一種誘導植物過敏性反應的激發子、製備方法及其應用的製作方法

2023-07-30 02:50:06 1

專利名稱：一種誘導植物過敏性反應的激發子、製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明一種誘導植物過敏性反應和抗病性的激發子及其製備方法，屬於生物技術研究領域。專用於從水稻黃單胞菌中製備一種蛋白類激發子，用於防治植物病蟲害，並提高作物產量。
激發子(elicitor)是能誘導植物產生防衛反應的一類物質，這類物質有蛋白、寡聚糖、糖蛋白等類型。激發子有生物來源和非生物來源兩種類型，其中生物來源包括植物病原真菌(如Phytophthora infestants，Phytophthora sojae)、植物病原細菌和植物胞壁等。
植物病原細菌是一種重要的激發子生物來源。植物病原細菌在非寄主植物上引起的過敏性反應是植物的一種防衛反應，具體表現為接種區植物細胞的快速死亡，形成局部枯斑，從而阻止病原菌進一步擴展並殺死病原菌。已經報導梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、菊歐氏桿菌(Erwinia chrysanthemi)和棒形桿菌(Clavibactermichiganeasis)能產生蛋白類激發子。由Hrp基因編碼的harpin也屬於蛋白類激發子。但到目前為止，未有文獻和專利報導從水稻黃單胞菌中分離出激發子。
本發明的目的是提供一種能誘導植物過敏性反應的激發子、製備方法及其應用，提取一種能夠激發菸草過敏性反應的活性物質，並對其進行純化，用於防治植物病蟲害，並能提高作物產量。
本發明所提供的植物過敏性反應激發子，其特徵在於，激發子來源於水稻黃單胞菌，屬蛋白類，分子量為10KD-100KD，等電點為4.0-7.0，甘氨酸含量為15-30％(摩爾百分比)，穀氨酸含量為10-25％(摩爾百分比)。該激發子引起菸草過敏性反應的濃度為3-10μg/mL。本發明所提供的植物過敏性反應激發子的製備方法，包括1.激發子的提取
菌體在NB培養基中液體培養，離心收集菌體，濾液經凍幹濃縮20-50倍；沉澱菌體重懸於原培養液1/5-1/20體積的磷酸緩衝液(pH6.5)，加蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟，濃度為0.5-2mM；菌懸液經超聲波破碎，離心去除菌殘體，上清沸水浴5-20′，然後再經30,000-200,000g超速離心30′-120′，上清經20-80％飽和度硫酸銨沉澱，沉澱經透析後得到激發子粗提蛋白；2.激發子的純化激發子粗提蛋白通過製備式等電聚焦初步純化，再通過強陰離子交換層析，平衡液為5mM磷酸緩衝液(pH6.5)，0-2M NaCl梯度洗脫，收集活性蛋白，透析後凍幹濃縮製成純品。某些激發子需通過分子篩進一步純化，平衡液和淋洗液均為5mM磷酸緩衝液(pH6.5，含0.15M NaCl)，收集活性蛋白，透析後凍幹濃縮製成純品。
上述誘導植物過敏性反應激發子的使用方法為，將濃度為10-100μg/mL的激發子浸種、蘸根或噴霧使用1-4次，用於防治小麥紋枯病、白粉病、赤黴病、蚜蟲，棉花立枯、炭疽病，植物細菌性青枯病，水稻細菌病害，蔬菜病毒病，辣椒和草莓灰黴病，菸草病毒病，油菜菌核病等，對上述植物促進生長和增加產量。
本發明所提供的植物過敏性反應激發子來源於水稻黃單胞菌，屬蛋白類，分子量為10-100KD，等電點為4.0-7.0，甘氨酸含量為15-30％(摩爾百分比)，穀氨酸含量為10-25％(摩爾百分比)。該激發子與E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有許多相似之處，在菸草上引起典型的過敏性反應；熱穩定且對蛋白酶敏感。本發明所提供的水稻黃單胞菌來源的激發子比Erwiniaamylovora、Pseudomonas syringae來源的Harpin類蛋白激發子具有更強的生物活性，引起菸草過敏性反應的濃度更低，它們引起菸草過敏性反應的濃度分別為3-10μg/mL、40-60μg/mL和100-200μg/mL，。
本發明的激發子可用於植物病蟲害的生物防治，防治對象包括小麥紋枯病、白粉病、赤黴病、蚜蟲，棉花立枯、炭疽病，植物細菌性青枯病，水稻細菌病害，蔬菜病毒病，草莓灰黴病，菸草病毒病，油菜菌核病等，防治效果為60-95％。還可用於提高作物產量，增產效果為10-100％。使用濃度為10-100μg/mL，浸種、蘸根或噴霧使用。使用1-4次。
實施例1從水稻白葉枯病菌JXOIII中製備的激發子屬蛋白類，分子量為13KD，等電點為4.5，甘氨酸含量為22％(摩爾百分比)，穀氨酸含量為16％(摩爾百分比)，缺乏半胱氨酸與色氨酸。該激發子與E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有許多相似之處，在菸草上引起典型的過敏性反應；均富含甘氨酸、熱穩定且對蛋白酶敏感。與E.amylovora提取的HarpinEa不同的是，HarpinEa分子量為44KD，等電點為4.2。該激發子比Erwinia amylovora、Pseudomonassyringae來源的Harpin類蛋白激發子具有更強的生物活性，引起菸草過敏性反應的濃度更低，它們引起菸草過敏性反應的濃度分別為10μg/mL、40-60μg/mL和100-200μg/mL。
從水稻白葉枯病菌JXOIII中製備激發子，製法包括1.激發子的提取JXOIII在NB培養基中液體培養，離心收集菌體，濾液經凍幹濃縮30倍；沉澱菌體重懸於原培養液1/10體積的磷酸緩衝液(pH6.5)，加蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟，濃度為1mM；菌懸液經超聲波破碎(40％輸出功率，20′)，離心去除菌殘體，上清沸水浴15′，然後再經80,000g超速離心60′，上清經30％飽和度硫酸銨沉澱，沉澱經透析後得到激發子粗提蛋白；2.激發子的純化激發子粗提蛋白通過製備式等電聚焦(RotoforTM，Bio-Rad)初步純化，陽極緩衝液為0.1mol/L H3PO4，陰極緩衝液為0.1mol/L NaOH。樣品中加兩性電解質Ampholine(pH3.5-10)，濃度為2％，電泳時間為4.5小時。聚焦後收集活性蛋白組份，再通過Q-Sepharose F.F.(XK26/7)離子交換層析(FPLCSystem，Pharmacia)，平衡液為5mM磷酸緩衝液(pH6.5)，0-2M NaCl梯度洗脫，洗脫濃度為0.66M的收集液透析後濃縮得到純化蛋白。
該提純的激發子在多種作物上具有防病增產作用(表一)實施例2從水稻細菌性條斑病菌Rs105中製備的激發子屬蛋白類，分子量為65KD，等電點為6.5，富含甘氨酸和穀氨酸，甘氨酸含量為25％(摩爾百分比)，穀氨酸含量為17％(摩爾百分比)。該激發子與E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有許多相似之處，在菸草上引起典型的過敏性反應；熱穩定且對蛋白酶敏感。與E.amylovora提取的HarpinEa不同的是，HarpinEa分子量為44KD，等電點為4.2。該激發子比Erwinia amylovora、Pseudomonassyringae來源的Harpin類蛋白激發子具有更強的生物活性，引起菸草過敏性反應的濃度更低，它們引起菸草過敏性反應的濃度分別為3μg/mL、40-60μg/mL和100-200μg/mL，。
從水稻細條斑病菌Rs105中製備激發子，製法包括1.激發子的提取Rs105在NB培養基培養，離心收集菌體，濾液經凍幹濃縮50倍；沉澱菌體重懸於原培養液1/8體積的磷酸緩衝液(pH6.5)，加蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟，濃度為1mM；菌懸液經超聲波破碎(40％輸出功率，20′)，離心去除菌殘體，上清沸水浴10′，然後再經100,000g超速離心45′，上清經60％飽和度硫酸銨沉澱，沉澱經透析後得到激發子粗提蛋白；2.激發子的純化激發子粗提蛋白通過製備式等電聚焦(RotoforTM，Bio-Rad)初步純化，陽極緩衝液為0.1mol/L H3PO4，陰極緩衝液為0.1mol/L NaOH。樣品中加兩性電解質Ampholine(PH3.5-10)，濃度為2％，電泳時間為5小時。聚焦後收集活性蛋白組份，再通過Q-Sepharose F.F.(XK26/7)離子交換層析(FPLCSystem，Pharmacia)，平衡液為5mM磷酸緩衝液(pH6.5)，0-2M NaCl梯度洗脫，收集活性組份，通過SephadexG75(XK16/65)分子篩(FPLC System，Pharmacia)，平衡液和淋洗液均為5mM磷酸緩衝液(pH6.5，含0.15M NaCl)，收集活性蛋白，透析後凍幹濃縮製成純品。
該提純的激發子在多種作物上具有防病增產作用(表二)表一 水稻黃單胞菌JXOIII蛋白類激發子對作物病蟲防治作用及增產作用作 物使用方法 防治對象防治效果 增產效果水 稻蘸根及後期噴霧2次，使用濃度為30μg/mL 白葉枯病 60％ 11％小 麥浸種和後期噴霧2次，使用濃度為40μg/mL 紋枯病67％ 15噴霧3次，使用濃度為30μg/mL白粉病85％ 18％噴霧3次，使用濃度為30μg/mL赤黴病87％ 18％噴霧3次，使用濃度為30μg/mL粘蟲 85％ 18％棉 花噴霧1次，使用濃度為100μg/mL 炭疽病71％ 11％噴霧1次，使用濃度為100μg/mL 立枯病70％ 12％番 茄噴霧3次，使用濃度為60μg/mL病毒病89％ 42％噴霧3次，使用濃度為60μg/mL晚疫病82％ 42％噴霧3次，使用濃度為60μg/mL葉黴病66％ 42％蘸根及後期噴霧2次，使用濃度為60μg/mL 青枯病72％ 35％辣 椒噴霧4次，使用濃度為30μg/mL病毒病90％ 100％煙 草噴霧3次，使用濃度為60μg/mL病毒病67％ 11％草 莓噴霧3次，使用濃度為30μg/mL灰黴病65％ 20％油 菜噴霧3次，使用濃度為30μg/mL菌核病67％ 15％表二 水稻細菌性條斑病菌蛋白類激發子對作物病蟲防治作用及增產作用作 物使用方法防治對象防治效果 增產效果水 稻蘸根及後期噴霧2次，使用濃度為25μg/mL 白葉枯病65％ 15％小 麥浸種和後期噴霧2次，使用濃度為25μg/mL 紋枯病 68％ 18％噴霧3次，使用濃度為20μg/mL 白粉病 88％ 20％噴霧3次，使用濃度為20μg/mL 赤黴病 84％ 23％噴霧3次，使用濃度為20μg/mL 粘蟲87％ 21％棉 花噴霧1次，使用濃度為80μg/mL 炭疽病 75％ 15％噴霧1次，使用濃度為80μg/mL 立枯病 76％ 13％番 茄噴霧3次，使用濃度為60μg/mL 病毒病 92％ 40％噴霧3次，使用濃度為60μg/mL 晚疫病 85％ 40％噴霧3次，使用濃度為60μg/mL 葉黴病 70％ 40％蘸根及後期噴霧2次，使用濃度為60μg/mL 青枯病 75％ 40％辣 椒噴霧4次，使用濃度為30μg/mL 病毒病 95％ 100％煙 草噴霧3次，使用濃度為50μg/mL 病毒病 71％ 12％草 莓噴霧3次，使用濃度為30μg/mL 灰黴病 70％ 25％油 菜噴霧3次，使用濃度為30μg/mL 菌核病 72％ 16％
權利要求
1.一種誘導植物過敏性反應和抗病性激發子，其特徵在於激發子來源於水稻黃單胞菌，屬蛋白類，分子量為10KD-100KD，等電點為4.0-7.0，甘氨酸含量為15-30％(摩爾百分比)，穀氨酸含量為10-25％(摩爾百分比)，該激發子引起菸草過敏性反應的濃度為3-10μg/mL。
2.權利要求1所述誘導植物過敏性反應激發子的製備方法，包括2.1)激發子的提取菌體在NB培養基中液體培養，離心收集菌體，濾液經凍幹濃縮20-50倍；沉澱菌體重懸於原培養液1/5-1/20體積的磷酸緩衝液(pH6.5)，加蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟，濃度為0.5-2mM；菌懸液經超聲波破碎，離心去除菌殘體，上清沸水浴5-20′，然後再經30,000-200,000g超速離心30′-120′，上清經20-80％飽和度硫酸銨沉澱，沉澱經透析後得到激發子粗提蛋白；2.2)激發子的純化激發子粗提蛋白通過製備式等電聚焦初步純化，再通過強陰離子交換層析，平衡液為5mM磷酸緩衝液(pH6.5)，0-2M NaCl梯度洗脫。
3.根據權利要求2所述誘導植物過敏性反應激發子的製備方法，其特徵在於將所提激發子粗提蛋白通過等電聚焦初步純化，通過強陰離子離子交換層析，再通過分子篩進一步純化。
4.權利要求1-3之一所述誘導植物過敏性反應激發子的使用方法為，將濃度為10-100μg/mL的激發子浸種、蘸根或噴霧使用1-4次，用於防治小麥紋枯病、白粉病、赤黴病、蚜蟲，棉花立枯、炭疽病，植物細菌性青枯病，水稻細菌病害，蔬菜病毒病，草莓灰黴病，菸草病毒病，油菜菌核病等，對上述植物促進生長和增加產量。
全文摘要
本發明水稻黃單胞菌誘導植物過敏性反應和抗病性的激發子、製備方法及其應用,屬於生物技術領域。利用超聲波破碎細胞,從水稻黃單胞菌菌體中提取到一種能夠誘導植物過敏性反應和抗病性的蛋白類激發子,並通過等電聚焦及柱層析技術對其進行純化。該激發子可用於多種植物病害的生物防治,對害蟲有驅避作用,並具有促進植物生長和增加作物產量的作用。浸種、蘸根或噴霧使用。使用濃度為10—100μg/mL,使用1—4次。防治效果60%以上,增產效果為10%以上。
文檔編號C07K14/195GK1251371SQ99114368
公開日2000年4月26日 申請日期1999年8月10日 優先權日1999年8月10日
發明者王金生, 聞偉剛, 陸徐忠, 宋從鳳, 吳健勝 申請人:南京農業大學