可以應用。本發明的方法也可用於在患者體內進行原位新生組織的培養。
所述壓力可由磁性材料產生，磁性材料響應施加在生物反應器中的磁場產生力，並將該力傳遞給培養中的組織生成細胞，從而給該細胞施加了所需的壓力。在本發明的優選的實施例中，磁性材料以微米級或納米級的微粒附著在組織生成細胞上，較優選的為磁性材料包被的微米或納米級微粒。另一種選擇是，磁性材料可以是摻入培養基中的鐵磁流體。另外還可聯合使用鐵磁流體和附著在細胞上的磁性材料。
不考慮使用的特定磁性材料，通過隨時間變化的磁性梯度或均一的磁場來調節磁性材料的運動，從而給組織生成細胞重複地施加壓力。所述壓力可以在強度和施加方向兩方面精確變動，從而可使組織生成細胞能接受到所需的壓力，確保生成全功能組織。這些可通過改變同一支架不同區域(或不同的支架)的不同細胞上附著的微粒的磁性來實現，或通過在梯度磁場中應用磁場強度的空間變化來實現。
磁場可以在某一個頻率範圍內變化，比如0.1-10赫茲，但是，也可使用該範圍以外的頻率。常用的磁場通量密度範圍為(但不限於)10mT到1400mT。
施加在細胞上的壓力的大小範圍為(但不限於)0.1到100皮牛(piconewtonpN)，所施加壓力的方向可由磁性材料在施加的磁場中的直線遷移(linear transitional motion)(由於有梯度，所以微粒無需磁阻隔(magnetically blocked))，或者旋轉運動(由於微粒的磁化載體和磁場的夾角，因而必須是磁阻隔微粒)決定。
本發明的顯著的進步是(如所示)容易控制施加壓力的大小和方向，同時保持體外無菌條件，例如在生物反應器中或體內，這一現象的原因是磁場變化可以遙控。而且，細胞水平產生的壓力通常很小，(例如，幾個皮牛)[3]，如此，任何支架(組織生成細胞在其上或內生長)不需要強化的機械性能。
本發明的方法可以用來在生物反應器中和體內生產各種類型的組織，在體內則需要機械施壓(mechanical loading)或活化對機械力敏感的離子通道。這包括(但不限於)結締組織比如骨、軟骨、韌帶和肌腱。待培養的細胞的活組織檢查可以通過標準程序進行[4]。
本發明的方法也可用於由至少兩種不同類型組織構成的組織構件，例如骨和軟骨。也可用間葉細胞樣的幹細胞作為來源，這些幹細胞在支架上或內部原位分化為軟骨細胞或骨細胞。
如上所述，本發明的優選實施方案包括將微米或納米級的磁性微粒附著在組織生成細胞上，目的是施加所需的壓力。可以先將微米和納米級的磁性顆粒功能化並附著於組織生成細胞上，然後將該組織生成細胞種植在供組織生長於其上或其中的支架上。這樣，例如，微米和納米級的顆粒可以以粘連分子包被，比如纖連蛋白分子和RGD分子用於附加在細胞上。
微米和納米級的微粒(打算附加在細胞上)是球形或橢圓形的，直徑在10nm到10um範圍內。
附加到細胞上的微粒可以包被或不包被，有一個或多個磁疇，合適的微粒包括但不限於(i)包被的磁性微球(d＝4cm)從Spherotech公司獲得。這些微球體由磁性被封閉的核心和包被其的聚合物組成。(ii)單磁疇，塗抹有鐵酸鹽的二氧化矽納米顆粒，大小可調(d＝50-300nm)，並且大小分布範圍窄[5]。
但是，磁性材料並不一定要微粒狀，而且也不一定要附著在細胞上。例如，對於生物反應器或體內有充足培養基時，可以讓培養基中包含鐵磁流，該鐵磁流在梯度磁場的作用下產生的力作用於所培養的細胞。鐵磁流體可以是，例如，PVA/磁鐵礦納米顆粒級的鐵磁流體(d＝4-10nm)[6]。也可將附著在細胞上的微粒和鐵磁流體聯合使用。
生物反應器可以是，例如，現有生物反應器的改進，例如profusion，旋轉瓶(spinner flask)，水力加壓和旋轉容器系統。
為方便起見，讓磁場產生在組織培養容器的外部(如果所述方法是在體外應用)，或者當該方法在體內應用時，讓磁場產生在體外。磁場可由永久磁鐵或電磁鐵產生。為了產生可變化的磁場，永久磁鐵可相對於培養的細胞移動。因此，在生物反應器中，所述運動可以，例如，沿著反應器的縱軸進行，朝向和遠離反應器或圍繞反應器運動。這些運動也可結合使用。和永久磁鐵方式相同，在電磁鐵中，給電磁鐵提供合適水平的電流並有選擇的和電磁鐵的運動結合可以產生變化的磁場。
可以使用並可購買到的磁鐵的實例包括釹-鐵-硼和釤-鈷永久磁鐵，它們能夠產生所需的磁場梯度和磁通量密度。它們可以幾何學上製作，並磁化成為所需的規格，並在表面產生的磁通量密度高於1T(10,000高斯)。可用的電磁鐵的實例包括冷凍、超導的磁性線圈，該線圈可以產生幾個特斯拉的磁場。
施加在細胞上的磁力通常從0.1到10pN(如前所述)，這樣的力量可以打開跨膜離子通道。產生所需磁力的磁場及磁場梯度的變化隨微粒磁性、體積和形狀特性以及組織構件和磁鐵間的距離的不同而變化。這些參數符合如下的公式Fmag=(x2-x1)V10B(B)]]>當x2是磁性微粒的體積磁化率，x1是周圍基質(例如，組織/骨)的體積磁化率，μ0是自由空間的磁透性。B是磁通量密度，單位為特斯拉(T)。雖然這些呈球形的微粒沒有磁偶極相互作用，但應當接近所需的磁場和磁場梯度。
因為和磁鐵礦(或其他應用在鐵磁流體中的磁性材料，納米顆粒)的磁化率相比，人類組織的x1的值非常小而且是負的，x1在計算時可以忽略，(x2-x1)的表示可以簡化為x2，而且，我們對磁鐵礦顆粒/鐵磁流體/材料在施加的磁場中沿著Z軸(豎直)的直線運動感興趣，假定相對的磁透性為1，磁力的表達可以簡化為Fmag=(x2)VBdBdZ]]>對靠近磁場源的顆粒來說。
從公式中可以看到，鐵磁流體和磁性顆粒給組織構造帶來的壓縮力(線性的)依賴於磁場強度、磁場梯度、顆粒的體積性質和磁性性質。
這些參數其中之一具有很強的空間變化，是磁場強度和梯度的產物。這為在三維方向施加有差異的磁力提供了可能。此外，可以通過在支架的不同區域種植具有不同磁性及體積特性的魏麗、鐵磁流體和磁性材料，來加強所施加力的三維變化。通過施加在生物反應器內的磁力的空間差異，促進了複雜組織結構的生長。
多種不同類型的支架(三維的多孔的塊狀，各方向都可變化)都可使用。本發明的優點是由於支架所受的壓力很小，所以不需要強化的機械性能。例如可以應用一個生物可降解的、多孔的PLA支架。另一種可選擇的支架包括可迅速降解的、機械強度不強的PGA(多聚乙醇酸)材料支架，和天然材料膠原支架[7]。支架外可以包裹I型膠原或其他粘連分子(例如RGD或非RGD的分子)提高細胞的黏著力。
通過實施例結合附圖對本發明做出說明，其中

圖1說明了本發明的第一個實施例圖2說明了本發明的第二個實施例圖3說明了使用磁場後，對機械力敏感的跨膜離子通道的活動。
圖1圖示的是一個管狀的生物反應器1，其連接一永久磁鐵2，永久磁鐵2置於反應器外，並安裝在載體3(carrier arrangement)上，載體3和計算機控制(或其他隨時間改變的)的驅動系統相連，此系統在圖中沒有詳細顯示。
在生物反應器1內，是大量在縱軸上分布的組織構件4，每一構件都圖示為包括一端(遠離磁鐵3的一端)的骨組織和另一端的軟骨組織(其他組織類型也可使用)。組織中的細胞其上附著有磁珠(圖中未標示)，且細胞被種植在三維支架上(也沒有標示)。箭頭5描述了給生物反應器提供營養物，箭頭6描述了營養物流出反應器。
反應器外部共有4個磁鐵2(為了與組織構件數量匹配，此數量可以變化)，沿著縱軸放置。磁鐵的位置是這樣，磁鐵與組織構件一一對應，且在軟骨的一側。
在使用裝置時，載體被驅動，其目的是振蕩磁鐵，使之橫向接近和遠離反應器。磁鐵被驅動的振蕩頻率通常會變化，並在0.1-10赫茲的範圍內，雖然也可以應用超出此範圍的值。
磁鐵的振蕩引發了施加到組織構造的壓縮和放鬆循環，也可通過附加在磁鐵上的機械驅動(圖上沒有標示)改變振蕩頻率。磁場梯度(空間變化的磁場強度)保證了軟骨承受的磁通量密度比骨細胞稍微高些。
強的磁場梯度將導致納米顆粒朝向磁鐵進行平移直線運動，壓縮生物反應器中的細胞和支架，這種壓縮不需要與生物反應器中的細胞直接接觸即可刺激機械施壓。改變磁場強度和梯度、磁鐵位置和/或壓縮組織構件納米顆粒的物理性質就可以很容易地改變載荷。
如果需要，和骨細胞相連的磁性顆粒可以與軟骨相連的磁性顆粒具有不同的磁性性質，以便可在兩種不同類型的細胞上施加不同的機械壓力。
圖2圖示說明了改進的圖1中所示的儀器。在圖2中，永久磁鐵沿著生物反應器的縱軸平行振蕩(而不是圖1中所示的橫向振蕩)。
圖示的實施例可以做出許多改變。
例如，磁鐵可以相對於生物反應器環繞運動，達到此目的的最簡便的但並不是必需的辦法就是磁鐵固定，生物反應器圍繞其縱軸旋轉。
此外，圖1和圖2中永久磁鐵可以被電磁鐵替代。附著在細胞上的納米顆粒進一步可以被鐵磁流體替代。如果需要，納米顆粒和鐵磁流體可以聯合使用。
為了使整個支架變形，可以進一步運用能夠吸引到磁鐵上的磁性/金屬板或其他結構。
給出的圖3是為了說明另一種活化機械力敏感的跨膜離子通道的方法，該方法使用磁場引發組織構件的周期性機械荷載。
更具體地，圖3顯示細胞10具有細胞膜11，細胞膜11靠近細胞質12，在細胞膜11內是一個對機械力敏感的離子通道13。功能化的磁阻隔的顆粒14(比如Sphereotech公司的包被的鐵磁體顆粒d＝4.5um)直接或間接通過細胞骨架偶聯固定在細胞膜11上。
在圖3顯示的情況下，細胞10上沒有施加磁場，離子通道是關閉的。
通過振蕩磁場源(沒有標示)，附著到細胞10上的磁性微粒14能夠被扭動，給細胞膜11施加機械壓力，從而活化了對機械敏感的通道13(圖3b)。該離子通道的活化啟動了培養細胞中的生物化學反應途徑，而且引發了生物反應器內的組織構件的周期性機械荷載。
參考文獻1.Ying，Y.，Peak，M.，Magnay，J.，and El Haj，A.J.(2000)Dynamic cellscaffold interactionsimplications for tissue engineering.Proceedings of thesecond Smith and Nephew international symposium on tissue engineering，York，UK.2.El Haj，AJ，LM Walker，MR Preston，SJ Publicover(1999)Mechanotransduction pathways in bonecalcium fluxes and the role ofvoltage-operated calcium channels.Med.Biol.ENG.COMP.，37403-409.3.Howard J and AJ Hudspeth(1989)Compliance of the hair bundleassociated with the gating of mechanoelectrical transduction channels in thebullfrog′s saccular hair cell.Neuron 1189-199.4.Walker et al J Cell Biochem 2000.5.Pardoe，H，W Chua-anusom，TG St.Pierre，J Dobson(2000)Structuraland magnetic properties of nanoscale magnetic particles synthesised bycoprecipitation of iron oxide in the presence of dextran or polyvinyl alcohol.J.Magn.Mag.Materials.In Press.6.Tan，W，S Santra，Z Peng，R Tapec and J Dobson(2000)Coatednanoparticles.US Patent Pending(Filed May 17，2000).7.Sittinger et al 1996.8.Kirschvink，JL(1992)Comments on「Constraints on biological effects ofweak extremely-low-frequency electromagnetic fields」.Phys.Rev.A.462178-2184.9.Dobson，J and TG St.Pierre(1996)Application of the FerromagneticTransduction Model to D.C.and Pulsed Magnetic FieldsEffects onEpileptogenic Tissue and Implications for Cellular Phone Safety.Biochem.Biophys.Res.Commun.，227718-723.
權利要求
1.一種組織培養方法，該方法包括在培養組織生成細胞的同時，向所述組織生成細胞施加機械壓力，其特徵在於所述機械壓力是由磁性產生。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述壓力由磁性材料產生，所述磁性材料響應所施加的磁場產生力並將所述的力傳遞給所述組織生成細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述磁性材料附著在所述組織生成細胞上。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述磁性材料包括微米或納米級顆粒。
5.根據權利要求2到4中任何一個權利要求所述的方法，其中所述磁性材料包括鐵磁流體。
6.根據權利要求1到5中任何一個權利要求所述的方法，其中在培養所述組織生成細胞過程中，所述磁場是變化的。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述磁場以正弦曲線變化。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中所述磁場變化的頻率範圍為0.1到10赫茲。
9.根據權利要求1到8中任何一個權利要求所述的方法，其中所述的方法在體外應用。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述組織生成細胞在三維支架上或內部生長。
11.根據權利要求9或10所述的方法，其中所述組織生成細胞培養在有組織培養基流動穿過的生物反應器中。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述磁場是從所述生物反應器外部施加的。
13.根據權利要求1到8任何一個所述的方法，其中所述的方法在體內進行。
14.根據權利要求1到13中任何一個所述的方法，其中所述被培養的細胞用來形成粘連組織。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述被培養的細胞用來形成骨、軟骨、韌帶和肌腱。
16.根據權利要求1到15任何一個權利要求所述的方法，其中所述被培養的細胞為兩種或更多種類型不同的細胞。
17.根據權利要求16所述的方法，其中在不同類型的細胞上施加不同的壓力。
18.根據權利要求16或17所述的方法，其中所述被培養的細胞包括成骨細胞和成軟骨細胞。
19.根據權利要求1-18任何一個權利要求所述的方法，其中施加給所述細胞或支架的力在0.01到100皮牛。
20.一種具有培養基入口和出口的生物反應器，該生物反應器提供在所述生物反應器中產生變化磁場的裝置。
21.根據權利要求20所述的生物反應器，其中所述的在生物反應器中產生變化磁場的裝置包括電磁鐵。
22.權利要求21所述的生物反應器，其中所述的在生物反應器中產生變化磁場的裝置包括至少一個永久磁鐵，所述永久磁鐵可相對所述生物反應器移動。
全文摘要
一種組織培養的方法，包括培養組織生成細胞，同時使組織生成細胞經受磁性產生的機械壓力。
文檔編號C12N5/06GK1483075SQ01821270
公開日2004年3月17日 申請日期2001年12月19日 優先權日2000年12月22日
發明者艾麗西亞·詹尼弗·哈菲茲·艾爾－哈吉, 喬恩·保羅·多布森, 保羅 多布森, 艾麗西亞 詹尼弗 哈菲茲 艾爾-哈吉 申請人:基爾大學