Trpv3通道蛋白在篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物中的應用的製作方法

2023-08-02 07:39:11

專利名稱：Trpv3通道蛋白在篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及TRPV3通道蛋白的新用途，特別涉及TRPV3通道蛋白在篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物中的應用，本發明還公開了一種篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物的方法，使用本發明的方法篩選得到的TRPV3通道的激動開放劑或抑制劑能夠用於護膚產品或皮膚相關疾病的治療藥物的研發。
背景技術：
瞬時感受器電位(transient receptor potential, TRP)通道是一類在外周和中樞神經系統分布很廣泛的陽離子通道蛋白。與經典的由膜電位改變激活或配體(如神經遞質等)激活的離子通道不同，TRP通道的激活受到許多種因素的調節，包括滲透壓、pH值、機械力，以及一些內、外源性配體和細胞內信號分子[1]，參與生物體內感覺信息傳遞如視覺、 溫度覺、痛覺和觸覺等、調節胞內Ca2+平衡等多種重要的生理功能。根據同源性的不同，哺乳動物的TRP離子通道超家族可分為七個亞族，包括TRPA (ANKTM1)、TRPC (TRPCI-7)、TRPM (TRPMI-8)、TRPML (mucolipin)、TRPN (N0MPC)、TRPP (polycystin)和TRPV (TRPV1-6)，每個亞族中大多包含3-8個成員。TRP通道具有六次跨膜的a螺旋結構域，N端和C端區域均在胞內，並且具有與電壓門控鉀離子通道(voltage-gated K+channels, Kv)和環核苷酸門控通道(cyclic nucleotide-gated ionchannels, CNG)相似的胞內長度和胞外環，由第五和第六跨膜結構域共同構成通道孔區。TRPV亞家族包括TRPV1-6六個基因，根據系統發生以及這幾個基因產物的功能和生物物理特性也可以將它們分為兩個亞組TRPV1、TRPV2、TRPV3和TRPV4通道是非選擇性陽離子通道，能夠被不同溫度激活並具有明確的臨界溫度感受閾值W_18]，因而被稱為「熱敏感」(thermosensitive)通道；而TRPV5和TRPV6則是Ca2+選擇性通道，對溫度不敏感。溫度敏感的TRPV家族成員廣泛分布於神經與非神經組織中，其中TRPV3通道主要表達在皮膚組織中。在小鼠的模型上，帶有功能增強的TRPV3突變的老鼠表現出強烈的皮膚炎症和毛髮脫落症狀，而在TRPV3敲除的老鼠表現出捲曲的毛和鬍鬚。近期我們發現在人類身上功能增強的TRPV3突變會導致一種罕見的遺傳性皮膚病一Olmsted Syndrome，表現為手足進行性損毀，禿頭症和嚴重的瘙癢。因此，TRPV3在皮膚中發揮著重要的生理和病生理功能。皮膚是抵禦外界微生物，汙染物以及紫外線等不良因素的第一道防線。在正常的生理條件下，皮膚表面的PH值為弱酸性，在5. 5左右。pH值的維持對於皮膚角質層的屏障和抵抗病菌感染有重要影響。果酸，又叫羥基酸，是從水果中提取的有機酸，包括葡萄酸，蘋果酸，甘醇酸和乳酸等，他們在酸性PH下外用於皮膚可以有效降低角質層細胞的凝結作用，去除皮膚的老化細胞，促進新城代謝，因此在臨床和化妝品市場有廣泛的應用。這裡我們報告在皮膚的生理PH值5. 5的條件下，使用果酸足以產生細胞內的酸化從而最大的激活皮膚細胞TRPV3通道，TRPV3是一個鈣離子通透的離子通道，他的開放容許大量的細胞外鈣離子進入胞內，進而引起鈣超載和細胞的凋亡。因此TRPV3通道是一個重要的皮膚藥物的靶點。修飾TRPV3通道的功能篩選化合物可以用於治療皮膚搔癢症、相關皮膚瘙癢疾病、脫毛髮疾病和皮膚角化病。

發明內容
本發明通過研究發現弱酸透過皮膚細胞導致的細胞內氫離子濃度升高可以激活皮膚細胞的TRPV3離子通道蛋白的表達。細胞內酸激活TRPV3通道蛋白可以加速皮膚細胞死亡和角質化形成。於是，本發明構建了表達TRPV3通道蛋白的細胞系，採用酸激活表達TRPV3通道蛋白，使TRPV3通道蛋白處於活化狀態，進而使用化學試劑或化合物作用於表達TRPV3通道蛋白的細胞系，通過對作用後的細胞的理化性質進行檢測，從而篩選出TRPV3通道蛋白的激動開放劑或抑制劑，進一步的將該篩選得到的化合物用於護膚產品或皮膚相關疾病的藥物的研發。
本發明的目的之一在於提供TRPV3通道蛋白在篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物中的應用。在本發明中，優選的，所述的TRPV3通道蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。本發明的目的之二在於提供了一種篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物的方法。本發明的一種篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物的方法，其特徵在於包括以下步驟(I)構建表達TRPV3通道蛋白的真核細胞系；(2)對步驟(I)得到的細胞系進行培養；(3)採用酸處理步驟(2)得到的細胞系，從而激活TRPV3通道蛋白的表達；(4)採用不同種化合物對含有激活後的TRPV3通道蛋白的細胞進行處理；(5)對處理後的細胞的理化性質進行檢測，從而篩選出TRPV3通道蛋白的激動開放劑或抑制劑。在本發明中，優選的，所述的TRPV3通道蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。在本發明中，優選的，步驟(I)中所述的細胞系包括人胚胎腎細胞系(HEK-293)以及HaCaT皮膚細胞系。在本發明中，優選的，步驟(2)中所述的細胞培養是將細胞鋪於12_的圓形蓋玻片上，採用24孔板進行培養。在本發明中，優選的，步驟(3)中所述的酸為果酸，pH值為5. 5。優選的，所述的果酸包括葡萄酸，蘋果酸，甘醇酸和乳酸。更優選的，所述的果酸為甘醇酸。在本發明的一個具體實施例中，採用IOOmM甘醇酸在pH 5. 5條件下持續作用細胞200秒，激活HEK293細胞中TRPV3通道蛋白的表達。在本發明中，優選的，步驟(5)中所述的對處理後的細胞的理化性質進行檢測包括採用膜片鉗技術進行檢測及/或採用鈣螢光成像系統進行檢測。本發明通過將表達TRPV3通道蛋白的基因構建真核表達載體轉染真核細胞，進而誘導表達出有活性的TRPV3通道蛋白，進一步研究發現該通道蛋白能夠被酸激活表達，激活後的TRPV3通道蛋白對抑制劑及激動劑更為敏感，當採用化合物對細胞進行處理時，化合物便以激活或抑制的方式作用於TRPV3通道蛋白，通過對處理後的細胞的理化性質進行檢測，從而篩選出能夠用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物。本發明的一種篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物的方法，其操作簡單，快捷，篩選實驗是在微量篩選系統中完成的，樣品用量一般在微克級(Ug)，節省了樣品資源，同時節省了實驗材料，降低了單藥篩選成本；採用本發明的方法能夠提高藥物篩選的效率和結果的準確性，能夠實現藥物的高通量的篩選。


圖IA為IOOmM甘醇酸在pH 5. 5條件下激活HEK293中TRPV3通道蛋白表達的電流圖；圖IB為IOOmM甘醇酸在pH 5. 5條件下激活HaCaT皮膚細胞系中TRPV3通道蛋白表達的電流圖；圖2A為甘醇酸通過改變細胞內側氫離子濃度激活TRPV3通道蛋白表達的電流圖；圖2B為氫離子激活TRPV3通道蛋白表達的量效曲線；圖2C為直接改變細胞外的氫離子對於TRPV3有抑制作用；圖3A為在HEK293細胞系上採用不同的處理後的細胞生長情況；圖3B為在HaCaT皮膚細胞系上採用不同的處理後的細胞生長情況。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例I構建表達TRPV3通道蛋白的真核細胞系按照Ensembl網站公布的TRPV3基因序列合成引物，TRPV3 cDNA (cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。)來自北大醫院楊勇醫生，在上遊起始密碼之前加入Hind III酶切位點，下遊終止密碼之後加入BamH I酶切位點，設計的上下遊引物為上遊引物為5 』 CCC AAGCTTATGAAAGCCCACCCCAAGGAG 3 』下遊引物為5』 CGCGGATCCCTACACCGAGGITTCCGGGAA 3』利用PCR擴增TRPV3目的基因，利用Hind III和BamH I雙酶切後，連接進入pcDNA3. I質粒(購買於Invitrogen公司)作為TRPV3的表達載體，轉染進入HEK293細胞系。HEK293細胞由UC Davis鄭劫教授贈予。利用G418篩選出表達TRPV3的陽性單克隆，擴增後進行功能驗證，然後利用蛋白印跡技術證明蛋白的有效表達，利用電生理技術證明蛋白功能。選擇能夠有效的進行蛋白表達和功能的單克隆細胞為構建成功的表達TRPV3通道蛋白的真核細胞系。實施例2藥物的篩選I、細胞培養將實施例I製備得到的轉染了 TRPV3通道蛋白基因的HEK293細胞培養於含有10%胎牛血清，100U/ml青黴素和鏈黴素的DMEM培養液中，胰酶消化傳代。將細胞鋪於12mm的、圓形蓋玻片上，24孔板培養。2、酸激活TRPV3通道蛋白的表達將甘醇酸溶於pH 7. 4，含有130mM氯化鈉，3mM HEPES的鹽溶液中，使得甘醇酸的終濃度為IOOmM,調節pH為5. 5。利用蠕動泵將細胞培養液替換為上述的含有濃度為IOOmM甘醇酸的溶液，持續作用細胞200秒，激活HEK293細胞中TRPV3通道蛋白的表達。3、化合物對含有激活後的TRPV3通道蛋白的細胞進行處理；將預選化合物，例如蘋果酸、檸檬酸或其他果酸、經典的TRPV3激動劑，如2-APB等溶於pH 7.4，含有130禮氯化鈉，31111 HEPES的鹽溶液中，配製成測試細胞外液，分別利用蠕 動泵將含有濃度為IOOmM的甘醇酸溶液替換為上述的測試細胞外液，灌流細胞上作用200秒，以觀察作用後的細胞生長情況。蘋果酸、檸檬酸或其他果酸溶於pH 7. 4，含有130mM氯化鈉，3mM HEPES的鹽溶液中，使得蘋果酸、檸檬酸或其他果酸的終濃度為lOOmM，調節pH為5. 5 ;經典的TRPV3激動劑2-APB溶於pH 7. 4，含有130mM氯化鈉，3mM HEPES的鹽溶液中，使得2-APB的終濃度為300 ii M。4、對處理後的細胞的理化性質進行檢測，從而篩選出TRPV3通道蛋白的激動開放劑或抑制劑。(I)電生理膜片鉗測定膜片鉗技術記錄細胞膜電流膜片鉗放大器採用HEKA-EPC10。微電極拋光後，灌充電極內液，控制電阻值在2 4M Q。記錄HEK293細胞所用電極內外液為(mM) :NaCl 130，HEPES 5，EGTA0. 3，用NaOH調pH至7. 4。微電極與細胞膜形成巨阻封接後，鉗制在OmV等待5-10min後開始按照不同的刺激程序進行電流記錄。( 2 )鈣螢光成像檢測棄培養基，加入預熱的(37° ORingers液洗三遍；加入fluo-3儲存液，其終濃度為5iiM，同時加入助溶劑F-127，終濃度為0. 02% ；37° C孵箱閉關孵育30m_60m，避光；預熱的(37° ORingers洗去fluo-3染料，加入IOOiiL 37° C Ringers液平衡IOm ;檢測程序baseline 15 次掃描，15s 暫停，加 150nM capsaicin 或者 100 y M 2-APB (TRPV2, 3，4)，20次掃描，15s暫停，加入menthol, 20次掃描。5、根據以上測定結果篩選出TRPV3通道蛋白的激動開放劑或抑制劑測定結果發現採用含有IOOmM pH 5. 5的蘋果酸或檸檬酸的測試細胞外液、以及含有300 ii M的2-APB的測試細胞外液處理表達TRPV3通道蛋白的HEK293細胞和人源皮膚細胞HaCaT均能夠明顯激活TRPV3通道蛋白和增加細胞膜TRPV3電流(圖I所示)；採用鈣螢光成像檢測發現採用上述化合物處理後的J1EK293細胞內鈣離子濃度明顯升高，且細胞出現不同程度的細胞凋亡現象(圖3所示)。通過以上實施例證明，本發明的方法能夠用於篩選TRPV3通道蛋白的激動開放劑或抑制劑，從而為進一步研究皮膚病治療或皮膚護理的藥物提供基礎。試驗例I酸激活TRPV3通道蛋白的機制的研究I、不同pH值的甘醇酸對HEK293中TRPV3通道蛋白的影響用於培養HEK293細胞的正常細胞外液為130mM氯化鈉，3mM HEPES, pH 7. 4的鹽溶液。測試細胞外液含有IOOmM甘醇酸，130mM氯化鈉，3mM HEPES/MES，利用氫氧化鈉調節到目的PH值。在全細胞記錄形成後，利用蠕動泵將正常細胞外液替換為不同pH值的測試細胞外液，結果如圖IA所示，結果顯示pH 5. 5的含有IOOmM甘醇酸的測試細胞外液在作用於細胞後200秒的過程中能夠緩慢激活HEK293中TRPV3通道蛋白的電流圖而在中性溶液不可以。圖IB結果為含有IOOmM甘醇酸的測試細胞外液在pH 5. 5條件下在HaCaT皮膚細胞系上激活TRPV3通道蛋白的電流圖。圖2A為表明甘醇酸激活TRPV3的機理在於通過改變細胞內側氫離子濃度。在pH
5.5的時候可以達到TRPV3的最大開放狀態。圖2B為氫離子激活TRPV3的量效曲線。圖2C為表明直接改變細胞外的氫離子對於TRPV3有抑制作用。2、採用不同處理方式處理的HEK293細胞系及HaCaT皮膚細胞系後細胞的生長情況2. I採用不同處理方式處理的HEK293細胞系的生長情況 將HEK 293細胞培養於含有10%胎牛血清，100U/ml青黴素和鏈黴素的DMEM培養液中，胰酶消化傳代。傳代後的HEK 293細胞等份於7個培養皿中，給予相應的處理條件，第一組為轉染了螢光蛋白eYFP空載體的對照試驗，第二組為轉染了螢光蛋白eYFP空載體並給予pH
5.5的含有IOmM甘醇酸的測試細胞外液處理的細胞試驗，第三組為轉染了 TRPV3通道但給予正常培養的對照試驗，第四組為轉染了 TRPV3通道並給予含有pH 5. 5的IOmM甘醇酸的測試細胞外液處理的細胞試驗，第五組為轉染了 TRPV3通道並給予pH 7. 4的含有IOmM甘醇酸的測試細胞外液處理的細胞試驗，第六組為轉染了 TRPV3通道並給予pH 5. 5的含有IOmM甘醇酸的測試細胞外液，並加入非特異的TRP通道阻斷劑處理的細胞試驗，第七組為共轉染了 TRPV3通道和顯性負效應抑制TRPV3通道功能的TRPV3孔區突變(TRPV3-E631K/D641K)的突變體並給予pH 5. 5的含有IOmM甘醇酸的測試細胞外液處理的細胞試驗。在培養12小時後，取出棄掉培養液後，用PBS溶液洗3遍，室溫條件下利用Hoechest和PI雙染色。由於Hoechest可以染色所有細胞的核(藍色)而PI只可以與已經死亡的細胞的核相結合(紅色)，在顯微鏡下對培養皿不同視野下進行紅色標記的細胞核對藍色標記的細胞核進行計數統計來得到細胞的死亡百分比。結果發現，細胞外使用在pH 5. 5的環境下可以造成表達TRPV3的細胞大量死亡，同時這樣的死亡可以被TRP通道和顯性負效應的TRPV3突變體所挽救，結果如圖3A所示。2. 2採用不同處理方式處理的HaCaT皮膚細胞系的生長情況將培養HaCaT細胞等份的傳代於4個培養皿中，給予相應的處理條件，第一組為正常培養的對照細胞，第二組為給予PH 5. 5的含有IOmM甘醇酸的測試細胞外液處理的細胞試驗，第三組為pH 5. 5的含有IOmM甘醇酸的測試細胞外液，並加入非特異的TRP通道阻斷劑處理的細胞試驗，第四組為共轉染了 TRPV3通道和顯性負效應抑制TRPV3通道功能的TRPV3孔區突變(TRPV3-E631K/D641K)的突變體並給予pH 5. 5的含有IOmM甘醇酸的測試細胞外液處理的細胞試驗。利用同樣的Hoechest和PI雙染色統計細胞死亡的百分比。結果發現。在HaCaT皮膚細胞繫上，TRPV3參與了甘醇酸在pH 5. 5時引起的細胞死亡，結果如圖3B所示。因此，本發明得出果酸通過升高細胞內氫離子繼而激活TRPV3通道是引起皮膚細胞脫落的重要基礎 機制。
權利要求
1.TRPV3通道蛋白在篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特徵在於所述的TRPV3通道蛋白的cDNA序列如SEQIDNO. I所示。
3.一種篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物的方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)構建表達TRPV3通道蛋白的真核細胞系； (2)對步驟(I)得到的細胞系進行細胞培養； (3)採用酸處理步驟(2)得到的細胞系，從而激活TRPV3通道蛋白的表達； (4)採用不同種化合物對含有激活後的TRPV3通道蛋白的細胞進行處理； (5)對處理後的細胞的理化性質進行檢測，從而篩選出TRPV3通道蛋白的激動開放劑·或抑制劑。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(I)中所述的細胞系包括人胚胎腎細胞系(HEK-293)以及HaCaT皮膚細胞系。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的細胞培養是將細胞鋪於12mm的圓形蓋玻片上，採用24孔板進行培養。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中所述的酸為果酸，pH值為5.5。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的果酸包括葡萄酸，蘋果酸，甘醇酸和乳酸。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的果酸為甘醇酸。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，採用IOOmM甘醇酸在pH5. 5條件下持續作用細胞200秒，激活HEK293細胞中TRPV3通道蛋白的表達。
10.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(5)中所述的對處理後的細胞的理化性質進行檢測包括採用膜片鉗技術進行檢測及/或採用鈣螢光成像系統進行檢測。
全文摘要
本發明公開了TRPV3通道蛋白在篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物中的應用。本發明還公開了篩選用於皮膚病治療或皮膚護理的藥物的方法，研究發現弱酸透過皮膚細胞導致細胞內氫離子濃度升高可以激活皮膚細胞的TRPV3離子通道蛋白的功能。激活TRPV3通道蛋白的功能可以加速皮膚細胞死亡、脫落和角質化形成。本發明構建了表達TRPV3通道蛋白的細胞系，採用酸激活表達TRPV3通道蛋白，使TRPV3通道蛋白處於功能增強狀態，進而使用化學試劑或化合物作用於表達TRPV3通道蛋白的細胞，通過對作用後的細胞TRPV3通道功能的檢測，篩選出TRPV3的激動開放劑或抑制阻斷劑以用於研發護膚產品或治療皮膚相關疾病的藥物。
文檔編號C12Q1/02GK102747128SQ20121016461
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月24日 優先權日2012年5月24日
發明者曹旭, 王克威 申請人:北京海威磐石生物醫藥科技有限公司