眼表潤滑的治療性補充和富集的製作方法

2023-08-01 18:08:26

專利名稱：眼表潤滑的治療性補充和富集的製作方法
技術領域：
本發明涉及眼部潤滑的處理(management)。具體地說，本發明涉及用於治療與角膜和結膜表面受損的(compromised)潤滑有關的疾病的藥物組合物及使用其的方法。
背景技術：
蛋白聚糖4(prg4)基因編碼稱作巨核細胞刺激因子(MSF)、潤滑素(Iubricin)和淺區蛋白(SZP)的高度糖基化的蛋白(1)。潤滑素最初是從滑液中分離出來的並且證實在軟骨-玻璃界面具有與滑液類似的體外潤滑能力( 。後來潤滑素被鑑定為滑液成纖維細胞的產物C3)並且Jay等人還表明其在膠乳-玻璃界面具有邊界潤滑能力(3 9)。隨後表明外顯子6編碼的940個胺基酸的大的粘蛋白樣(mucin like)結構域內0連接的β (1-3) fedGalNAc寡糖(10)部分介導(mediate)這種邊界潤滑能力(8)。SZP最初定位在來自淺區的外植體軟骨的表面處並從條件介質中分離出來(11)。SZP也被證實在軟骨-玻璃界面具有潤滑能力(1 。這些分子共同稱作PRG4。還表明PRG4存在於滑膜(58)、腱(1 及半月板(14)的表面。此外，已表明PRG4在生理和病理生理濃度下均有助於對接(apposing) 關節軟骨表面的邊界潤滑(59)。通過引起人的屈曲指-關節病-髖內翻-心包炎(CACP)疾病症候群的突變表明了 prg4的功能重要性。CACP通過屈曲指、非炎性關節病和肥厚性滑膜炎，與髖內翻畸形、心包炎和胸腔積液顯示(1 。而且，在無PRG4的小鼠中，觀察到軟骨退化和隨後的關節失效 (16)。因此，PRG4表達是健康滑液關節的必要組件。PRG4是粘蛋白家族的成員，粘蛋白家族通常大量存在於上皮層上並提供許多功能，包括潤滑和保護免受微生物的侵入(17)。粘蛋白的功能性質通常通過專門的糖基化模式和它們通過分子間二硫鍵形成多聚體的能力來確定(18)，而專門的糖基化模式和它們通過分子間二硫鍵形成多聚體的能力均在慢性病(例如囊性纖維化、哮喘)中改變(17)。從滑液分離的PRG4的生物化學表徵0、19)顯示在0-糖基化中的分子異質性，這似乎影響潤滑性質(8)。近來，已經表明來自牛滑液的PRG4除了單體形式之外還作為二硫鍵合的二聚體存在，如N端和C端兩者處保守的富含半胱氨酸的結構域以及C端未配對的半胱氨酸所表明的(20)。在組織例如滑液關節中，潤滑的物理化學模式已經被分為流體膜或邊界。實施潤滑的模式取決於關節組織上的法向力和切向力、這些表面之間切向運動的相對速率以及載荷和運動兩者的時間歷史。摩擦係數μ提供定量量度，並定義為切向摩擦力與法向力之比。一種類型的流體介導的潤滑模式是流體靜力性的。在開始加載時和通常長時間的持續期間，由於組織的雙相特性，軟骨內的間質液被加壓；液體也可能通過漏液機理(mopingmechanism)被迫進入關節面之間的凹凸部分。因此加壓的間質液和截留的潤滑劑池可明顯有助於承受法向載荷而對剪切力的阻力很小，促使μ非常低。而且，在開始加載和/或運動時，發生擠壓膜、流體動力和彈性流體動力類型的流體膜潤滑，其中加壓、運動和變形起到將粘性潤滑劑從相對運動的兩個表面之間的間隙中驅趕出來和/或驅使粘性潤滑劑通過相對運動的兩個表面之間的間隙的作用。流體壓力/膜與邊界潤滑發生的相關程度經典地取決於許多因素(31)。當潤滑膜可在可以彈性變形的一致(conforming)滑動表面之間流動時，發生彈性流體動力潤滑。壓力、表面粗糙度和相對滑動速度決定何時完全流體潤滑開始失效並且潤滑進入新的機制。 隨著速度進一步下降，粘附到關節表面的潤滑膜開始發揮作用並發生混合的潤滑機制。如果速度再進一步下降，並僅保留由幾個分子組成的超薄潤滑劑層時，發生邊界潤滑。因此邊界模式的潤滑通過不隨影響流體膜的形成的因素(例如相對滑動速度和軸向載荷)而變化的定常滑動期間的摩擦係數(相對運動的兩個接觸表面之間測得的摩擦力與所施加的法向力之比)來指示(35)。對於關節軟骨而言，已經得出結論肯定會發生邊界潤滑，雖然由流體加壓和其它機理進行補充(36 39)。在邊界潤滑中，通過表面與表面的接觸支撐載荷，並且相關的摩擦性質由潤滑表面分子確定。已經提出這種模式是重要的，因為相對軟骨層以總面積的 10%接觸，並且這可能是發生大部分摩擦的地方(30)。此外，隨著加載時間的增加和流體靜壓力的耗散，塗布有潤滑劑的表面相對於加壓流體承受比例越來越高的載荷，因此，這種模式可變得越來越佔優勢(31、32)。邊界潤滑本質上減輕粘滑(31)，因此表現為對定常運動和開始運動兩者的阻力下降。後一種情況與長時間壓縮加載(例如，就坐或站立，體內)之後承受載荷的關節表面相關(33)。軟骨表面的典型磨損模式(34)也表明，關節軟骨的邊界潤滑對於保護和維持關節表面結構而言是非常重要的。隨著加載時間的增加和流體靜壓力的耗散，塗布有潤滑劑的表面相對於加壓流體承受比例越來越高的載荷，因此，μ可通過這種潤滑模式變得越來越佔優勢。邊界模式的潤滑通過不隨影響流體膜的形成的因素(例如相對滑動速度和軸向載荷)而變化的定常滑動期間的μ值來指示。邊界潤滑本質上減輕粘滑，因此表現為對定常運動和開始運動兩者的阻力下降。PRG4在滑液中和關節表面處的積累很可能是PRG4邊界潤滑能力的關鍵的功能決定因素。近來，證實與自由溶脹或靜態壓縮的培養物相比，動態剪切加載培養的軟骨外植體產生顯著的三倍分泌的PRG4(27)。在存在生理調節物的內環境穩定的和病理疾病 (condition)下，這種軟骨細胞的PRG4合成和分泌可顯著有助於滑液內PRG4的濃度(23)。 雖然結合到表面的PRG4的量似乎與分泌速率不相關，但是之前的研究表明表面結合的 PRG4可以與滑液中的內源PRG4交換(25)，特別是在機械擾動的影響下Q6、27)。對關節內、特別是關節表面處PRG4代謝的空間和時間方面的說明將促進理解PRG4對關節軟骨的低摩擦性質的貢獻，並且可能導致治療以防止這種功能的喪失00、41)。有關不同分子量的各種PRG4分子的處理、以及潛在的額外功能或替代功能，更多是有待確定的(10、27、28、 61)。而且，刺激關節表面附近軟骨細胞中PRG4表達的化學和機械因素的組合對於由分離的具有潤滑功能和生物活性的表面的亞群09)產生組織工程改造的軟骨可能是有利的。目前不知道生物界面處邊界潤滑的確切機理。然而，蛋白聚糖4(PRG4)在關節連結中可作為邊界潤滑劑發揮關鍵作用。這種分泌的糖蛋白被認為是保護軟骨表面免受摩擦力、細胞粘附和蛋白沉積。已經分離和表徵了各種天然和重組的潤滑素蛋白和同種型 (isoform)。例如，美國專利 No. 5，326，558 ；No. 6，433，142 ；No. 7，030223 和 No. 7，361，738 公開了人巨核細胞刺激因子(MSF)的家族以及含有一種或多種這種MSF的用於治療疾病狀態或病症例如血小板缺乏症的藥物組合物。美國專利No. 6，960，562和6，743，774也公開了包含基本上純的MSF片段的潤滑多肽tribonectin，以及通過全身施用或者直接向組織施用tribonectin來潤滑關節或其它組織的方法。

發明內容
本發明在各種實施方式中提供用於處理眼部潤滑的藥物組合物及使用該藥物組合物處理眼部潤滑的方法，所述處理眼部潤滑包括眼表(ocular surface)處邊界潤滑分子的治療性補充和富集。在本發明的某些實施方式中描述的是以下研究結果，PRG4mRNA在人角膜和結膜上皮細胞以及小鼠淚腺和瞼板腺中表達，這表明PRG4蛋白存在於眼表上的這些組織中。在本發明的某些情況中描述的是以下研究結果，PRG4蛋白在眼表上所起的作用是保護角膜和結膜免受在眼瞼眨眼、接觸鏡佩戴和其它不良疾病期間產生的明顯剪切力。 淚膜的影響，包括炎症、促炎細胞因子、性類固醇失調和蛋白酶對膜的組成和功能的影響顯示促進邊界潤滑的眼部組織的治療過程。在某些實施方式中，本發明提供適合於局部施用至眼表的藥物組合物，其包含懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效濃度的PRG4蛋白。本發明的藥物組合物還可包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑和眼可接受的軟化劑。本發明中考慮的示例性眼可接受的緩和劑包括，但不限於羧甲基纖維素鈉(例如約0. 2 2. 5% w/v)、羥乙基纖維素(例如約0. 2 2. 5% w/v)、羥丙甲纖維素(例如約 0. 2 2. 5% w/v)、甲基纖維素(例如約0. 2 2. 5% w/v)、右旋糖苷70 (例如約0. 1% w/ ν)、明膠(例如約0. 01% w/v)、甘油(例如約0. 2 1 % w/v)、聚乙二醇300 (例如約0. 2 1% w/v)、聚乙二醇400(例如約0. 2 w/v)、聚山梨醇酯80 (例如約0. 2 w/v)、 丙二醇(例如約0. 2 1 % w/v)、聚乙烯醇(例如約0. 1 4% w/v)、聚乙烯吡咯酮(例如約0. 1 2% w/v)。本發明中考慮的示例性眼可接受的賦形劑/軟化劑包括，但不限於無水羊毛脂(例如約1 10% w/v)、羊毛脂(例如約1 10% w/v)、輕質礦物油(例如，( 約50% w/v)、礦物油(例如，彡約50% w/v)、石蠟(例如，彡約5% w/v)、凡士林(例如，( 約100% w/v)、白色軟膏(例如，彡約100% w/v)、白凡士林(例如，彡約100% w/v)、白蠟 (例如，彡約5% w/v)、黃蠟(例如，彡約5% w/v)。本發明中考慮的示例性眼可接受的收斂劑包括，但不限於硫酸鋅(例如約0. 25%W/v)。本發明中考慮的示例性眼可接受的血管收縮劑包括，但不限於鹽酸麻黃鹼(例如約0. 123% w/v)、鹽酸萘唑啉(例如約0. 01 約 0. 03% w/v)、鹽酸脫羥腎上腺素(例如約0. 08 約0. 2% w/v)和鹽酸四氫唑啉(例如約 0. 01 約 0. 05% w/v)。在這些之中的一些實施方式中，緩和劑、賦形劑、收斂劑、血管收縮劑、軟化劑和電解質提供以眼可接受的方式遞送PRG4蛋白的手段。如果眼可接受的組合物在施用時沒有不可接受的眼睛毒性、灼燒、搔癢、粘性、視力模糊等，則它們適合對眼表局部施用。
在某些實施方式中，本發明的藥物組合物還包含治療有效濃度的一種或多種其它治療劑，包括但不限於透明質酸鈉、透明質酸和磷脂。示例性磷脂包括但不限於L-α - 二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂。在某些實施方式中，本發明提供適合對眼表局部施用的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在摩爾滲透壓濃度約300m0SmS/L的眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效濃度的PRG4蛋白，所述眼可接受的平衡鹽溶液包含至少三種電解質，所述電解質包括但不限於氯化鈉(NaCl)O. 64%、氯化鉀(KCl)O. 75%、氯化鈣二水合物(CaCl2 · 2Η20)0· 048%、氯化鎂六水合物(MgCl2 · 6Η20)0. 03%、醋酸鈉三水合物(C2H3NaA · 3Η20)0. 39%、脫水檸檬酸鈉 (C6H5Na3O7 · 2Η20) 0. 17%、氫氧化鈉和/或鹽酸(調節ρΗ至約7. 5)。在某些實施方式中，本發明提供適合對眼表局部施用的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在摩爾滲透壓濃度約300m0SmS/L的眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效濃度的PRG4蛋白，所述眼可接受的平衡鹽溶液由約128mM的鈉(Na+)、約24mM的鉀(K+)、約113mM 的氯(CF)、約0. 4mM的鈣(Ca2+)、約0. 3mM的鎂(Mg2+)、約5mM的HCOf、約ImM的檸檬酸根、 約14mM的磷酸根、約15mM的醋酸根、以及氫氧化鈉和/或鹽酸(ρΗ調節為約7. 5)組成。本發明還提供在有需要的個體中治療眼部潤滑不足或與其有關的症狀的方法。所述方法包括對所述有需要的個體的眼表局部施用包含治療有效濃度的PRG4蛋白的藥物組合物。在某些實施方式中，將包含PRG4蛋白的所述藥物組合物與眼可接受的配製物組合施用，所述眼可接受的配製物包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑和眼可接受的軟化劑。在一些實施方式中，將包含PRG4蛋白的所述藥物組合物與以上討論的包含治療有效濃度的透明質酸鈉或透明質酸、或者表面活性磷脂的眼可接受的溶液組合施用。而在某些實施方式中，將包含PRG4蛋白的所述藥物組合物與磷酸鹽緩衝鹽水溶液或以上討論的包含一種或多種電解質的眼可接受的平衡鹽溶液組合施用。本發明提供治療由於眼部邊界環路中的淚液損失或不穩定淚膜引起的眼部潤滑不足或與其有關的症狀，例如雄激素缺乏症、Sj0gren症候群和乾燥性角結膜炎(KCS)的方法。這樣的方法包括向有需要的患者的眼表局部施用本發明的藥物組合物。在某些實施方式中，本發明還提供用於解決和治療與不利的或不足的眼部潤滑有關的疾病的方法。示例性疾病包括，但不限於淚液生成不足或蒸發性乾眼病(aqueous or evaporative dry eye disease)、Sj0gren症候群、乾燥性角結膜炎、雄激素缺乏症、 瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術、變態反應、減少的淚膜破裂時間、變態反應、眼表病症、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度 (hyperοsmo 1 arity)禾口老化。


圖1代表眼表邊界潤滑中的反饋環路。圖2說明人角膜上皮細胞中的PRG4mRNA表達。從男性和女性供體的角鞏膜邊緣分離人角膜上皮細胞。通過使用Agilent 2100BioanalyZer篩選存在PRG4產物的擴增樣品。豎直欄含有L.麗階梯；1.沒有模板對照；2.來自33歲女性的角膜組織；4.來自70 歲女性的培養角膜上皮細胞；6.來自53歲男性的培養角膜上皮細胞。
圖3說明人結膜上皮細胞中的PRG4mRNA表達。從男性和女性供體的角鞏膜邊緣分離人角膜上皮細胞。通過使用瓊脂糖凝膠電泳篩選存在PRG4產物的擴增樣品。豎直欄含有1. MW階梯；2.沒有模板對照；4.女性人結膜；5.男性人結膜。圖4說明人角鞏膜邊緣組織樣品中的PRG4mRNA表達。L.從男性和女性供體的角鞏膜邊緣分離人角膜上皮細胞。使用Agilent 2100BioanalyZer篩選存在PRG4產物的擴增樣品。豎直欄含有MW階梯；1.人肝臟cDNA標準；2.來自M歲女性的角鞏膜邊緣組織； 3.來自51歲女性的角鞏膜邊緣組織；4.人結膜上皮細胞。圖5說明人結膜印記細胞樣品(impression cytology sample)中的PR(MmRNA表達。從男性和女性供體分離結膜印記細胞樣品。使用Agilent 2100BioanalyZer篩選存在 PRG4產物的擴增樣品。豎直欄含有L. MW階梯；1-9.結膜印記細胞樣品；10.人結膜上皮細胞的重複(圖3中的欄4)。圖6說明摩擦試驗示意圖。將角膜眼表(605)固定到惰性(inert)非滲透性半剛性橡膠塞式圓柱體(603)(半徑r = 6mm)的球面端。將該塞式圓柱體(603)附接於力學試驗機(Bose ELF 3200)的旋轉致動器形成下關節面。環(601)(外徑=3. 2_，內徑= 1. 5mm)從眼瞼(604)衝壓。將該環(601)附接於與軸向載荷(N)和扭轉(τ )載荷單元耦合的線性致動器，形成上關節面。通過在塞式圓柱體(603)的周圍緊固惰性管形成潤滑劑浴(602)。ω是角頻率。圖7說明添加PRG4蛋白(潤滑素)時體外眼瞼/角膜動摩擦的減少。圖8說明添加PRG4蛋白(潤滑素)之後1分鐘測量的體外眼瞼/角膜動摩擦的減少。圖9說明添加PRG4蛋白(潤滑素)之後5分鐘測量的體外眼瞼/角膜動摩擦的減少。圖10說明添加PRG4蛋白(潤滑素)之後體外眼瞼/角膜動摩擦隨時間的減少。
具體實施例方式在本文的某些實施方式中提供，在需要治療的個體中治療眼部潤滑不足(例如， 眼部邊界潤滑不足)或與其有關的症狀的方法，包括對所述個體的眼表局部施用包含治療有效量的PRG4蛋白的藥物組合物。在本文的一些實施方式中還提供包含在眼可接受的配製物中的PRG4蛋白的藥物組合物。在具體實施方式
中，本文提供適合對眼表局部施用的藥物組合物，該藥物組合物包含懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效量的PRG4，並且該藥物組合物還可與一種或多種眼可接受的試劑組合，所述眼可接受的試劑選自眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑和眼可接受的軟化劑。在本文的一些實施方式中提供用於治療眼表處眼部潤滑不足(例如眼部邊界潤滑不足，如降低的或不良的眼部邊界潤滑)的藥物組合物及使用該藥物組合物進行所述治療的方法。本發明某些實施方式的藥物組合物包含與一種或多種眼科試劑組合的懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的分離或純化的PRG4蛋白，所述眼用試劑選自眼用緩和劑、賦形劑、收斂劑、血管收縮劑和軟化劑。在一些實施方式中，本文提供的任何藥物組合物均進一步包含用於局部施用的藥物可接受載體中的一種或多種選自以下的額外治療劑透明質酸鈉、表面活性磷脂和電解質。本發明在某些實施方式中提供處理眼部潤滑的新途徑，包括眼表處邊界潤滑分子的治療性補充和富集。應注意，在眼科界中迄今為止並沒有認識到眼部邊界潤滑的重要性和機理。多年來，矯形外科研究界中的科學共識是流體動力潤滑是到目前為止關節軟骨潤滑的最主要的模式，而邊界潤滑只是事後才有的想法。而且，研究軟骨表面邊界潤滑的那些研究者提出，邊界潤滑很可能只在「高載荷和低速」下是重要的，這與眼表的狀況相反，在眼表存在相對低的軸向載荷和相對快的滑動速度。參見例如(54)。而且，迄今為止還沒有考慮涉及角膜多糖包被(glyocalyx)的邊界潤滑。Jay等人比較了來自牛滑液的純化潤滑因子與「來自人下頌下的唾液和經刺激的淚液的粘質糖蛋白」，並總結出「由淚腺分泌的粘蛋白不潤滑」，忽視了角膜上皮是潤滑劑的來源或者邊界潤滑在眼表是重要的貢獻者的可能性。參見例如(55)。最近的淚膜動力學的數學模型也忽略了邊界潤滑的可能性，主張對於淚膜的高度進行「潤滑近似」，從而「可以認為角膜上的粘液層為水膜提供不滑移的表面」並且「應注意該模型僅預測[淚膜]厚度達到該模型失效時的某一臨界薄的值之前的演化」。 參見例如(57)。需要處理眼部潤滑並保護角膜和結膜免受由本文所述的不良疾病所產生的顯著剪切力，所述不良疾病以非限制性實例的方式包括淚液生成不足或蒸發性乾眼病、Sj0gren 症候群、乾燥性角結膜炎、雄激素缺乏症、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術、變態反應、減少的淚膜破裂時間、變態反應、眼表病症、淚膜中和眼表處的提高的蛋白酶水平、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度和老化。在一些情況下，角膜和結膜的載荷很可能由剪切力支配。在某些情況下，眼瞼眨眼以及接觸鏡佩戴在眼表上皮細胞上產生顯著的應力，特別是存在受損的淚膜時更是如此。 如圖1所示，其表明增大的剪切應力導致淚膜不穩定性、蒸發性淚液損失、高摩爾滲透壓濃度、溶脹壓力變化和剪切應力的反饋提高。在某些情況下，增大的剪切應力也被認為促進炎症、雄激素缺乏症和蛋白聚糖的表達下降。在某些情況下，增大的剪切應力及其後遺症可隨著時間導致眼表處的邊界潤滑的損失。可通過任何合適的方法確定眼部潤滑不足以及與其有關的症狀。在一些情況下， 定性(例如，感覺到低潤滑、乾眼、不適等)或定量(例如，通過力學、生物化學、電學、光學或其它定量測定方法測量)地確定眼部潤滑不足以及與其有關的症狀。在某些情況下，在眼部邊界潤滑的不良疾病中，將存在受損的淚膜，所述不良疾病例如由淚液生成不足或蒸發性乾眼病、Sj0gren症候群、乾燥性角結膜炎、雄激素缺乏症、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術、變態反應、減少的淚膜破裂時間、變態反應、眼表病症、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度和老化所導致的那些。在這些之中的一些情況下，提高的蒸發可妨礙有效的流體膜潤滑，但是容許邊界潤滑和分子犧牲機理來減少細胞表面處的剪切應力。本發明的某些實施方式提出，眼表處的邊界潤滑分子的治療性補充和富集將中斷反饋環路，而與眼部潤滑不足有關的不良疾病通過該反饋環路促進眼表窘迫。在某些情況下，如本文所述，PRG4蛋白在眼睛中作為邊界潤滑劑起到重要的作用。 在一些情況下，這種分泌的糖蛋白保護眼表，從而保護角膜和結膜免受在眼瞼眨眼、接觸鏡佩戴以及由慢性炎症和高摩爾滲透壓濃度所引起的任何其它不良眼部邊界潤滑過程中所產生的顯著剪切力，所述慢性炎症和高摩爾滲透壓濃度是由於乾眼病、雄激素缺乏症、雌激素替代療法、受損的淚膜、變態反應、老化、眼表疾病以及淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平所引起的。鑑於帶電分子中機電相互作用與滲透壓之間的關係，本發明在一些實施方式中提供用於處理眼部潤滑不足的藥物組合物，所述藥物組合物通過中斷反饋機理來調節眼表的高摩爾滲透壓濃度或摩爾滲透壓濃度，所述反饋機理阻止分泌的成分降低摩擦係數和減輕剪切應力。在另一示例性實施方式中，本發明的特徵是眼部邊界潤滑的犧牲機理，通過該犧牲機理表面結合受體可逆地結合一種或多種凝膠形成或表面活性劑構建體(construct)。 在一些情況下，凝膠形成或表面活性劑構建體在剪切活動中脫離，從而防止剪切應力到達上皮表面(或減小到達上皮表面的剪切應力)。在某些實施方式中，在短暫的剪切活動之後，凝膠形成和表面活性劑構建體容許回到它們未受到幹擾的平衡，再次與表面結合受體結合。在一些實施方式中，整個構建體可在剪切期間脫離。可以想像，在某些情況下這種平衡的熱力學將隨著剪切幅度的增大而提高從受體釋放的概率，但是任何一種締合都是容易可逆的。在本發明的一個實施方式中，將包含懸浮在眼可接受的平衡溶液中的PRG4蛋白的藥物組合物局部施用到眼表，其中PRG4蛋白締合或結合到該眼表。在該實施方式的某些情況下，PRG4起到表面結合受體的作用，其被容許與淚膜內的蛋白聚糖和內源蛋白相互作用以建立犧牲機理，從而在眼表減小眼瞼眨眼期間的摩擦，防止眼表處的蛋白吸附，並減少由於淚膜的不穩定性弓I起的乾燥斑點。在本發明的另一實施方式中，PRG4以與一種或多種透明質酸和磷脂構建體組合的方式局部施用並締合或結合到眼表。在該實施方式的某些情況下，PRG4起到表面結合受體的作用，其與外源供給的透明質酸和/或磷脂相互作用以建立犧牲機理，從而在眼表減小眼瞼眨眼期間的摩擦，防止眼表處的蛋白吸附，並減少由於淚膜的不穩定性引起的乾燥斑點。在該實施方式中，透明質酸和磷脂構建體在剪切活動期間與PRG4解離。在又一實施方式中，整個構建體在剪切活動期間脫離以防止剪切應力到達上皮。在再一實施方式中，PRG4的功能片段、多聚體(例如，二聚體、三聚體、四聚體等)、 同源物或直向同源物(ortholog)在犧牲機理中起到表面受體和/或凝膠形成構建體的作用。PRG4的功能片段和同源物包括在中心粘蛋白樣KEPAPTT-重複(SEQ ID NO 4)結構域中具有較少重複序列的那些、糖基化和非糖基化形式的蛋白、剪接變體、重組體形式等。根據以定性的、力學的、光學的、電的方式或通過生物化學測定進行的測量，PRG4的潤滑片段呈現人PRG4的至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的眼潤滑效果。如本文所使用的術語「PRG4」、"PRG4蛋白」或「蛋白聚糖4」蛋白可與術語「潤滑素」蛋白互換地使用。本文所使用的PRG4還涵蓋UCL/HGNC/HUG0人基因命名(Human Gene Nomenclature)資料庫所接受的術語巨核細胞刺激因子(MSF)、和淺區蛋白(SZP)。如本文所使用的PRG4或潤滑素蛋白是指任何分離的或純化的天然或重組潤滑素蛋白、同源物、功能片段或基序、同種型、和/或其突變體。在某些實施方式中，分離的或純化的PRG4蛋白包括人天然或重組潤滑素蛋白的胺基酸序列。在其它實施方式中，分離的或純化的PRG4蛋白包括由PRG4基因外顯子編碼的胺基酸序列，該PRG4基因外顯子編碼全長PRG4蛋白或同種型的一級結構。蛋白聚糖4(PRG4)基因含有12個外顯子。本文所使用的PRG4蛋白包括由PRG4基因外顯子1 12，更優選外顯子6 12且最優選外顯子9 12編碼的胺基酸序列。如本文所使用的PRG4蛋白包括現在已知的或者以後描述的任何PRG4蛋白。在某些實施方式中，優選的PRG4蛋白胺基酸序列在SEQ ID NO :1中提供。PRG4蛋白以至少 60%的同源性，優選75%的同源性，更優選85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性享有任何已知PRG4蛋白或同種型的一級胺基酸結構。在某些實施方式中，優選的 PRG4蛋白具有50kDa 400kDa的平均摩爾質量，包括PRG4蛋白的一個或多個生物活性部分、或其功能片段(例如潤滑片段)、或其同源物。如本文所使用的PRG4蛋白包括蛋白的生物活性部分。如本文所使用的PRG4蛋白的「生物活性部分」包括蛋白的功能片段，其包含與所述蛋白的胺基酸序列充分同源或者源自所述蛋白的胺基酸序列，其包括比全長蛋白少的胺基酸，並呈現全長蛋白的至少一種活性。典型地，生物活性部分包括具有蛋白的至少一種活性的功能結構域或基序。蛋白的生物活性部分可以是多肽，其為例如長度10、25、50、100、200或更多的胺基酸。在一個實施方式中，PRG4蛋白的生物活性部分可以單獨或者與用於治療不良的或降低的眼部邊界潤滑的其它治療劑組合用作治療劑。在例如Turner 等人的美國專利 No. 5，326，558 ；6，433，142 ；7，030，223 ； 7，361，738以及Jay等人的美國專利No. 6，743，774和6，960，562中公開了若干天然和重組 PRG4或潤滑素蛋白的核酸和胺基酸序列、以及PRG4蛋白和各種同種型的表徵。Flarmery 等人的美國公開No. 20070191268也公開了可用於本發明的重組PRG4或潤滑素分子。PRG4蛋白的分離、純化和重組表達的方法在本領域中是公知的。在某些實施方式中，所述方法以使用標準分子生物學技術例如PCR或RT-PCR克隆和分離編碼PRG4蛋白或同種型的cDNA和mRNA開始。然後，將編碼PRG4蛋白或同種型的分離的cDNA克隆到表達載體中，並進一步在宿主細胞中轉化和表達，從而產生重組PRG4蛋白。如本文中所用的「重組」是指體外合成的或者以其它方式操作的多核苷酸(例如 「重組多核苷酸」)，是指使用重組多核苷酸在細胞或其它生物體系中產生基因產物的方法， 或者是指由重組多核苷酸編碼的多肽(「重組蛋白」)。「重組」還包括將具有來自不同來源的各種編碼區或結構域或啟動子序列的核酸連接成表達盒或載體，用以表達(例如，誘導型或組成型表達)包含使用本發明的引物擴增的核酸序列和PRG4基因的活性結構域的融合蛋白ο在某些實施方式中，PRG4蛋白編碼核酸可含有一個或多個突變、缺失或插入。在這樣的實施方式中，PRG4蛋白編碼核酸與野生型PRG4蛋白編碼核酸具有至少60%的同源性，優選75%的同源性，更優選85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。如本文所使用的術語「cDNA」包括與細胞中存在的mRNA分子互補的DNA或者可使用酶例如逆轉錄酶轉化為cDNA的生物體mRNA。在某些實施方式中，使用本領域中公知的 RT-PCR方法從人角膜或結膜上皮細胞中表達的PRG4mRNA中分離編碼PRG4蛋白的cDNA。如本文所使用的術語「多核苷酸」、「核酸/核苷酸」和「寡核苷酸」可互換地使用， 並且包括任何長度的聚合形式的核苷酸，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其類似物。多核苷酸可具有任何三維結構，並且可發揮任何已知或未知的功能。下列是多核苷酸的非限制性實例基因或基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、核酶、 DNA、cDNA、基因組DNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重組的或其任意組合。多核苷酸可包括修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在的話， 對核苷酸結構的修飾可在聚合物的裝配之前或之後賦予。可用非核苷酸組分中斷核苷酸的序列。多核苷酸可在聚合後進一步修飾，如通過與標記組分接合。該術語還包括雙鏈和單鏈分子兩者。除非另有說明或者需要，作為多核苷酸的本發明的任何實施方式涵蓋雙鏈形式以及已知或預計組成雙鏈形式的兩個互補單鏈形式中的每一個。如本文所使用的術語「多核苷酸序列」是多核苷酸分子的字母表示。多核苷酸由四種核苷酸鹼基的特定序列組成腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及代替胸腺嘧啶的尿嘧啶(U)(當多核苷酸為RNA，而不是DNA時)。這種字母表示可以輸入到計算機的資料庫中並用於生物信息應用，例如功能基因組和同源性檢索。如本文所使用的術語「分離的多核苷酸/cDNA」包括與天然來源的多核苷酸中存在的其它多核苷酸分子分離的多核苷酸分子。例如，關於基因組DNA，術語「分離的」包括與基因組DNA天然關聯的染色體分離的多核苷酸分子。優選地，「分離的」多核苷酸不含天然地位於得到所述多核苷酸的生物體的基因組DNA中的多核苷酸側翼的序列(即，位於目標多核苷酸的5』端和3』端的序列)。例如，在多種實施方式中，在本發明中使用的編碼PRG4蛋白的分離的多核苷酸分子可含有小於約5吐、4吐、31^、21^、11^、0. 51Λ或0. Ikb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地位於得到所述多核苷酸的細胞的基因組DNA中多核苷酸分子的側翼。而且，「分離的」多核苷酸分子，例如cDNA分子，當通過重組技術產生時，可基本上不含其它細胞材料或培養基，或者當其通過化學方式合成時，可基本上不含化學前體或其它化學品。如本文所使用的「基因」包括含有至少一個在轉錄和翻譯後能夠編碼特定多肽或蛋白的可讀框的多核苷酸。本文中所述的任何多核苷酸序列也可用於鑑定與它們有關的基因的較大片段或全長編碼序列。分離較大片段序列的方法是本領域技術人員已知的。如本文所使用的「天然的或天然存在的」多核苷酸分子包括例如具有天然存在的核苷酸序列 (例如，編碼天然蛋白)的RNA或DNA分子。如本文所使用的術語「多肽」或「蛋白」是可互換的，並且包括兩個或更多個亞基胺基酸、胺基酸類似物或肽模擬物(P^tidomimetic)的化合物。所述亞基可通過肽鍵連接。 在另一實施方式中，所述亞基可通過其它鍵，例如酯、醚等連接。如本文所使用的術語「胺基酸」包括天然和/或非天然或合成的胺基酸，包括甘氨酸和D或L旋光異構體兩者，以及胺基酸類似物和肽模擬物。三個或更多個胺基酸的肽通常稱作寡肽。超過三個或更多個胺基酸的肽鏈稱作多肽或蛋白。在某些實施方式中，如本文所使用的PRG4蛋白是指在人或其它宿主細胞中天然或重組表達的PRG4蛋白或其各種同源物或同種型。如本文所使用的「表達(express)」或 「表達(expression)」包括多核苷酸轉錄為RNA和/或翻譯為多肽的過程。如果多核苷酸是源自基因組DNA的，當選擇合適的真核宿主時，表達可包括RNA的剪接。表達所需的調節元件包括結合RNA聚合酶的啟動子序列和用於核糖體結合的轉錄起始序列。例如，細菌表達載體包括啟動子例如Iac啟動子以及用於轉錄起始的Siine-Dalgarno序列和起始密碼子AUG。類似地，真核表達載體包括RNA聚合酶II的異源或同源啟動子、下遊聚腺苷酸化信號、起始密碼子AUG和用於核糖體脫離的終止密碼子。這樣的載體可商購獲得或者通過本領域公知的方法例如以下所述通常用於構建載體的方法中所述序列進行裝配而獲得。如本文所使用的術語「載體」包括將插入的多核苷酸轉移到宿主細胞中和/或在宿主細胞之間轉移的自我複製的核酸分子。該術語意在包括主要功能是將核酸分子插入到細胞中的載體、主要功能是複製核酸的複製載體、以及功能是轉錄和/或翻譯DNA或RNA的表達載體。 該術語還意在包括提供多於一種的以上功能的載體。如本文所使用的「宿主細胞」意在包括任何個體細胞或細胞培養物，其可以是或者已經是載體用受體或者用於引入外源多核苷酸和/或多肽的受體。其還意在包括單個細胞的後代。由於天然的、偶然的或故意的突變，後代可不必與原始親代細胞完全相同(在形態學或者基因組或總DNA互補體方面)。細胞可以是原核的或真核的，包括但不限於細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞和哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞包括但不限於鼠類、 大鼠、猿猴或人細胞。如本文所使用的「宿主細胞」還包括遺傳修飾細胞。術語「遺傳修飾細胞」包括含有和/或表達外來或外源基因或多核苷酸序列的細胞，而所述外來或外源基因或多核苷酸序列又改變細胞或其後代的基因型或表型。「遺傳修飾」還包括含有或表達已經被引入到細胞中的基因或多核苷酸序列的細胞。例如，在該實施方式中，遺傳修飾細胞已經引入有對該細胞而言也是內源性的基因。術語「遺傳修飾」還包括對細胞的內源核苷酸的任何添加、缺失或破壞。如本文所使用的「宿主細胞」可為表達人PRG4蛋白的任何細胞。如本文所使用的「同源物」在本文中定義為分別具有類似的或基本上相同的核酸或胺基酸序列的兩個核酸或肽。術語「同源物」還涵蓋由於遺傳密碼的簡併性而不同於核苷酸序列之一而編碼相同的胺基酸序列的核酸分子。在一個優選的實施方式中，同源物包括編碼PRG4蛋白的核酸(例如，SEQ IDNO=I)的等位基因變體、直向同源物、橫向同源物 (paralog)、激動劑以及拮抗劑。如本文所使用的術語「直向同源物」是指來源於不同的物種但由共同的祖先基因通過物種形成進化而來的兩個核酸。通常，直向同源物編碼具有相同或類似功能的肽。具體地說，本發明的直向同源物與任何已知的PRG4蛋白(例如，SEQ ID NO :1)、其同種型或類似物的所有或部分的胺基酸序列通常呈現出至少80 85%，更優選85 90%或90 95%，且最優選95%、96%、97%、98%或甚至99 %的同一性，或100 %的序列同一性，並且呈現出與這些肽類似的功能。為了確定兩個胺基酸序列的百分序列同一性，以進行最佳比較為目的進行序列比對(例如，為了與其它多肽或核酸進行最佳比對，可在一個多肽的序列中引入缺口)。然後比較相應胺基酸位置處的胺基酸殘基。當一個序列中的位置被與另一序列中相應位置處的相同的胺基酸殘基佔據時，則分子在該位置處是相同的。在兩個核酸序列之間可以進行相同類型的比較。兩個序列之間的百分序列同一性是所述序列共享的相同位置數的函數 (即，百分序列同一性=相同位置數/位置總數X100)。優選地，本發明中包括的分離的胺基酸同源物與任何已知PRG4蛋白的整個胺基酸序列(例如，SEQ ID NO 1)是至少約50 60 %，優選至少約60 70 %，且更優選至少約70 75 %、75 80 %、80 85 %、85 90 % 或90 95%，且最優選至少約96%、97%、98%、99%或更高相同的。在某些實施方式中，編碼PRG4蛋白的分離的核酸同源物包括與編碼這種PRG4蛋白的胺基酸序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO 1)至少約40 60%，優選至少約60 70%，更優選至少約70 75%、75 80%、80 85%、85 90%或90 95%，甚至更優選至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高相同的核苷酸序列。兩個核酸或肽序列之間百分序列同一性的確定是本領域中公知的。例如，可使用 Vector NTI 6. 0 (PC)軟體包anforMax，Bethesda，MD)來確定兩個核酸或肽序列之間的百分序列同一性。在該方法中，使用15的缺口開放罰分(gap opening penalty)和6. 66的缺口延伸罰分(gap extension penalty)來確定兩個核酸之間的百分同一性。使用10的缺口開放罰分和0. 1的缺口延伸罰分來確定兩個多肽的百分同一性。所有其它參數設定為默認設置。為了進行多重比對(Clustal W算法)，使用blosum 62矩陣，缺口開放罰分為10， 而缺口延伸罰分為0. 05。應理解，當比較DNA序列和RNA序列時，為了確定序列同一性，胸腺嘧啶核苷酸相當於尿嘧啶核苷酸。而且，本文所使用的PRG4蛋白包括由與編碼PRG4蛋白的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸編碼的PRG4蛋白。如本文所使用的「雜交」包括其中一種或多種多核苷酸反應以形成通過核苷酸殘基的鹼基之間的氫鍵鍵合而穩定化的複合物的反應。所述氫鍵鍵合可通過Watson-Crick鹼基配對、Hoogstein結合或以任何其它序列特異性方式發生。所述複合物可包含兩條形成雙鏈體結構的鏈、三條或更多條形成多鏈複合物的鏈、單獨的自雜交鏈、或這些的任意組合。雜交反應可構成更廣泛的過程中的一個步驟，例如PCR反應的起始，或核糖體對多核苷酸的酶切割。雜交反應可在不同的嚴格條件下進行。本發明包括能夠在降低的嚴格條件下、更優選在嚴格條件下、且最優選在高度嚴格條件下與編碼本文所述PRG4蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的術語「嚴格條件」是指在IOx Denhart溶液，6xSSC、0. 5% SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中，在60°C過夜的雜交。印記在62°C依次在下述中各洗滌 30 分鐘:3xSSC/0. 1% SDS，然後是 lxSSC/0. 1% SDS，最後為 0. lxSSC/0. 1% SDS。在某些實施方式中，如本文所使用的短語「嚴格條件」還指在6xSSC溶液中在65°C的雜交。在其它實施方式中，「高度嚴格條件」是指在IOx Denhart溶液，6xSSC、0. 5% SDS和100mg/ml變性鮭精DNA中在65°C過夜的雜交。印記在65°C依次在下述中各洗滌30分鐘3xSSC/0. 1% SDS, 然後是lxSSC/0. 1% SDS，最後為0. lxSSC/0. 1% SDS。核酸雜交的方法在本領域是公知的。 因此，由本文使用的核酸編碼的PRG4蛋白包括與編碼人PRG4蛋白的多核苷酸序列(例如， SEQ ID NO 1)或其特異性同種型或同源物具有至少60%同源性，優選75%同源性，更優選 85%，更優選90%，最優選95%、96%、97%、98%、99%同源性的核酸。而且，本文使用的PRG4蛋白還可以是嵌合蛋白或融合蛋白。如本文所使用的「嵌合蛋白」或「融合蛋白」包括可操作地與第二多肽連接的第一多肽。嵌合蛋白可任選地包括可操作地與第一或第二多肽連接的第三、第四或第五或其它多肽。嵌合蛋白可包含兩個或更多個不同的多肽。嵌合蛋白可包含相同多肽的多個拷貝。嵌合蛋白還可在一個或多個多肽中包含一個或多個突變。產生嵌合蛋白的方法在本領域是公知的。在本發明某些實施方式中，嵌合蛋白是PRG4蛋白與其它PRG4蛋白同種型的嵌合體。如本文所使用的「分離的」或「純化的」蛋白、多核苷酸或分子意為從它們天然存在的環境中移出；或基本上不含細胞物質，如來自得到所述蛋白多核苷酸或分子的細胞或組織源的其它汙染蛋白；或化學合成時，基本上不含化學前體或其它化學品。表述「基本上不含細胞物質」包括從由其分離或重組產生或合成的細胞的細胞組分中分離的製備物(preparation)。在某些實施方式中，表述「基本上不含細胞物質」包括具有少於約30% (按乾重計)的其它蛋白(在本文中也稱為「汙染蛋白」)，更優選少於約20%、還更優選少於約 10%、以及最優選少於約5%的其它蛋白的PRG4蛋白的製備物。當蛋白或多核苷酸為重組產生時，還優選其基本上不含培養基，即，培養基少於約20%、更優選少於約10%、且最優選少於約5%的目標蛋白製備物的體積。在某些實施方式中，本發明提供藥物組合物，該藥物組合物適於將與一種或多種眼可接受的試劑組合的懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的藥物有效濃度的PRG4蛋白局部施用於有需要的個體的眼表。所述眼可接受的試劑可選自眼可接受的緩和劑、賦形劑、收斂劑、血管收縮劑和軟化劑。如本文所使用的術語「有效濃度或有效量」或「治療有效濃度或治療有效量」意為表示無毒的而足以提供期望治療效果的PRG4蛋白或其它治療劑的濃度或量。有效的濃度或量隨受試者不同而不同，取決於個體的年齡和一般狀況、特定試劑等。 因此，並非總是可以規定精確的有效濃度或有效量。然而，任何個體案例中的合適的有效濃度或有效量可由本領域的普通技術人員使用常規實驗手段來確定。而且，引入到本發明組合物或劑型中的PRG4蛋白和其它治療劑的精確有效濃度或有效量並不重要，只要該濃度在這樣的範圍內，該範圍足以允許溶液或配製物(formulation)立即施用從而遞送在治療有效範圍內的量的PRG4蛋白和其它活性劑。在某些實施方式中，PRG4蛋白的藥物有效濃度在10 lOOOOyg/mL，優選 50 500mg/mL，且更優選100 300mg/mL。如本文所使用的，包括眼可接受的緩和劑、 賦形劑、收斂劑、血管收縮劑和軟化劑的眼可接受的試劑完整地定義於Code of Federal Regulations 21CFR349 中。如本文所使用的術語「局部施用」以其常規含意使用，是指將包含PRG4蛋白和一種或多種眼可接受的試劑的組合物遞送到眼部。一般而言，局部施用通過用於滴眼劑或灌洗的液體配製物實現，並提供局部效果。在某些實施方式中，任何本文所述的藥物組合物包含以下的一種或多種或者將或可將前述眼可接受的試劑與以下的一種或多種組合羧甲基纖維素鈉(例如約0. 2 約 2. 5% w/v)、羥乙基纖維素(例如約0. 2 約2. 5% w/v)、羥丙甲纖維素(例如約0. 2 約 2. 5% w/v)、甲基纖維素(例如約0. 2 約2. 5% w/v)、右旋糖酐70 (例如約0. 1 % w/v)、 明膠(例如約0. 01% w/v)、甘油(例如約0. 2 約1 % w/v)、聚乙二醇300 (例如約0. 2 約1 % w/v)、聚乙二醇400 (例如約0. 2 約1 % w/v)、聚山梨醇酯80 (例如約0. 2 約1 % w/v)、丙二醇(例如約0. 2 約1 % w/v)、聚乙烯醇(例如約0. 1 約4% w/v)、聚乙烯吡咯酮(例如約0. 1 約2% w/v)、硫酸鋅(例如約0. 25% w/v)、無水羊毛脂(例如約1 約10% w/v)、羊毛脂(例如約1 約10% w/v)、輕質礦物油(例如，≤約50% w/v)、礦物油(例如，≤約50% w/v)、石蠟(例如，≤約5% w/v)、凡士林(例如，≤約100% w/v)、白色軟膏(例如，≤約100% w/v)、白凡士林(例如，≤約100% w/v)、白蠟(例如，≤約5% w/v)、黃蠟(例如，≤約5% w/v)、鹽酸麻黃鹼(例如約0. 123% w/v)、鹽酸萘唑啉(例如約 0. 01 約0. 03% w/v)、鹽酸脫羥腎上腺素(例如約0. 08 約0. 2% w/v)和鹽酸四氫唑啉 (例如約0. 01 約0. 05% w/v)。在某些實施方式中，本文所使用的百分量是按重量計的百分量。在其它實施方式中，包含與上面討論的一種或多種眼可接受的試劑組合的PRG4蛋白的本發明的藥物組合物還包含10 ΙΟΟΟΟΟμ g/mL、優選500 5000mg/mL的治療有效濃度的透明質酸或透明質酸鈉。此外，本發明的藥物組合物還包含10 10000 μ g/mL的一種或多種表面活性磷脂，這樣的表面活性磷脂包括但不限於，L- α - 二棕櫚醯磷脂醯膽鹼 (DPPC)、磷脂醯膽鹼(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)和鞘磷脂(Sp)、或其它中性和極性脂質。本發明的藥物組合物還可包含一種或多種藥物可接受的載體或媒介物 (vehicle)，其包括任何可接受的物質、和/或任何一種或多種本領域已知的添加劑。如本文所使用的術語「載體」或「媒介物」指適於局部藥物施用的載體物質。可用於本文的載體和媒介物包括任何本領域已知的這樣的物質，所述物質是無毒的，且不與組合物中的其它組分以有害的方式相互作用。本領域技術人員已知的多種添加劑可包括在所述組合物中。 例如，溶劑，包括相對少量的醇類，可用於溶解某些藥物物質。其它可任選的添加劑包括遮光劑、抗氧化劑、香味劑、著色劑、膠凝劑、增稠劑、穩定劑、表面活性劑等。還可以添加其它試劑，如抗微生物劑，以防止在儲藏時腐敗，即，抑制微生物如酵母和黴菌的生長。合適的抗微生物劑通常選自對羥基苯甲酸的甲酯和丙酯(即，尼泊金(paraben)甲酯和丙酯)、苯甲酸鈉、山梨酸、咪唑烷基脲(imidurea)及其組合。還可以將滲透促進劑和/或緩解刺激的添加劑包括在本發明的藥物組合物中。在某些實施方式中，本發明的藥物組合物在藥物可接受的載體中製備，所述藥物可接受的載體例如磷酸鹽緩衝鹽水或淚液電解質的滲透平衡的鹽溶液，所述淚液電解質包括以下的一種或多種約44% 約摩爾分數的氯化鈉、約8% 約14%摩爾分數的氯化鉀、約8% 約18%摩爾分數的碳酸氫鈉、約0% 約4%摩爾分數的碳酸氫鉀、約0% 約4%摩爾分數的氯化鈣、約0% 約4%摩爾分數的氯化鎂、約0% 約4%摩爾分數的檸檬酸三鈉、以及約0 % 約20 %摩爾分數的鹽酸或約0 % 約20 %摩爾分數的氫氧化鈉。在某些實施方式中，可配製藥物載體以產生約150 200mM的電解質水溶液。本發明中也涵蓋其它適用於局部施用的合適劑型，如軟膏劑(ointment)、乳膏劑(cream)、凝膠劑、糊劑等。在某些實施方式中，電解質在與PRG4組合時提供合適的滲透平衡，使得溶液為眼可接受的。本發明還提供在需要的個體中治療降低的或不良的眼部邊界潤滑、與其有關的症狀、或者與眼部潤滑不足有關的或導致眼部潤滑不足的疾病的方法，包括將包含治療有效量的PRG4蛋白的藥物組合物局部施用至有需要的個體的眼表。在一個實施方式中，本發明的方法包括局部施用包含治療有效量的PRG4蛋白的藥物組合物，所述PRG4蛋白懸浮於磷酸鹽緩衝的鹽水溶液或包含一種或多種電解質的眼可接受的平衡鹽溶液中。在其它實施方式中，本發明的方法包括局部施用包含PRG4蛋白的藥物組合物，其配製為包含一種或多種以上討論的其它眼可接受的試劑的眼可接受的配製物。如本文所使用的術語「治療」指降低症狀的嚴重程度和/或頻率、消除症狀和/或根本起因(underlying cause)、預防症狀和/或它們的根本起因的發生、以及改善或補救損傷。術語「治療」還涵蓋易感個體中病症的預防以及臨床上出現症狀的個體中病症的治療。在某些實施方式中，降低的眼部邊界潤滑是由眼部邊界迴路中增加的蒸發性淚液損失或不穩定的淚膜而導致的。這種降低的或不良的眼部邊界潤滑與以下有關淚液生成不足或蒸發性乾眼病、Sj0gren症候群、乾燥性角結膜炎(KCS)、雄激素缺乏症、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術、變態反應、減少的淚膜破裂時間、受損的淚膜、眼表病症、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度和老化。如上所討論的，增大的剪切應力導致淚膜不穩定性、蒸發性淚液損失、高摩爾滲透壓濃度、溶脹壓力變化以及剪切應力的反饋提高。增大的剪切應力還促進炎症、雄激素缺乏症和蛋白聚糖的表達減少。隨時間增大的剪切應力及其後遺症導致眼表處的邊界潤滑的損失。因此，本發明提供通過在眼表處補充和富集蛋白聚糖如PRG4蛋白的表達而減少剪切應力，從而預防或增加眼部邊界潤滑的方法。在整個本申請中，引用了多種出版物。所有這些出版物以及這些出版物所引用的那些參考文獻的公開內容均全部引入本申請作為參考，以更加全面地描述本發明所屬領域的現有技術。還應理解上述內容涉及本發明的優選實施方式，且對其可進行許多改變而不背離本發明的範圍。本發明由以下實施例進一步說明，所述實施例決不應解釋為對本發明範圍施加限制。相反，應清楚地理解，本領域的技術人員在閱讀了本文的說明書之後，會想到可訴諸各種其它實施方式、其改型方式和等同方式，而不背離本發明的精神和/或所附權利要求的範圍。根據下述對本發明優選實施方式的描述和權利要求書，本發明的其它特徵和優點將是明晰的。對本領域的技術人員而言，在閱讀了所附的說明書和實施例之後，本發明的這些以及許多其它變型和實施方式將是明晰的。實施例實施例1人角膜和結膜上皮細胞中PRG4mRNA的表達從男性和女性供體的角鞏膜邊緣分離人角膜上皮細胞。將細胞或者直接處理(η =8)，或者先在不含酚紅的角質形成細胞無血清培養基中培養(n =幻。在手術過程中獲得球結膜(n = 2)、結膜印記細胞樣品(n = 9)、培養後永生化的人結膜上皮細胞(n = 1)、 NOD小鼠淚腺(n = 5成體小鼠/性別，10腺體/樣品)和BALB/c小鼠瞼板腺(n = 7成體小鼠/性別，來自觀個眼瞼的腺體/樣品)。這些樣品通過主要使用RT-PCROi= 18人，全部小鼠)和Affymetrix GeneChips (n = 4人角膜)進行處理以進行PRG4mRNA的分析。用於PCR的PRG4引物跨越IlAp的內含子序列，以抑制汙染性的染色體DNA的擴增(表1)。 使用瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100Bioanalyzer篩選存在PRG4產物的擴增樣品。為了確 ilHirii1 子白勺身I， Massachusetts Eye and Ear Infirmary DNASequencing Center for Vision Research (Bonston, MA)使用 3100Genetic Analyzer 對來自角膜樣品(η = 2)、結膜上皮細胞(η = 1)和人肝臟標準物(n = 1)的PCR產物進行測序，並用GenBank資料庫的BLASTn檢索對所得數據進行分析。表1.為PRG4mRNA的RT-PCR分析設計的寡核苷酸引物
物種定向核苷酸序列(5，-3，)外顯子擴增子大小(bp)
人有義 GATGCAGGGTACCCCAAA(SEQ ID NO: 2)9-12526
反義 CAGACTTTGGATAAGGTCTGCC(SEQ ID NO: 3)
證實PRG4mRNA存在於所有人角膜和結膜上皮細胞以及印記細胞樣品中。通過DNA 序列分析確證了 PRG4PCR產物的身份(表2)。結果顯示PRG4在人角膜和結膜上皮細胞中轉錄。表2.來自人角膜、結膜和肝臟樣品的擴增子序列的鑑定
測序方向與人PRG4比對的鹼基對來自擴增子的總鹼基對BLASTn檢索身份人肝臟標準物
A正向495500人 PRG4A反向488491人 PRG4B正向496499人 PRG4B反向498500人 PRG4人角膜(24歲女性)A正向497499人 PRG4A反向490492人 PRG4B正向500504人 PRG4B反向498501人 PRG4
人角膜(51歲女性)
A正向498499人 PRG4A反向474489人 PRG4B正向496498人 PRG4B反向490491人 PRG4
人結膜上皮細胞
A正向 A反向 B正向 B反向
496 490
499 492
人 PRG4 人 PRG4
495 474
499 491
人 PRG4 人 PRG4對每個製備物的兩個不同的樣品(A和B)進行正向和反向測序。人角膜樣品為來自女性供體角鞏膜邊緣的上皮細胞。人PRG4的基因登錄號為NM_005807。實施例2通過添加PRG4 (潤滑素)降低體外摩擦對臨床相關界面如眼表-眼瞼和眼表-接觸鏡界面的體外摩擦試驗如下所述。目前缺乏能夠定量評價人造眼淚液的潤滑能力的臨床相關方法。對合成的(例如，膠乳和玻璃)或非眼部的「天然」表面(例如，臍帶靜脈區段)的摩擦試驗可促進在關節聯接/眨眼期間發生的一些，但很可能不是全部的分子相互作用。事實上，對使用非組織界面獲得的數據的相關性尚不清楚。已顯示「盤上環」(armulus-on-disk)旋轉試驗配置對於研究關節軟骨-軟骨界面處的邊界潤滑是理想的。邊界模式的潤滑通過不隨影響流體膜形成的因素(包括滑動速度和軸向載荷)變化的動摩擦來指示。這是因為發生表面與表面的接觸，並且表面結合分子有助於潤滑(通過減少摩擦和磨損)。發現邊界潤滑在眼表處是關鍵的和起作用的機理，這與在關節軟骨表面處一樣。因此，對之前為研究關節軟骨-軟骨界面處的邊界潤滑而開發並表徵的體外摩擦試驗進行改型以用於研究眼表-眼瞼和眼表-接觸鏡界面。為了確定邊界潤滑在眼表-眼瞼和眼表-接觸鏡界面佔優勢的試驗條件，檢查摩擦性質對軸向載荷和滑動速度的依賴性。從Lions Eye Bank of Alberta獲得正常的新鮮人眼表(切除的角膜，帶有 3mm的鞏膜)。將切除的角膜在4°C儲藏於Optisol-GS中並在胃Ml^H吏ffl。 University of Calgary Body Donation Program^H^tB 1-3 H ^ 眼瞼(年齡60-80歲)，並立即使用或使用前在-20°C在鹽水中儲藏最多2周。比較用潤滑劑由以下組成作為陰性對照的 Lens Plus Sterile Saline Solution (Advanced Medical Optics)；作為試驗潤滑劑的Systane Lubricant Eye Drops (Alcon Laboratories) > Refresh Tears Lubricant Eye Drops (Allergan)、Aquify⑧ Long Lasting Comfort Drops (CIBAVision)禾口 Blink ⑧ Tears Lubricant Eye Drops (Advanced Medical Optics)。摩擦試驗的示意圖示於圖6。通過將超級膠水(super glue)施用於鞏膜，將角膜眼表(605)固定在惰性非滲透性半剛性橡膠塞式圓柱體(603)(半徑r = 6mm)的球面端。 該塞式圓柱體(603)附接於力學試驗機(BoseELF 3200)的旋轉致動器，從而形成下關節面。環(601)(外徑=3. 2mm,內徑=1. 5mm)從眼瞼(604)衝壓，並附接於與軸向載荷(N) 和扭轉(τ)載荷單元耦合的線性致動器，從而形成上關節面。潤滑劑浴(60 通過在塞式圓柱體(603)的周圍緊固惰性管而形成。樣品首先在鹽水中進行試驗，然後在三C3)種試驗潤滑劑中的一種中進行試驗。 將潤滑劑浴用 0. 3ml填充，並使關節面與潤滑劑平衡。緩慢地(0.05mm/s)使樣品表面接觸並壓縮直至球形塞變平且整個環狀眼瞼表面與角膜(60 接觸。所得的法向應力(由軸向載荷根據Ν/π |r%K5-r2W5計算，單位為MPa)可通過使用不同剛度的橡膠塞而改變以模擬 5kPa的生理應力。試驗順序為在生理相關的有效滑動線速度veff = 30mm/s (其中 veff = coReff，ω為角頻率，Reff = 2. 4mm是通過對整個環狀接觸面積上的剪切應力分布進行積分而計算出的有效半徑)下通過旋轉+4周(rev)對樣品進行預處理而開始，並旋轉-4周而復原。然後通過以下對樣品進行試驗以veff = 30、10、1、0. 3然後30mm/s旋轉 +4周，接著立即旋轉-4周，每次旋轉之間的停留時間為12秒。然後以相反的旋轉方向重複該試驗順序。為評價眼表的潤滑性質，計算μ = τ/(ReffN)形式的兩個摩擦係數(μ)，其中如上所述τ是轉矩，Rrff是有效半徑，N是軸向載荷。反映對運動開始的阻力的靜摩擦係數μ 計算為剛開始旋轉後( 10°以內)μ的峰值。反映對穩態運動的阻力的平均動摩擦係數<μ 由第三和第四次完整試驗旋轉過程中平均的μ計算。在每次試驗中對+和-旋轉的μ 和<μ 進行平均以計算出對τ測量的潛在的方向影響。數據在20Hz的頻率下進行收集。在圖7中顯示將潤滑素(PRG4)以100 300 μ g/mL的濃度添加至角膜表面的結
19果。在所有速度下，潤滑素在眼瞼界面處對於動摩擦和靜摩擦均具有降低摩擦的效果。在濃度為透明質酸生理濃度的1/10下，潤滑素與含有透明質酸的Blink bars Lubrication Eye Drop類似。兩種潤滑劑組合時比各自單獨使用時更佳。圖8證實與Aquify 滴眼劑相比，在添加潤滑素後的第一分鐘期間測得的體外角膜/眼瞼動摩擦減少。在各試驗之間，使用鹽水從眼表徹底清洗潤滑劑。當將Aquify (具有透明質酸)與潤滑素組合使用時，協同效應(與單獨的任一者相比μ a降低)明顯。鹽水重複(saline repeat)低於最初的鹽水對照。這顯示即使在用鹽水清洗後仍保留潤滑素的效果，這表明分子與眼表結合，且與單獨的透明質酸鈉相比，潤滑素顯示出較優的保留時間。圖9證實與Aquify 滴眼劑相比，在添加潤滑素後的第五分鐘期間測得的體外角膜/眼瞼動摩擦減少。當將Aquify (具有透明質酸)與潤滑素組合時，協同效應(與單獨的任一者相比μ a降低)明顯。在5分鐘後，Aquify 的摩擦係數回到與鹽水在統計學上相等，而潤滑素的摩擦係數保持較低，潤滑素和透明質酸的組合也保持較低。圖10顯示在添加潤滑素後，動摩擦係數隨時間降低。同樣，持續的降低表明與眼表結合O實施例3體內眼部邊界潤滑不足的治療通過以下方式以及客觀體徵(sign)檢查抱怨眼表刺激的患者的眼部潤滑或與眼部潤滑不足有關的疾病測量在McMormies問卷調查中多於兩個陽性應答、在Ocular Surface Disease Index(OSDI)中得分大於 5 的症狀，或通過 Visual Analog kale 中一些症狀的證據，所述客觀體徵包括以下中的一種或多種減少的淚膜破裂時間(少於 10 秒)、大於308m0SmS/L的差的側淚液彎月面摩爾滲透壓濃度、低khirmer試紙值(少於 ^ 10mm)、螢光素鈉角膜和結膜染色(得分>0，具有多個巨斑(macropimctate))、得自印記細胞的大量碎片、無論以何種方式確定的瞼板腺功能障礙、接觸鏡在眨眼後的移位率減少、在施加一系列壓力衝擊後接觸鏡的時空傳遞函數改變、眨眼後幹涉計量的淚膜舒張率減少、促炎細胞因子的濃度增加、降低的乳鐵蛋白或溶菌酶濃度、或者眨眼後點擴展函數脫散(decoherence)率增力口。患者在各隻眼睛的表面施用1到2滴含有懸浮於眼可接受的平衡鹽溶液中的 200 μ g/ml PRG4的溶液。指示患者閉眼10秒鐘。隨後的訪問可追蹤到差的側淚液摩爾滲透壓濃度減少，增加的淚膜破裂時間，或其它之前提及的體徵。特別是如果淚膜摩爾滲透壓濃度從異常值(可能為330m0SmS/L)減少到更正常的值(可能為304m0SmS/L)，可認為對眼表潤滑的治療性調節和補充是成功的。參考文獻1. G. D. Jay, Curr Opin Orthop 15,355(2004).2. D. A. Swann, R. B. Hendren, Ε. L. Radin, S. L. Sotman, Ε. Α. Duda, Arthritis Rheum 24,22(1981).3. G. D. Jay, D. Ε. Britt, D. -J. Cha, J Rheumatol 27,594(2000).4. G. D. Jay, Connect Tissue Res 28,71(1992).
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權利要求
1.一種適合於局部施用至眼表的藥物組合物，其包含懸浮在眼可接受的平衡鹽溶液中的治療有效濃度的PRG4。
2.權利要求1的藥物組合物，其包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑和眼可接受的軟化劑。
3.權利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含10 10，000μ g/mL的治療有效濃度的PRG4。
4.權利要求1的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含50 500μ g/mL的治療有效濃度的raG4。
5.權利要求1的藥物組合物，包含治療有效濃度的透明質酸鈉或透明質酸。
6.權利要求5的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含10 100，000μ g/mL的治療有效濃度的透明質酸鈉或透明質酸。
7.權利要求5的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含500 5000μ g/mL的治療有效濃度的透明質酸鈉或透明質酸。
8.權利要求1的藥物組合物，其包含治療有效濃度的選自以下的表面活性磷脂: L-α - 二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂。
9.權利要求8的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含10 10，000μ g/mL的治療有效濃度的表面活性磷脂。
10.權利要求1的藥物組合物，其中所述眼可接受的平衡鹽溶液包含至少三種不同的選自以下的電解質磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氯化鈣、氯化鎂、醋酸鈉、 檸檬酸鈉、鹽酸和氫氧化鈉。
11.權利要求1的藥物組合物，其中所述PRG4具有50kDa 400kDa的平均摩爾質量。
12.權利要求1的藥物組合物，其中所述PRG4包括潤滑片段、其多聚體或同源物。
13.權利要求1的藥物組合物，其中所述PRG4是重組PRG4蛋白或其功能片段。
14.權利要求1的藥物組合物，其中所述PRG4是經純化的天然存在的PRG4蛋白。
15.在需要治療的個體中治療眼部潤滑不足或與其有關的症狀的方法，包括對所述需要治療的個體的眼表局部施用包含治療有效濃度的PRG4的藥物組合物。
16.權利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與眼可接受的配製物組合施用，所述眼可接受的配製物包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑、眼可接受的軟化劑和眼可接受的電解質。
17.權利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與包含治療有效濃度的透明質酸鈉或透明質酸的眼可接受的溶液組合施用。
18.權利要求17的方法，其中所述眼可接受的溶液包含10 100，000μ g/mL的治療可接受濃度的透明質酸鈉或透明質酸。
19.權利要求17的方法，其中所述眼可接受的溶液包含500 5，000μ g/mL的治療可接受濃度的透明質酸鈉或透明質酸。
20.權利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與包含治療有效濃度的表面活性磷脂的眼可接受的溶液組合施用，所述表面活性磷脂選自L- α - 二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂。
21.權利要求20的方法，其中所述眼可接受的溶液包含10 10，000μ g/mL的治療有效濃度的表面活性磷脂。
22.權利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與至少包含磷酸鈉和氯化鈉的磷酸鹽緩衝鹽水溶液組合施用。
23.權利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與眼可接受的平衡鹽溶液組合施用，所述眼可接受的平衡鹽溶液包含一種或多種選自以下的電解質氯化鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氯化鈣、氯化鎂、檸檬酸三鈉、鹽酸和氫氧化鈉。
24.權利要求15的方法，其中所述PRG4是重組PRG4蛋白或其功能片段。
25.權利要求15的方法，其中所述PRG4是經純化的天然存在的PRG4蛋白。
26.權利要求15的方法，其中將包含PRG4的所述藥物組合物與包含治療有效濃度的透明質酸鈉或透明質酸和表面活性磷脂的眼可接受的溶液組合施用，所述表面活性磷脂選自 L-α - 二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺和鞘磷脂。
27.權利要求15的方法，其中所述需要治療的個體具有與以下有關的眼部邊界潤滑不足淚液生成不足或蒸發性乾眼病、Sj0gren症候群、乾燥性角結膜炎、雄激素缺乏症、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術、變態反應、減少的淚膜破裂時間、受損的淚膜、變態反應、眼表病症、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度、老化或其組合。
28.用於治療個體中與眼部潤滑不足有關的或引起眼部潤滑不足的疾病、或者其症狀的方法，所述方法包括向所述個體的眼表局部施用包含治療有效濃度的PRG4的藥物組合物。
29.權利要求觀的方法，其中包含PRG4的所述藥物組合物與眼可接受的配製物組合施用，所述眼可接受的配製物包含一種或多種選自以下的眼可接受的試劑眼可接受的緩和劑、眼可接受的賦形劑、眼可接受的收斂劑、眼可接受的血管收縮劑、眼可接受的軟化劑、眼可接受的電解質、眼可接受的透明質酸鈉或透明質酸以及眼可接受的表面活性磷脂。
30.權利要求觀的方法，其中所述疾病選自淚液生成不足或蒸發性乾眼病、Sj0gren症候群、乾燥性角結膜炎、雄激素缺乏症、瞼板腺病、雌激素替代療法、接觸鏡佩戴、屈光手術、 變態反應、減少的淚膜破裂時間、受損的淚膜、變態反應、眼表病症、淚膜中和眼表處提高的蛋白酶水平、慢性炎症、高摩爾滲透壓濃度、老化及其組合。
全文摘要
本發明公開了用於治療眼部邊界缺陷、與其有關的症狀、或者不良疾病的藥物組合物及使用其的方法。所述組合物包含人PRG4蛋白、潤滑片段、其同源物或同種型，並且可任選地包含一種或多種選自以下的試劑緩和劑、賦形劑、收斂劑、血管收縮劑、軟化劑、透明質酸鈉、透明質酸、或表面活性磷脂。
文檔編號A61K31/16GK102164593SQ200980126381
公開日2011年8月24日 申請日期2009年4月8日 優先權日2008年5月7日
發明者坦寧·A·施密特, 戴維·A·沙利文, 班傑明·沙利文 申請人:司科彭斯眼部研究學會