線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒的製作方法

2023-08-02 07:39:01 1

專利名稱：線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒。
背景技術：
天門冬氨酸氨基轉移酶存在兩種同工酶，即線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶和細 胞漿天門冬氨酸氨基轉移酶。線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶和細胞漿天門冬氨酸氨基轉 移酶是1950被Hird和Rowsell發現並在1960年被Fleisher等用電泳確證的，實驗表明 在鹼性溶液中，線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶向陰極移動，而細胞漿天門冬氨酸氨基轉 移酶向陽極移動。 線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶和細胞漿天門冬氨酸氨基轉移酶廣泛存在於人體 各種組織細胞中，以肝、心細胞含量最為豐富。其中線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶存在 於線粒體內，而細胞漿天門冬氨酸氨基轉移酶則存在於細胞漿內，屬細胞內同工酶。細 胞作為一個整體，其中的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶含量佔80%，而細胞漿天門冬氨 酸氨基轉移酶含量只佔20 %。線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶和細胞漿天門冬氨酸氨基轉移酶這兩種同工酶都 是由兩條相同的多肽亞單位所組成，每個亞單位的相對分子量是46,000，整個酶的分子 量是92,000。這兩種同工酶在相應的基因組成上有差異，在胺基酸組成和免疫特性上不 同。在細胞輕度損害時，主要是細胞漿內的細胞漿天門冬氨酸氨基轉移酶透過細胞膜釋 放入血，而線粒體內的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶有兩層線粒體膜的保護，不易釋放 入血。線粒體內的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶濃度一般比血清中的濃度高數千倍， 當細胞炎症、壞死等使細胞嚴重損害時，線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶迅速釋放入血， 因此測定線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶作為判定肝臟、心臟的損害程度及預後的評價指 標，對疾病的診斷、治療、療效及護理有重要價值。線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶與CK、CK-MB及ALT相比，CK、CK-MB及
ALT均為細胞質酶，當缺血、缺氧使細胞通透性改變時，即可釋放入血，其增高不完全 說明細胞壞死損傷，而此時線粒體中的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶不釋放入血，故同 時測定細胞不同部位的酶可鑑別細胞損傷的程度。以線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶為細 胞壞死指示酶，對肝細胞壞死的診斷有重要應用價值。如急性肝炎時，肝細胞內的線粒 子體嚴重破壞，線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶升高。當肝細胞不再繼續破壞時迅速下 降，表示預後較好；反之，說明肝細胞仍繼續壞死，疾病可能趨向慢性化。再如線粒體 天門冬氨酸氨基轉移酶在乙醇性肝炎時明顯增高，說明該病為肝細胞壞死性損傷；線粒 體AST與總AST的比值有助於鑑別診斷酒精性肝炎與其他肝病。肝臟手術前測定血清線 粒體天門冬氨酸氨基轉移酶，對手術的成功及預後有重要意義，對肝臟手術術前指徵的 判定有重要應用價值。以線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶為細胞壞死指示酶，對急性心肌梗死的診斷也 具有重要應用價值。線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶活性峰與總CK、CK-MB或細胞漿天門冬氨酸氨基轉移酶的活性峰略相關，因此，可疑急性心肌梗死患者測定線粒體AST， 能提供這類患者通常測定的酶及同工酶所不能提供的新信息。在缺氧階段細胞膜通 透性 改變，CK酶和其他細胞漿酶就從細胞釋放了，即使此時尚無細胞壞死。這些酶釋放不 是細胞壞死的標誌。另一方面，CK和其他細胞漿酶反映心肌組織損害的面積，線粒體 AST的釋放更多地反映亞細胞壞死損傷的嚴重程度。心臟手術前測定血清線粒體天門冬 氨酸氨基轉移酶，對手術的成功及預後有重要意義，對心臟手術術前指徵的判定有重要 應用價值。目前，血清中線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶的測定主要有電泳、層析法以及免 疫學方法包括酶免、放免，免疫抑制法等。電泳、層析法測定時費時，難於自動化測 定，不能用於臨床大規模標本的應用。由於上述方法學的缺陷導致線粒體天門冬氨酸氨 基轉移酶的測試長期不能在臨床上的到廣泛開展，因而肝臟和心臟等臟器損傷的嚴重程 度缺乏直接的指標。

發明內容
本發明的目的是提供一種不受細胞漿天門冬氨酸氨基轉移酶的幹擾，結果準確 的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，以彌補上述缺陷。本發明的所提供的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，含有試劑1和試 劑2，所述試劑1含有天門冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、蘋果酸脫氫 酶、乳酸脫氫酶、防腐劑和PEG6000;所述試劑2含有NADH、防腐劑和EDTA · 2Na。所述試劑1中的天門冬氨酸蛋白酶、蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的酶活力比 為(0.1-50) (0.1-50) (0.1-10)，α -酮戊二酸與蘋果酸脫氫酶的比為(0.5-60) g (0.1-50) KU； α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、防腐劑和PEG6000的質量比為(0.5-6 0) (5-200) (0.2-10) (1-100)。所述試劑2中的NADH、 防腐劑和EDTA · 2Na的質量比為 (0.5-10) (0.2-10) (1-50)。試劑1中所述α -酮戊二酸和試劑2中所述NADH的質量比為 (0.5-60) (0.5-10)。所述防腐劑為PC300或NaN3。所述試劑1和2都為溶液，其溶劑也都為水。所述試劑1和所述試劑2還含有三羥甲基氨基甲烷和鹽酸。所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為(1-25) g/L，所述鹽酸的濃度為(1-20)ml/L。所述天門冬氨酸蛋白酶的濃度為0.1KU/L-50KU/L。本發明的線粒天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，不受高細胞漿天門冬氨酸氨 基轉移酶的幹擾，結果準確；可用全自動生化分析儀，亦可手工或半自動測定，適用於 大、中、小各層次醫院。
具體實施例方式實施例1線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶的測定使用本發明的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒測定線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶，該試劑盒包括試劑1和試劑2，並且試劑1和試劑2均為液體製劑，在測定 時試劑1和2結合使用。其中，試劑1的溶劑為水，其溶質如表1所示表1.試劑1中的溶質
三羥甲基氨基甲烷(Tris) lg/L HCllml/L
蘋果酸脫氫酶0.1KU/L
乳酸脫氫酶0.1KU/L
PC3000.2g/L
天門冬氨酸蛋白酶0.1KU/L
peg6oooijtl
α-酮戊二酸0.5g/L
L-天門冬氨酸5^/1試劑2的溶劑為水，溶質如表2所示表2.試劑2中的溶質
Trislg/L
HCllml/L~
NaN30.2g/L
NADH0.5g/L~
EDTA · 2Na lg/L待測樣品人的不溶血的血清或肝素抗凝血漿樣品7份，用免疫學方法測定7份 樣品的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶，結果如表3所示。表3.免疫學測定線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶的結果編號線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶(U/L) 1 5^2 ~2 L3 ~3 6^2 ~4 15A ~5 2Λ ~6 58^5兩步法測定線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶活性的方法如下設置空白管、標準管和測定管，按照表4所示的反應體系加入反應物表4.測定線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶的反應體系
加入物__空白管__測定管
蒸餾水__50ul__二_ 標準液__-__-_標本_50ul
試劑 1__400ul400ul
_混勻，37°C恆溫180-300秒_
試劑 2IOOulIOOul延遲時間60秒，然後用生化分析儀比色測定，測定時間180秒，主波長
340nm,副波長405nm，以空白管調零，測定各管ΔΑ/min。按照如下公式計算線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶的活性線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶的活性(U/L)=八人(測定管-空白管)/1^11*3376測定後的結果如表5所示。表5.實施例1的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒的測定結果
編號 八八(測定管-空白管)/1^11|線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶(1；/0 " 0.00165A
權利要求
1.一種線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，含有試劑1和試劑2，所述試劑1 含有天門冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、 防腐劑和PEG6000 ；所述試劑2含有NADH、防腐劑和EDTA · 2Na。
2.根據權利要求1所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，其特徵在 於所述試劑1中的天門冬氨酸蛋白酶、蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的酶活力比為 (0.1-50) (0.1-50) (0.1-10)，α -酮戊二酸的質量與蘋果酸脫氫酶的比為(0.5-60) g (0.1-50) KU； α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、防腐劑和PEG6000的質量比為(0.5-6 0) (5-200) (0.2-10) (1-100)。
3.根據權利要求1或2所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒， 其特徵在於所述試劑2中的NADH、防腐劑和EDTA · 2Na的質量比為 (0.5-10) (0.2-10) (1-50)。
4.根據權利要求3所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，其特徵在於 所述α-酮戊二酸和NADH的質量比為(0.5-60) (0.5-10)。
5.根據權利要求4所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，其特徵在於 所述防腐劑為PC300或NaN3。
6.根據權利要求5所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，其特徵在於 所述試劑1和2都為溶液，其溶劑也都為水。
7.根據權利要求6所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，其特徵在於 所述試劑1和試劑2進一步包括三羥甲基氨基甲烷和鹽酸。
8.根據權利要求7所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，其特徵在於 所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為l_25g/L，所述鹽酸的濃度為l-20ml/L。
9.根據權利要求8所述的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，其特徵在於 所述天門冬氨酸蛋白酶的濃度為0.1KU/L-50KU/L。
全文摘要
本發明公開了一種線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，含有試劑1和試劑2，所述試劑1含有天門冬氨酸蛋白酶、α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、防腐劑和PEG6000。所述試劑1中的天門冬氨酸蛋白酶、蘋果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的酶活力比為(0.1-50)∶(0.1-50)∶(0.1-10)，α-酮戊二酸與蘋果酸脫氫酶的比為(0.5-60)g∶(0.1-50)KU；α-酮戊二酸、L-天門冬氨酸、防腐劑和PEG6000的質量比為(0.5-60)∶(5-200)∶(0.2-10)∶(1-100)。所述試劑2中的NADH、防腐劑和EDTA·2Na的質量比為(0.5-10)∶(0.2-10)∶(1-50)。本發明的線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒測定線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶的活性，不受高細胞漿天門冬氨酸氨基轉移酶的幹擾，結果準確。
文檔編號C12Q1/52GK102010890SQ20091009243
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月8日 優先權日2009年9月8日
發明者徐士峰, 楊玉軍 申請人:北京迪邁醫學診斷技術有限公司