酶切法製備寡聚透明質酸鹽的方法及所得寡聚透明質酸鹽和其應用的製作方法
2023-07-29 23:11:06
專利名稱：酶切法製備寡聚透明質酸鹽的方法及所得寡聚透明質酸鹽和其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶切法製備寡聚透明質酸鹽的工藝過程，特別是涉及應用芽孢桿菌來源的透明質酸酶降解透明質酸或其鹽製備寡聚透明質酸鹽的方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
透明質酸(hyaluronic acid, HA)是一種酸性黏多糖，由N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重複單位通過β - (I — 4)糖苷鍵和β - (I — 3)糖苷鍵構成的無分支高分子糖胺聚糖，存在於動物組織細胞間質和某些細菌的莢膜中。透明質酸廣泛用於醫藥、化妝品、食品等領域，分子量一般為IO5IO7Da (道爾頓)。寡聚透明質酸是指分子量小於IOkDa的透明質酸。研究表明，分子量對透明質酸的活性有很大影響，不同分子量的透明質酸甚至表現出截然相反的活性(郭學平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中國生化藥物雜誌，2003，24 (3)
148-150)。目前，透明質酸降解的方法主要有物理降解、化學降解、生物降解三大類，物理降解法很難將透明質酸降至IOkDa以下，化學降解法和酶法可以製備寡聚透明質酸，但化學降解法製備寡聚透明質酸，需要較劇烈的反應條件(如較高的酸鹼濃度等)才能達到最大程度的降解。此時，不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖(葡糖醛酸和乙醯氨基葡糖)殘基的結構也遭到破壞，如乙醯基被水解掉，單糖六元環斷裂等，對製得的寡聚透明質酸的生物活性產生一定影響(郭學平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中國生化藥物雜誌，2003,24 (3):148-150)。化學降解法製備的寡聚透明質酸還容易發生褐變(專利申請號201110008110. 9)，生產過程會汙染環境。而酶解法降解透明質酸時，只斷裂單糖分子間的糖苷鍵，不會對其他結構造成破壞，而且酶解法反應條件溫和，不用強酸強鹼，製備的寡聚透明質酸不會發生褐變，不會造成環境汙染，因此酶解法最適合製備寡聚透明質酸。降解透明質酸所用的酶主要是透明質酸酶，根據作用機制的不同，可以分為3類
(I)內切-β -N-乙醯氨基葡糖苷酶，為水解酶，作用於β -I, 4糖苷鍵，終產物主要為四糖，也可作用於軟骨素或硫酸軟骨素，並有轉糖苷酶活性。哺乳動物來源的以及動物毒液來源的屬於此類。(2)水蛭、十二指腸蟲來源的透明質酸酶，為內切-β-葡糖苷酸酶，作用於β -I, 3糖苷鍵，也是水解酶，主要降解產物是四糖，特異性降解透明質酸；(3)細菌透明質酸酶，也稱為透明質酸裂解酶(hyaluronate lyase),作用於β_1，4糖苷鍵,通過β -消去機製得到4，5_不飽和雙糖(Kreil, G, Hyaluronidases—a group of neglected enzymes,Protein Sci, 1995， 4(9): 1666-1669)。目前工業生產寡聚透明質酸或其鹽的方法是化學降解法，由於含透明質酸酶的動物組織來源有限，有文獻報導的微生物來源透明質酸酶發酵液單位酶活較低，不可能大規模製備透明質酸酶，也就不可能用酶法大規模生產寡聚透明質酸或其鹽
發明內容
本發明的目的是提供一種酶切法大規模生產寡聚透明質酸鹽的方法，本發明採用芽孢桿菌發酵得到的透明質酸酶對高分子量透明質酸或其鹽進行降解，酶活高、條件溫和、操作簡單、無環境汙染。針對現今生物降解透明質酸或其鹽所需降解酶活性低、來源有限、成本高的缺點，發明人從空氣中分離得到了一種產透明質酸酶的芽孢桿菌sp. )A50，該菌種已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏，保藏號為CGMCCNO. 5744，保藏時間為2012年2月8日。該芽孢桿菌UaciJJm sp. )A50 CGMCC NO. 5744的獲取過程為將裝有富集培養基的平皿打開蓋，放置於空氣中，收集空氣中沉降菌，約Ih後,蓋上蓋,置於25 40°C培養箱中有氧培養，培養24h後，將分離得到的單菌落接種於篩選培養基中，25 40°C，150rpm，有氧培養12 16h，採用中國藥典方法測定透明質酸酶活力，選擇酶活力最高的菌種作為本發明的菌種，菌種酶活力可達105IU/mL。上述所採用的各培養基組成如下
富集培養基(IOOmL):蛋白腖 O. 2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2. 0g，K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g，MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g，透明質酸鈉 O. 01 lg，瓊脂粉 2. Ogo篩選培養基(IOOmL):蛋白腖O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3H20O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g，透明質酸鈉 O. 01 lg。篩選所得的芽孢桿菌UaciJJm sp. )A50 CGMCC NO. 5744具有如下的特徵
I、形態特徵
菌體杆狀，單個或鏈狀。菌落乳白色，有皺褶。2、分子生物學特徵
菌種A50的16S rDNA序列如SEQ NO: I所示。本發明菌種適於在25 40°C下進行有氧培養，該菌種可以用來生產透明質酸酶(SP芽孢桿菌透明質酸酶，下同)，方法是將芽孢桿菌sp. ) A50 CGMCC No. 5744經斜面培養、種子培養、發酵培養、離心、硫酸銨分級沉澱、超濾製得透明質酸酶。具體包括以下步驟
(1)將芽孢桿菌UaciBmsp. )A50 CGMCC No. 5744菌種進行斜面培養，得斜面菌種；
(2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25 40°C、10(T200rpm的條件下培養10 24h，得種子液；
(3)將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25 40°C、10(T300rpm的條件下培養12 24h，得透明質酸酶發酵液；
(4)離心分離發酵液，取上清液，將上清液用硫酸銨分級沉澱出透明質酸酶；
(5)將步驟(4)沉澱出來的透明質酸酶溶於磷酸鹽緩衝液中，超濾除去小分子雜質，得純化的透明質酸酶。上述生產透明質酸酶的方法中，步驟(4)中發酵液離心的轉速為1000(Tl5000rpm，離心時間為l(T20min，硫酸銨分級沉澱的步驟是將上清液中加入硫酸銨，使其質量體積濃度為20%，過濾除去產生的沉澱，然後繼續加入硫酸銨，至其質量體積濃度為35%為止，得到的沉澱即為透明質酸酶。這裡所述的質量體積濃度的意思是每ImL上清液中含有硫酸銨的質量(g)，下同。
上述生產透明質酸酶的方法中，步驟(5)中磷酸鹽緩衝液的pH優選為5. 8 6. 8，濃度優選為5 50mmol/L，在實際應用中可酌情變動，超濾所用的為超濾膜。超濾膜的截留分子量為3 XlO4Da15上述生產透明質酸酶的方法中，每IOOmL斜面培養基中含有以下成分蛋白腖O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖O. 5 I. 5g，瓊脂粉2. 0g, pH調至6. 0 8· 0，斜面培養的溫度為25 40。。。上述生產透明質酸酶的方法中，每IOOmL種子培養基中含有以下成分蛋白腖O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖O. 5 I. 5g, pH 調至 6. 0 8· O。上述生產透明質酸酶的方法中，每IOOmL發酵培養基中含有以下成分蛋白腖O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3Η20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖
O. 5 I. 5g, Tween80 O. 05mL, pH 調至 6. 0 8· O。上述生產透明質酸酶的方法中，斜面種子培養和發酵培養的接種量可以通過現有技術得到，不需付出創造性的勞動。種子培養基的接種量能夠達到發酵培養所需接種量的種子液即可，發酵培養基的接種量一般在3 15%即可。上述生產透明質酸酶的方法中，可採用鹽酸、硫酸或磷酸中的一種或一種以上調節斜面培養基、種子培養基和發酵培養基PH。本發明芽孢桿菌生產的透明質酸酶在發酵液中的酶活可達到Ixio5Ixio5IU/mL,大大高於文獻報導中的最高酶活(I. 3 X 102IU/mL),且該酶熱穩定性和pH穩定性高，用其降解高分子透明質酸，用來製備寡聚透明質酸，成本顯著降低，可用於大規模生產，解決了動物來源的透明質酸酶成本高的問題，在生化研究領域及寡聚透明質酸的生產方面有廣闊的應用前景。下面介紹以芽孢桿菌發酵得到的透明質酸酶(即芽孢桿菌透明質酸酶，下同)生物降解透明質酸或其鹽生產寡聚透明質酸鹽的方法。該方法包括配製透明質酸或其鹽溶液、酶解、滅活、過濾、沉澱、脫水乾燥步驟。一種酶切法製備寡聚透明質酸鹽的方法，其特徵是以芽孢桿菌sp.)A50 CGMCC NO. 5744發酵培養得到的芽孢桿菌透明質酸酶對透明質酸或其鹽進行降解，包括以下步驟
①配製透明質酸或其鹽溶液向純化水中加入分子量大於IOkDa的透明質酸或其鹽，配製成質量體積濃度為廣30%的溶液；所述質量體積濃度的意思是透明質酸或其鹽的質量/溶液的體積，單位為g/mL ；
②酶解調節步驟①中溶液的溫度為2(T48°C、pH為Γ9，然後向其中加入芽孢桿菌透明質酸酶，將透明質酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液；
③滅活將酶解液在5(T90°C下保持l(T60min，對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活；
④過濾向滅活後的酶解液中加入易溶性無機鹽，攪拌至完全溶解，然後用孔徑為O. 45Mm的濾膜過濾，得濾液，每IOOmL酶解液中加入O. f IOg的易溶性無機鹽；
⑤沉澱向步驟④的濾液中加入濾液體積3 20倍的醇或酮，混合均勻，析出寡聚透明質酸鹽沉澱；
⑥脫水乾燥將步驟⑤中的寡聚透明質酸鹽沉澱分離出來，用有機溶劑脫水，然後真空乾燥，得寡聚透明質酸鹽。上述方法中，所用的芽孢桿菌透明質酸酶即芽孢桿菌(feci77m sp. ) A50 CGMCCNO. 5744發酵得到的透明質酸酶比活為8Xl(Tl. 5X 107IU/mg，酶的加入量為每Ikg透明質酸或其鹽配製的溶液中加入2 X 1(Τ5 X IO7IU的純化酶。透明質酸酶對透明質酸有很好的降解性，只要加入合適的透明質酸酶，即可以得到任意小分子量的透明質酸，因此在酶解時，控制時間的長短即可得到所需分子量的透明質酸。上述步驟①中，所述的透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽或鋅鹽。上述步驟②中，採用酸或鹼調節pH至4 9，所述酸為鹽酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述鹼為氫氧化鈉或氫氧化鉀。
上述步驟④中，所述易溶性無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽或鎂鹽，優選鈉、鉀、鈣、鋅、鎂的氯化物、硫酸鹽、硝酸鹽。此外，步驟④中以濾膜過濾酶解液，濾去透明質酸酶等雜質，提高了產物的純度，所選濾膜為本領域常用的過濾膜即可，只要滿足孔徑的要求都能用於本發明，濾膜的孔徑為O. 45ΜΠ1，材質可以是纖維素酯類、聚碸類、聚醯胺類。上述步驟⑤中，所述醇或酮優選為乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或異丙醇。上述步驟⑥中，脫水所用的有機溶劑為與水互溶的有機溶劑，將寡聚透明質酸鹽沉澱加入此有機溶劑中可以帶走沉澱中的大部分水，優選的有機溶劑為酮或醇，最優選的為常用的乙醇、丙酮。上述步驟②中，優選的酶解溫度為35 45°C，優選的酶解pH為5. 5^7. 5。上述方法中，所得寡聚透明質酸鹽為白色粉末或顆粒，通過調節反應條件，例如透明質酸酶的加入量、酶解時間等，可以得到IO4Da以下的不同分子量的寡聚透明質酸鹽，在實際生產和應用中，比較常用的寡聚透明質酸鹽的分子量在300(Tl04Da範圍，此範圍端點值3000Da可以包括，也可以不包括，而端點值IO4Da不包括，可以通過調節反應條件得到該範圍內任意分子量的寡聚透明質酸鹽，例如分子量可以是400(Tl0000Da (不包括端點IOOOODa),也可以是3000 9500 Da(不包括端點3000Da)，也可以是320(T9500Da，也可以是400(T9500Da 等。上述方法中，所得寡聚透明質酸鹽含量大於95%，其O. 1%水溶液的pH在6 8之間，紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致，性能良好，結構未被破壞。本發明介紹了酶切法製備寡聚透明質酸鹽的工藝，該工藝利用芽孢桿菌產生的透明質酸酶降解透明質酸或其鹽，經過除酶、醇或酮沉澱、脫水乾燥而成，此法操作簡單，條件溫和，對產品結構無破壞，無環境汙染，而且發酵來源的透明質酸酶成本低，適合大規模工業化生產，製備的寡聚透明質酸鹽具有透皮吸收性好、純度高、無細胞毒性、抗氧化能力強等優點，可用在化妝品、食品及醫藥領域，前景廣闊。保藏信息
本發明芽孢桿菌QBacillus sp. ) A50已於2012年2月8日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 5744。
圖I為不同方法製備的寡聚透明質酸鹽的紅外圖譜，其中a為比較例I寡聚透明質酸鹽的紅外圖譜，b為實施例8製得的寡聚透明質酸鹽的紅外圖譜，c為透明質酸鈉的歐洲藥典標準圖譜；
圖2為寡聚透明質酸鹽的透皮吸收比例 圖3為寡聚透明質酸鹽的DPPH自由基清除能力 圖4為寡聚透明質酸鹽的還原能力圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例、比較例和實驗例，進一步詳細說明本發明。如無特別說明，下述實施例中硫酸銨的濃度為質量體積濃度。下述實施例中，寡聚透明質酸鹽的分子量測定採用Laurent法，含量測定採用HPLC法，寡聚透明質酸與普通透明質酸都是由N-乙醯氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖 重複單位構成的，因此它們的含量等於雙糖的含量，可以用芽孢桿菌透明質酸酶將寡聚透明質酸或普通透明質酸降解成雙糖，通過HPLC法測定雙糖含量，得到寡聚透明質酸鹽或普通透明質酸的含量。本發明降解透明質酸或其鹽所用的透明質酸酶(即芽孢桿菌透明質酸酶，下同)是由芽孢桿菌A50發酵得透明質酸酶發酵液，然後經離心、硫酸銨分級沉澱、超濾等步驟得到的。其製備過程是取斜面菌種(芽孢桿菌心sp. )A50 CGMCC NO. 5744)接種於已滅菌的種子培養基中，25 40°C、10(T200rpm下培養l(T24h，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為3 15%，25^400C、10(T300rpm下培養12 24h，發酵過程中用酸將pH維持在6. (Γ8. O,發酵結束得透明質酸酶發酵液，發酵液經1000(Tl5000rpm離心l(T20min得上清液，上清液用硫酸銨沉澱，取硫酸銨在上清液中的濃度為20°/Γ35%時所得的透明質酸酶沉澱，溶於磷酸鹽緩衝液中，最後經3 X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得酶解用透明質酸酶。所用的培養基為
斜面培養基(IOOmL):蛋白腖 O. 2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2. 0g，K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g,MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖O. 5 I. 5g，瓊脂粉2. 0g，pH調至6. 0 8· 0，斜面培養的溫度為 25 40°C。種子培養基(IOOmL):蛋白腖0.2 2.(^，酵母粉0.2 2.(^，1(2冊04*3!120 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖 O. 5 I. 5g, pH 調至 6. 0 8· O。發酵培養基(IOOmL):蛋白腖O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3Η20O. 05 O. 15g,MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖 O. 5 I. 5g,Tween80 O. 05mL，pH調至 6. 0 8· O。採用中國藥典方法測定由以上方案製得的發酵液中的透明質酸酶活力在1\105 3父10加/1^，純化後的透明質酸酶比活為8Χ 106 1. 5Χ 107IU/mg。下面提供幾個製備透明質酸酶的優選實施例
實施例I
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白腖 O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g, MgSO4 · 7H20O. 05g，葡萄糖0. 5g，瓊脂粉2. 0g，用鹽酸將pH調至6. O。種子培養基組成(IOOmL):蛋白腖O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 · 7H20 0.05g，葡萄糖O. 5g，用鹽酸將pH調至6.0。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白腖O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 05g,葡萄糖 0. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌UaciJJw1S sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種於已滅菌的種子培養基中，25°C，150rpm培養24h，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，250C，200rpm培養24h，發酵過程中用硫酸將pH維持在6. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經IOOOOrpm離心20min得上清液，將上清液中加入硫酸銨，使其濃度為20%，過濾除去產生的沉澱，然後繼續加入硫酸銨，至其濃度為35%為止，取得到的沉澱即為透明質酸酶，將得到的透明質酸酶沉澱溶於磷酸鹽緩衝液(pH5.8，5mmol/L)中，最後經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化後透明質酸酶。採用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為1.0X105IU/mL，純化後的透明質酸酶比活為8X106IU/mg。實施例2
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白腖 I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. lg, MgSO4 · 7H20O. lg，葡萄糖l.Og，瓊脂粉2. 0g，用磷酸將pH調至7. O。種子培養基組成(IOOmL):蛋白腖I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. Ig,MgSO4 · 7H20 O. lg，葡萄糖I. 0g，用磷酸將pH調至7. O。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白腖I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. Ig,MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 I. 0g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌UaciJJw1S sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種於已滅菌的種子培養基中，30°C, IOOrpm培養15h，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，350C，300rpm培養16h，發酵過程中用硫酸將pH維持在7. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經15000rpm離心IOmin得上清液，上清液用硫酸銨沉澱，取得到的透明質酸酶沉澱溶於磷酸鹽緩衝液(PH6. 0，lOmmol/L)中，最後經3X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化後透明質酸酶。採用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為3. OX IO5IU/mL，純化後的透明質酸酶比活為I. 5X107IU/mg。實施例3
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白腖 I. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 15g，MgSO4 · 7H200. 15g，葡萄糖1.5g，瓊脂粉2. 0g，用硫酸將pH調至8.0。種子培養基組成(IOOmL):蛋白腖I. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖I. 5g，用硫酸將pH調至8. 0。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白腖0. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. lg,MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌UaciJJw1S sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種於已滅菌的種子培養基中，35°C,200rpm培養13h，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，400C，IOOrpm培養12h，發酵過程中用鹽酸將pH維持在7. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經12000rpm離心15min得上清液，上清液用硫酸銨沉澱，取得到的透明質酸酶沉澱溶於磷酸鹽緩衝液(pH6. 2,5mmol/L)中，最後經3 X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化後透明質酸酶。採用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為I. 2X IO5IU/mL，純化後的透明質酸酶比活為I. 0X107IU/mg。實施例4
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白腖 2. 0g，酵母粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20O. 05g，葡萄糖I. Og,瓊脂粉2. Og,用硫酸將pH調至6. 5。種子培養基組成(IOOmL):蛋白腖2. 0g，酵母粉 O. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖I. 0g，用硫酸將pH調至6. 5。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白腖I. 5g，酵母粉 O. 2g，K2HPO4 · 3Η200· 15g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種於已滅菌的種子培養基中，40°C，180rpm培養10h，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，360C，280rpm培養15h，發酵過程中用磷酸將pH維持在8. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經IOOOOrpm離心20min得上清液，上清液用硫酸銨沉澱，取得到的透明質酸酶沉澱溶於磷酸鹽緩衝液(PH6. 4，10臟01/1)中，最後經3\1040&的超濾膜除去小分子雜質，得純化後透明質酸酶。採用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為 I. 5X IO5IU/mL，純化後的透明質酸酶比活為I. 2X107IU/mg。實施例5
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白腖 O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g，MgSO4 · 7H20
0.lg,葡萄糖0. 5g，瓊脂粉2. 0g，用磷酸將pH調至7. 5。種子培養基組成(IOOmL):蛋白腖O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g，MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖0. 5g，用磷酸將pH調至7. 5。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白腖2.0g，酵母粉0. 2g，Κ2ΗΡ04· 3H20 0. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 05g,葡萄糖 0. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種於已滅菌的種子培養基中，36°C，120rpm培養14h，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，300C，180rpm培養20h，發酵過程中用磷酸將pH維持在7. 5，發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經IOOOOrpm離心20min得上清液，上清液用硫酸銨沉澱，取得到的透明質酸酶沉澱溶於磷酸鹽緩衝液(PH6. 6，20mmol/L)中，最後經3 X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化後透明質酸酶。採用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為2. OX IO5IU/mL，純化後的透明質酸酶比活為I. 3X107IU/mg。實施例6
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白腖 I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20
0.15g，葡萄糖1.5g，瓊脂粉2. 0g，用鹽酸將pH調至7. O。種子培養基組成(IOOmL):蛋白腖I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. Ig,MgSO4 · 7H20 O. 15g，葡萄糖I. 5g，用鹽酸將pH調至7. O。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白腖I. 5g，酵母粉 O. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌UaciJJw1S sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種於已滅菌的種子培養基中，32°C, 150rpm培養18h，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，280C，200rpm培養22h，發酵過程中用鹽酸將pH維持在8. O,發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經15000離心IOmin得上清液，上清液用硫酸銨沉澱，取得到的透明質酸酶沉澱溶於磷酸鹽緩衝液(pH6. 8,30mmol/L)中，最後經3 X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化後透明質酸酶。採用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為I. 8 X IO5IU/mL，純化後的透明質酸酶比活為I. 2X107IU/mg。實施例7
斜面培養基組成(IOOmL):蛋白腖 2. 0g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g, MgSO4 · 7H20
0.15g，葡萄糖0. 5g，瓊脂粉2. 0g，用磷酸將pH調至7. 0。種子培養基組成(IOOmL):蛋白腖2. 0g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 ·7Η20 O. 15g，葡萄糖O. 5g，用磷酸將pH調至7. O。發酵培養基組成(IOOmL):蛋白腖O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3Η200· 15g，MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 I. Og, Tween80 0. 05mL。取斜面菌種(芽孢桿菌sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接種於已滅菌的種
子培養基中，30°C,200rpm培養20h，然後將種子液接種於已滅菌的發酵培養基中，接種量為10%，340C，220rpm培養14h，發酵過程中用磷酸將pH維持在7. 5，發酵生產得到透明質酸酶發酵液，發酵液經12000rpm離心15min得上清液，上清液用硫酸銨沉澱，取得到的透明質酸酶沉澱溶於磷酸鹽緩衝液(PH5. 9，50mmol/L)中，最後經3 X IO4Da的超濾膜除去小分子雜質，得純化後透明質酸酶。採用中國藥典方法測定發酵液中透明質酸酶活力為I. 2X IO5IU/mL,純化後的透明質酸酶比活為8X 106IU/mg。本發明透明質酸酶活性高，熱穩定性和pH穩定性好，能夠滿足工業化大批量降解透明質酸所需的酶用量，且酶的製備過程簡單、條件溫和，成本低，解決了化學降解汙染環境、生物降解酶來源有限、活性低、價格高的缺陷。下面列舉以本發明比酶活在SXlO6^l. 5 X 107IU/mg之間的透明質酸酶酶切法製備寡聚透明質酸鹽的優選實施例。實施例8
向Im3不鏽鋼溶解罐中加入Im3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為3 X IO6Da的透明質酸鈉10kg，待完全溶解後，用冰乙酸調節pH為4. 0，並升溫至20°C，加入4X IO8IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至所需分子量時，將溫度升高至50°C，維持60min，加入IkgNaCl，用O. 45Mfli的混合纖維素濾膜過濾酶解液，然後用20m3的乙醇沉澱，得到透明質酸鈉沉澱，該沉澱用乙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為白色顆粒，含量96. 8%，分子量8. 6kDa，pH6. 8，其紅外圖譜見圖1，與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例9
向Im3不鏽鋼溶解罐中加入Im3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為2 X IO4Da的透明質酸鉀300kg，待完全溶解後，用氫氧化鉀調節pH為9. 0，並升溫至48°C，加入
1.35X IOltlIU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至所需分子量時，將溫度升高至90°C，維持IOmin,加入100kg KCl,用O. 45Mm的聚碸濾膜過濾酶解液,然後用5m3的丙酮沉澱,得到透明質酸鉀沉澱，該沉澱用丙酮脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鉀。該寡聚透明質酸鉀為白色粉末，含量98. 8%，分子量3. 2kDa，pH6. 5，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例10
向Im3不鏽鋼溶解罐中加入Im3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為
I.6 X IO6Da的透明質酸鈉20kg，待完全溶解後，用氫氧化鈉調節pH為8. 0，並升溫至40°C，加入I. 2X IO9IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至所需分子量時，將溫度升高至60°C，維持60min,加入50kg NaCl,用O. 45Mm的尼龍濾膜過濾酶解液,然後用IOm3的丙醇沉澱,得到透明質酸鈉沉澱，該沉澱用丙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為白色粉末，含量97. 6%，分子量6. 2kDa，pH7. 1，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例11
向Im3不鏽鋼溶解罐中加入Im3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為8 X IO5Da的透明質酸鈣60kg，待完全溶解後，用冰乙酸調節pH為7. 0，並升溫至35°C，加入
2.4X IO9IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至所需分子量時，將溫度升高至70°C，維持30min，加入35kg CaCl2,用O. 45Mm的聚醚碸濾膜過濾酶解液,然後用3m3的異丙醇沉澱,得到透明質酸鈣沉澱，該沉澱用異丙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈣。該寡聚透明質酸鈣為白色粉末，含量96. 6%，分子量5. 6kDa，pH6. 5，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例12 向Im3不鏽鋼溶解罐中加入Im3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為2 X IO5Da的透明質酸鈉100kg，待完全溶解後，用硫酸調節pH為6. 0，並升溫至25°C，加入4X IO9IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至所需分子量時，將溫度升高至80°C，維持20min，加入60kgNaCl，用O. 45Mfli的聚醚碸濾膜過濾酶解液，然後用6m3的甲醇沉澱，得到透明質酸鈉沉澱，該沉澱用甲醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為白色顆粒，含量98. 7%，分子量7. 6kDa，pH7. 3，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例13
向Im3不鏽鋼溶解罐中加入I m3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為IO5Da的透明質酸鋅200kg，待完全溶解後，用鹽酸調節pH為5. 0，並升溫至20°C，加入8X IO9IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至所需分子量時，將溫度升高至55°C，維持50min，加入20kgZnCl2，用O. 45ΜΠ1的硝化纖維素濾膜過濾酶解液，然後用4. 5m3的乙醇沉澱，得到透明質酸鋅沉澱，該沉澱用乙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鋅。該寡聚透明質酸鋅為白色顆粒，含量96. 8%，分子量9. IkDa, pH6. 8，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例14
向Im3不鏽鋼溶解罐中加入Im3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為5 X IO5Da的透明質酸30kg，待完全溶解後，用氫氧化鈉調節pH為6. 2，並升溫至25°C，加入8 X IO8IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至所需分子量，將溫度升高至60°C，維持15min，加入20kgNaCl，用O. 45Mfli的聚醚碸濾膜過濾酶解液，然後用6m3的乙醇沉澱，得到透明質酸鈉沉澱，該沉澱用乙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為白色顆粒，含量98. 2%，分子量4. OkDa, pH7. 1，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。實施例15
向Im3不鏽鋼溶解罐中加入I m3純化水，邊攪拌邊向該溶解罐中加入分子量為IO6Da的透明質酸鈉15kg，待完全溶解後，用鹽酸調節pH為5. 8，並升溫至40°C，加入5 X IO8IU的芽孢桿菌透明質酸酶，酶解至所需分子量時，將溫度升高至55°C，維持60min，加入20kgNaCl，用O. 45Mfli的硝化纖維素濾膜過濾酶解液，然後用4. 5m3的乙醇沉澱，得到透明質酸鈉沉澱，該沉澱用乙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為白色顆粒，含量96. 1%，分子量9. 5kDa，pH6. 8，其紅外圖譜與歐洲藥典標準圖譜一致。比較例I
向2L燒杯中加入IL純化水，邊攪拌邊向燒杯中加入分子量為8X IO5Da的透明質酸鈉50g，待完全溶解後，加濃鹽酸10mL，降解至所需分子量時，用氫氧化鈉調節pH至6. 2，用O. 45Mffl的混合纖維素濾膜過濾降解液，然後用IOL的乙醇沉澱，得到透明質酸鈉沉澱，該沉澱用乙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為微黃色粉末，含量63. 8%,分子量 8. IkDa, ρΗ4· 8。比較例2
向2L燒杯中加入IL純化水，邊攪拌邊向燒杯中加入分子量為5Χ IO5Da的透明質酸IOOg,待完全溶解後，加濃鹽酸10mL，降解至所需分子量時，用氫氧化鈉調節pH至6. 5，用
O.45Mffl的聚碸濾膜過濾降解液，然後用IOL的乙醇沉澱，得到透明質酸鈉沉澱，該沉澱用乙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為微黃色粉末，含量60. 2%，分子量 7. 6kDa, ρΗ4· 2。比較例3
向Im3搪瓷罐中加入Im3純化水，邊攪拌邊向燒杯中加入分子量為6Χ IO5Da的透明質酸30kg，待完全溶解後，加濃鹽酸10L，降解至所需分子量時，用氫氧化鈉調節pH至7. 0，用
O.45ΜΠ1的聚碸濾膜過濾降解液，然後用IOm3的乙醇沉澱，得到透明質酸鈉沉澱，該沉澱用乙醇脫水，然後真空乾燥即得寡聚透明質酸鈉。該寡聚透明質酸鈉為微黃色粉末，含量63. 2%，分子量 7. 8kDa, ρΗ6· 2。將比較例及實施例中得到的透明質酸鹽的含量進行比較，見表I。
表I寡聚明瘓_盤的含量(Ig-LCji)
'it較例 Imm—
1 2 3 8 9 I 10 11 12 13 14 15
含量
.' ￠3.8 60.2 63 2 96—8 98 8 9+7.6 96.6 98.7 %.8 98.2 96J
( . HFLcfe)從表I可以看出，酶切法製備的寡聚透明質酸鹽含量顯著高於化學降解法製備的寡聚透明質酸鹽(P < O. 05)。動物酶降解得到的寡聚透明質酸鹽，具有促血管生成、促進創傷癒合、抗腫瘤及免疫調節等生物活性。微生物來源透明質酸酶降解得到的寡聚透明質酸鹽的生物學活性未見報導。但以下的實驗研究表明該發明中得到的寡聚透明質酸鹽無細胞毒性，與化學降解法得到的寡聚透明質酸鹽相比，清除自由基作用強，還原能力強，因此可用於化妝品中，該寡聚透明質酸鹽分子量小，易於被腸道吸收，可用於食品中，同時該寡聚透明質酸鹽具有促血管生成、促進創傷癒合的作用，因此可用於醫藥領域。實驗例I
酶切法製備的寡聚透明質酸鹽的細胞毒性研究。試驗採用L929小鼠成纖維細胞作為觀察細胞，RPMI-1640培養基添加10%胎牛血清作為完全培養基，陰性對照為不添加任何供試樣品的完全培養基，陽性對照為5g/L苯酚溶液(溶於完全培養基)，空白對照為無細胞完全培養基，供試品為完全培養基加寡聚透明質酸鈉樣品。按下式計算相對增殖率(財況)。RGR = — X 100%
式中RGR——相對增殖率，% ；
A—供試品組(陰性、陽性組)吸光度，扣除空白；
A0—陰性對照組吸光度，扣除空白。細胞毒性根據RGR按表2分級標準確定級別。陽性對照組至少為3級反應，供試品細胞毒性反應程度不大於2級時，認為其細胞毒性可接受。
權利要求
1.一種酶切法製備寡聚透明質酸鹽的方法，其特徵是以芽孢桿菌(ifeci77i/5· sp. )A50CGMCC NO. 5744發酵培養得到的芽孢桿菌透明質酸酶對透明質酸或其鹽進行降解。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵是包括以下步驟 ①配製透明質酸或其鹽溶液向純化水中加入分子量大於IOkDa的透明質酸或其鹽，配製成質量體積濃度為廣30%的溶液； ②酶解調節步驟①中溶液的溫度為2(T48°C、pH為Γ9，然後向其中加入芽孢桿菌透明質酸酶，將透明質酸或其鹽酶解至所需分子量，得酶解液； ③滅活將酶解液在5(T90°C下保持l(T60min，對芽孢桿菌透明質酸酶進行滅活； ④過濾向滅活後的酶解液中加入易溶性無機鹽，攪拌至完全溶解，然後用孔徑為O.45Mm的濾膜過濾，得濾液，每IOOmL酶解液中加入O. f IOg的易溶性無機鹽； ⑤沉澱向步驟④的濾液中加入濾液體積3 20倍的醇或酮，混合均勻，得到寡聚透明質酸鹽沉澱； ⑥脫水乾燥將步驟⑤中的寡聚透明質酸鹽沉澱分離出來，用有機溶劑脫水，然後真空乾燥，得寡聚透明質酸鹽。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵是每Ikg透明質酸或其鹽配製成的溶液中加入2 X IO7飛X IO7IU的芽孢桿菌透明質酸酶。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵是所述芽孢桿菌透明質酸酶的製備方法包括以下步驟 (1)將芽孢桿菌UaciBmsp. )A50 CGMCC NO. 5744菌種進行斜面培養，得斜面菌種； (2)取斜面菌種接種到已滅菌的種子培養基中，在25 40°C、10(T200rpm的條件下培養10 24h，得種子液； (3)將種子液接種到已滅菌的發酵培養基中，在25 40°C、10(T300rpm的條件下培養12 2處，得發酵液； (4)離心分離發酵液，取上清液，將上清液用硫酸銨分級沉澱出芽孢桿菌透明質酸酶； (5)將步驟(4)沉澱出來的透明質酸酶溶於磷酸鹽緩衝液中，超濾除去小分子雜質，得純化的芽孢桿菌透明質酸酶； 對芽孢桿菌進行培養時，每IOOmL斜面培養基中含有以下成分蛋白腖O. 2^2. 0g，酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖 O. 5 I. 5g,瓊脂粉2.0g, pH 調至 6. 0 8· O ； 每IOOmL種子培養基中含有以下成分蛋白腖O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. Og7K2HPO4 ·3Η20O.05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖 O. 5 I. 5g, pH 調至 6. 0 8· O ； 每IOOmL發酵培養基中含有以下成分蛋白腖O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. Og7K2HPO4 ·3Η20O.05 O. 15g,MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖 O. 5 I. 5g,Tween80 O. 05mL，pH調至 6. 0 8· O。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵是發酵液中芽孢桿菌透明質酸酶的酶活為I X IO5 3 X 105IU/mL，純化後芽孢桿菌透明質酸酶的比活為8 X IO6 I. 5X107IU/mg。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵是步驟①中，透明質酸鹽為透明質酸的鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽或鋅鹽；步驟②中，採用酸或鹼調節pH至4 9，所述酸為鹽酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述鹼為氫氧化鈉或氫氧化鉀；步驟④中，所述易溶性無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋅鹽或鎂鹽；步驟⑤中，所述醇或酮為乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或異丙醇；步驟⑥中，脫水所用的有機溶劑為酮或醇。
7.根據權利要求1飛中任一項所述的方法，其特徵是步驟②中，優選的酶解溫度為35 45 °C，酶解 pH 為 5. 5 7. 5。
8.根據權利要求f6中任一項所述的方法，其特徵是將透明質酸酶解至分子量為300(Tl04Da ;所得寡聚透明質酸鹽含量大於95%。
9.一種寡聚透明質酸鹽，其特徵是採用權利要求1飛中任一項所述的酶切法製備寡聚透明質酸鹽的方法製得。
10.寡聚透明質酸鹽在食品、化妝品或醫藥領域的應用，其特徵是所述寡聚透明質酸鹽由權利要求廣6中任一項所述的酶切法製備寡聚透明質酸鹽的方法製得。
全文摘要
本發明公開了酶切法製備寡聚透明質酸鹽的方法及所得寡聚透明質酸鹽和其應用，以芽孢桿菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744發酵培養得到的芽孢桿菌透明質酸酶對透明質酸或其鹽進行降解，包括配製透明質酸或其鹽溶液、酶解、滅活、過濾、沉澱、脫水乾燥步驟。本發明利用芽孢桿菌產生的透明質酸酶降解透明質酸或其鹽，經過除酶、醇或酮沉澱、脫水乾燥而成，此法操作簡單，條件溫和，對產品結構無破壞，無環境汙染，而且發酵來源的透明質酸酶成本低，適合大規模工業化生產，製備的寡聚透明質酸鹽具有透皮吸收性好、純度高、無細胞毒性、抗氧化能力強等優點，可用在化妝品、食品及醫藥領域。
文檔編號C08B37/08GK102876748SQ20121031703
公開日2013年1月16日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年4月13日
發明者郭學平, 石豔麗, 馮寧, 王冠鳳, 李海娜, 喬莉蘋, 王海英, 欒貽宏, 劉愛華 申請人:華熙福瑞達生物醫藥有限公司