Fn14/TRAIL融合蛋白的製作方法

2023-07-23 03:58:41

專利名稱：Fn14/TRAIL融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及i^n14/TRAIL和相關的融合蛋白，以及用這些蛋白質治療某些疾病諸 如自身免疫病和癌症的方法。
背景技術：
正信號和負信號的複雜相互作用調節T細胞活化作用和T細胞效應子功能的維 持。TNF配體/TNF受體超家族成員在橋連免疫系統細胞以及使用其它器官系統細胞的信 號的這種基質中顯得很重要。這樣做，TNF超家族成員通過對細胞存活和死亡、細胞分化和 炎症的作用，促進組織穩態和發病機理。從自身免疫發病機理的觀點，令人感興趣的TNF配 體超家族成員是TNF-相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand) (TRAIL)和I￥EAK(TNF-相關的凋亡弱誘導劑，TNF-related weak inducer of apoptosis)。TRAIL與多種不同的TNF受體超家族的關聯受體結合，一些導致觸發細胞內信號 傳導通路和其它的簡單地作為誘殺型受體。人類中的觸發受體是TRAIL-R1、TRAIL-R2和護 骨蛋白，而在小鼠中唯一的觸發受體是DR5。事實上免疫系統的所有細胞(T淋巴細胞、B淋 巴細胞、天然殺傷細胞、樹突細胞、單核細胞、粒細胞)應答幹擾素和其它活化信號而上調 表面TRAIL和/或釋放貯存於分泌小泡中的可溶性TRAIL。TRAIL抑制數種動物模型中的自 身免疫。TRAL抑制實驗性自身免疫性腦炎(EAE)——MS的鼠模型——的能力的證據來自於 產生下述的實驗TRAIL-/_敲除小鼠、能夠阻斷TRAIL功能的可溶性TRAIL受體(sDR5)或 中和抗-TRAILmAb、以及胚胎幹細胞衍生的樹枝狀細胞共表達TRAIL和致病MOG (髓鞘少突 膠質糖蛋白肽)。令人感興趣的是，在MS患者中，可溶性TRAIL顯示為IFN-β治療的應答 標記，其中這些最可能對顯示治療後早期和持續的可溶性TRAIL誘導的治療進行應答。然 而，TRAIL對MS/EAE的影響可能更複雜，例如，表明TRAIL可以促進腦細胞凋亡。TRAIL和 !^asL都涉及T細胞的負調節。TffEAK及其反受體而14(成纖維細胞生長因子-可誘導的14kDa蛋白質)是在一 些免疫和非免疫細胞類型中表達的另一 TNF家族配體-受體對，所述免疫和非免疫細胞類 型包括NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞、小膠質細胞、神經膠質細胞和內皮細胞。TWEAK促進 一些細胞類型(星形膠質細胞、內皮細胞和某些人腫瘤細胞系)的增殖並且抑制其它細胞 (成紅血細胞、腎細胞、繫膜細胞、神經元細胞、NK細胞、單核細胞)。TWEAK刺激各種炎症細 胞因子、趨化因子和黏著分子的產生。然而，TWEAKTnH信號軸(signaling axis)具有超 出細胞增殖和細胞因子產生的作用。令人感興趣地是，多年來與TWEAK相關的較富有(多) 組的功能包括涉入(瞄準，tie into)自身免疫的那些。TWEAK增加神經血管束單元的滲透 性，並且其內源性表達在EAE和急性腦缺血期間在CNS中升高。而且，TWEAK具有促血管生 成(pro-angiogenic)活性，其是血管發生和自身免疫發病機理之間的令人感興趣的特定 聯繫。TWEAK增加EAE的嚴重性和相關的神經變性。通過用TWEAK或而14的胞外域進行接 種，誘導抑制性抗-TWEAK或!^nHAb改善了大鼠和小鼠模型中的EAE現象。多發性硬化症(MS)是使人衰弱的神經性疾病(debilitating neurologicaldisease)，並且儘管擴展了治療選擇的組，但是對更有效治療劑仍然存在緊迫的需要。雖 然MS的準確病因是未知的，但是其發病機理和臨床進展的關鍵特徵正在顯現。致病效應器 T細胞被認為是引發疾病的關鍵，並且因此多種治療途徑集中在這些細胞上，目標是諸如阻 止它們的活化作用和再活化、從較大的T細胞儲存器中除去它們以及幹擾它們轉運到CNS 內的發病部位。TWEAK/Fnl4 和 TRAIL/TRAILR 信號軸都涉及癌症。參見，例如〃 TRAIL receptor signalling and modulation :Are we on the right TRAIL ？ " , Cancer Treatment Reviews 35(2009)280—288 ；禾口" The TffEAK-Fn14 cytokine—rec印tor axis :discovery, biology and therapeutic targeting" , Nature 7(2008)411—425。

發明內容
因此，在一方面，本發明提供包括第一結構域和第二結構域的融合蛋白，其中所述 第一結構域是與TWEAK配體結合的多肽，而所述第二結構域是與TRAIL受體結合的多肽。在另外的方面，本發明提供基本由第一結構域和第二結構域組成的融合蛋白，其 中所述第一結構域為而14蛋白的胞外域的至少一部分，而所述第二結構域為TRAIL蛋白的 胞外域的至少一部分。在另一方面，本發明提供包括第一結構域和第二結構域的融合蛋白，其中所述第 一結構域是與TWEAK配體結合的多肽，而所述第二結構域是具有抑制功能的多肽。也提供了包含所述融合蛋白的藥物組合物，以及用本發明的融合蛋白治療各種疾 病諸如自身免疫病和癌症的方法。


本發明通過以下附圖進一步地圖解，其中圖1. FnH-TRAIL的表達和功能分析A)對來自用而14、Fnl4-TRAIL, FnH-IgG 1 (mut)和TRAIL的表達構建物轉染的 293細胞的條件培養液進行蛋白質印跡分析。觀察到的帶分別與8. 7kD、27. 5kD、34. IkD和 19. OkD的預期大小一致。B) CHO細胞用鼠TWEAK cDNA表達構建物瞬時轉染，並且在48小時後，在4°C下，與 純化的而14-TRAIL或rTRAIL —起在包含疊氮鈉的緩衝液中溫育。分別使用抗_小鼠TWEAK Ab (B. 1)和抗小鼠TRAIL Ab (B. 2-5)作為檢測Ab，通過流式細胞計量術驗證轉染子上的膜 結合TWEAK的存在和!^nH-TRAIL與它們的結合。(B. 1)TWEAK在轉染的CHO細胞上表達， 如使用抗-TWEAK Ab (黑色實線)對同種型對照(填滿的直方圖)所檢測的；(B. 2)當使用 抗-TRAIL Ab (黑色實線)對同種型對照(填滿的直方圖)進行分析時，TRAIL在CHO細胞 上不可檢測。(B. 3和B. 4)當將!^nH-TRAIL加入表達TWEAK-的、與TEWAK-陰性相對的CHO 細胞時，TRAIL表位被增強。抗-TRAIL Ab和同種型對照分別通過黑色實線和填滿的直方 圖表示。(B. 5) TWEAK-轉染的細胞在rTRAIL的存在下不結合抗-TRAILAb (黑色實線)。同 種型對照顯示為填滿的直方圖。C)將細胞以2X IO4個細胞/孔，在圓底96-孔板中在100 μ 1 AIM-V培養基 中培養。在16小時後，以Img/孔將放線菌素D加入培養物，並且將細胞培養另外池。然後加入!^14-TRAIL或rTRAIL作為陽性對照，並且將培養物維持另外證。通過MTT測定確定 死亡細胞的百分比，如在材料和方法中描述。圖2.雙盒pSBC21載體的功能驗證A)如示意性描述的，PSBC21質粒串聯地併入轉座子盒(具有驅動反式信號重定 向蛋白(trans signal redirecting protein-TSRP)的EF Ια啟動子)和轉座酶表達盒 (由UBC啟動子驅動)。B)僅用pSBC21載體(右面的圖)或用指示濃度的pLuciferase-SBC21流體注射 小鼠。在質粒注射後22天腹膜內施用D-蟲螢光素後獲得生物發光圖像。彩色條表示以輻 射率表示的生物發光信號(p/sec/cmVsr)。C)在注射 5μ g、10y g 或 20μ g Wi^nH-TRAIL pSBC21 質粒 20 天后，通過 ELISA 測定!^nH-TRAIL的血清水平。圖3. FnH-TRAIL抑制MOG-誘導的自身免疫性腦脊髓炎A)在流體注射50yg各自的pSBC21-基表達質粒後20天，通過ELISA測量而14、 Fnl4-TRAIL, FnH-IgGl (mut)和TRAIL的血清水平。B-D)如材料和方法中描述的，用補充 有結核分枝桿菌的CFA中的MOG激發小鼠。在MOG激發4 小時後，用50 μ g的指示的基 於PSBC21的表達構建物流體注射小鼠。根據在材料和方法中描述的臨床分級對單個小鼠 進行打分。評估的參數包括平均臨床評分(B，上圖)、發病率(B，下圖)、累計平均臨床評分 (C)和在第35天的平均臨床評分(D)。根據Mann-Whitney U檢驗，i^nl4_TRAIL-處理組對 只有載體對照組之間的差異是有統計學顯著性的(P < 0. 05)，其中在示出的其它組和只有 載體組之間的差異沒有顯著性。圖4.組合的 ^η14和TRAIL沒有取得!^nH-TRAIL的療效A-C)在MOG-激發48h小時後，小鼠用單劑量的i^nH-TRAIL pSBC21質粒(25 μ g/ 小鼠)或者單劑量的Fnl4pSBC21和TRAILpSBC21質粒(25 μ g每種/小鼠)的混合物進行 流體注射。顯示了在40天(A)內和在第16、23和40天(B)的指定組的平均臨床分數。也 顯示了在第40天的指定組的累積MCS (C)。根據Mann-Whitney U檢驗，在i^nl4_TRAIL-處 理組和只有載體的對照組之間的差異有統計學顯著性(P < 0. 05)，其中在顯示的其它組和 只有載體組之間的差異沒有顯著性。D)在注射組合的 Fnl4pSBC21 (25 μ g) +TRAIL pSBC21 (25 μ g)或 i^nH-TRAIL PSBC21 (25 μ g)之後30天，通過ELISA測定!^nH-TRAI的血清水平。E)在接受治療劑後43天，殺死只用pSBC21載體或用i^l4_TRAIL pSBC21流體注 射的MOG-激發的小鼠。在不同濃度的M0G38_5(i肽存在或不存下培養每隻小鼠的脾細胞，並 且如在材料和方法中描述地評估增殖。結果顯示為每個組總計9隻小鼠的平均數士SD。圖5. !^nH-TRAIL pSBC21抑制MOG-激發小鼠中的細胞因子產生。小鼠用補充有結核分枝桿菌的CFA中的MOG激發，並且用只有SBC21載體或 Fnl4-TRAIL pSBC21進行流體注射。動物在接受治療劑43天後被殺死，每隻小鼠的脾細胞 在不同濃度的M0G38_5(i肽存在或不存的情況下進行培養。培養的培養基在40h後收集，並且 通過ELISA測定指定細胞因子的濃度。圖6. Fnl4-TRAIL pSBC21處理減少了 MOG-激發小鼠脊髓中活化和細胞因子產生 細胞。
如在材料和方法中描述，分離和分析來自只有載體PSBC21和!^nH-TRAIL pSBC21 處理小鼠的脊髓的浸潤細胞。通過將活細胞總數乘以每種指示的細胞類型的％計算細胞的 數量。細胞的百分比和數量表示由三隻小鼠的組獲得的指示細胞類型的百分比和數量。A-B)在MOG激發後第7天，活化的(⑶69+)炎症細胞的百分比和絕對數量C-D)在MOG激發後第7天，⑶4+和⑶8+細胞的百分比和絕對數量，以及IFN γ、 IL-17和IL-10表達細胞的百分比和絕對數量(在活化的CD69+、細胞或總的細胞庫當中)D-E)在MOG激發後第14天，⑶8+細胞和IFN y、IL-17和IL-10表達細胞的百分 比和絕對數量圖7. Fnl4-TRAIL pSBC21處理減少MOG激發小鼠中的脊髓炎症用只有SBC21載體或者!^14-TRAIL pSBC21流體注射的MOG-激發小鼠用PBS和 10%福馬林磷酸鹽經心臟(transcardially))灌注。除去脊髓，切割成六片並包埋在 石蠟中，以5μπι進行橫向組織切片並用勒克索爾固藍-甲基酚紫(luxol fast blue and cresyl violet)染色。Α)上圖顯示只有載體處理小鼠的代表性脊髓切片，從左到右的最大疾病評分分別 是2、3. 5和1。下圖顯示而141肌11^-處理小鼠的代表性的脊髓切片，從左到右的最大疾病 評分分別是0、1和3。B)對每隻動物的六個脊髓片段的每一個的組織切片進行分析。基於以下標準，賦 予單個切片炎症評分0，沒有炎症；1， 50%的白細胞浸 潤白質。對於每隻小鼠，組織學評分是6個脊髓切片的評分的總和。根據Marm-Whitney U 檢驗，FnH-TRAIL-處理組對對照組之間的差異是統計學顯著的(ρ < 0. 05)。圖8. FnH-TRAIL處理減少血腦屏障滲透性用只有SBC21載體或!^14-TRAIL-pSBC21流體注射的MOG-激發小鼠在MOG激發 後第6天(A)或第13(B)天用伊文思藍染料注射。在指示的組織提取物中定量分析伊文思 藍，如在材料和方法中描述。結果表示伊文思藍在630nm處的特定吸收，計算為ng/g組織。 星號指示差異是統計學顯著的。(P <0.05)，如通過學生t檢驗測定的。在(C)中，只有載 體處理的小鼠對而141肌11^-處理的小鼠的脊髓中吸收染料的濃度匹配在MOG激發後第13 天的平均臨床分數(0或1)。圖9. TWEAKJnH-TRAIL的結構模型；如在材料和方法中描述生成的DR5複合體三 維模型，對於!^nH-TRAIL顯示為單體單元(A，藍色的而14和白色的TRAIL)、FnH-TRAIL 三聚體(B，作為帶模型；C，作為空間填充模型)，以及TWEAK Jn14-TRAIL:DR5複合體(D，用 FnH-TRAIL作為空間填充模型，TWEAK三聚體作為在頂部的帶模型，和DR5三聚體作為在下 面的帶模型)。圖10是人i^ril4-TRAIL融合蛋白的蛋白質印跡分析。圖11是顯示在!^14-TRAIL純化過程期間不同順序步驟的產物的SDS-PAGE分析。圖12是指示而-14-Trial減少自MOG免疫小鼠收穫的脾細胞總數的數據的圖。圖13是顯示體內而-14-Trial處理減少對從自淋巴結回收的淋巴細胞的先體外 後體內抗原再刺激的先體外後體內回憶應答的數據的圖。圖14A-14B是顯示在MOG激發小鼠中i^l4_Trail改善EAE疾病進程的數據的圖。圖15是指示!^14-Trial抑制DBAl小鼠中膠原誘導的關節炎的數據的圖。
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圖16A-16D是在不同濃度的!^nH-TRAIL存在下培養M小時的SK-HEPl肝癌細胞 系(A)、Raji惡性B細胞系(B)以及非惡性肝細胞系NKNT3(C)和FH-B(D)的數據的圖。在 溫育後，收集細胞、用臺盼藍染色並且計數活的和死亡的細胞。示出的數據表示兩個獨立的 實驗。圖17是在不同濃度(如示出的)的i^nH-TRAIL、sTrail, Fnl4-Fc或者後兩者的 組合的存在下培養的SK-HEPl肝癌細胞系的數據的圖。在M小時溫育後，收集細胞、用臺 盼藍染色並計數活的和死亡的細胞。示出的數據表示三個獨立的試驗。圖18是在不同濃度的i^nH-TRAIL、sTRAIL、Fnl4-Fc或者後兩者的組合的存在下 培養的SK-HEPl肝癌細胞系的數據的圖。在M小時溫育後，收集並清洗細胞、通過膜聯蛋 白V/PI染色和流式細胞計量術測試細胞凋亡。示出的數據表示兩個獨立的試驗。
具體實施例方式如本文在說明書和權利要求書中使用的，包括如在實施例中使用的，除非另外清 楚地規定，所有的數字可以理解為好像單詞「約」在之前一樣，即使該術語沒有清楚地顯示。 同樣地，本文陳述的任何數字範圍意欲包括其中包含的所有子範圍。其中，任何胺基酸序列 通過Swiss Prot.或NCBI登錄號而被具體提及，序列通過引用併入本文。一方面，本發明提供作用於TWEAK和TRAIL信號軸的融合蛋白，例如，這樣的融合 蛋白其具有包括結合TEEAK配體的多肽的第一結構域；和包括結合TRAIL受體的多肽的 第二結構域。具體地，第一結構域是具有通過其而14受體幹擾TEEAK觸發能力的能力的多肽， 和所述第二結構域是可以引導抑制信號到T細胞上或具有TRAIL受體的其它細胞上的關聯 受體的多肽。在TEWAK和TRAIL信號軸的情況中，合適的第一結構域包括例如而14蛋白、野生 型而14蛋白的變體或衍生物、或特異地適於結合TWEAK並阻止這種配體發信號到其而14 受體的其它多肽或蛋白質——諸如結合TWEAK的抗體、結合TWEAK的抗體部分，和被改造 為結合TWEAK的脂籠蛋白衍生物。優選地，這種實施方式的融合蛋白的第一結構域為而14 蛋白的胞外域的至少一部分，具體地，為對於結合TWEAK配體和幹擾其結合和觸發膜結合 Fnl4受體能力是必要的胞外域部分。胞外域的野生型形式的變體、或者負責TWEAK結合的 胞外域部分也被包括在本發明中，只要變體提供與野生型蛋白質類似水平的生物學活性。因此，如本文使用的，術語「結合TWEAK配體的多肽」包括而14蛋白；而14蛋白的 胞外域；作為1^14蛋白的胞外域至少一部分、負責結合到TWEAK配體的部分的多肽；TWEAK 抗體或抗體的部分；脂籠蛋白衍生物；和這些的任一種的變體和/或衍生物。術語「而14」 被理解為包括對應於而14蛋白的完整胺基酸序列的多肽，其包括胞質、跨膜和胞外域，以 及對應於該蛋白質的較小部分的多肽，諸如胞外域，或者一部分胞外域。在一個實施方式 中，!^14/TRAIL融合蛋白的第一結構域為人而14蛋白的胞外域的至少一部分。在TWEAK和TRAIL信號軸的情況下，合適的第二結構域包括例如TRAIL蛋白自身、 TRAIL蛋白的變體或衍生物、或者被特異地設計為抑制T細胞或其它細胞的活化作用和/或 通過TRAIL受體誘導細胞凋亡的其它多肽或蛋白質，諸如拮抗的抗-TRAILAb，以及任一這 些的變體和/或衍生物。
優選地，在該實施方式中的融合蛋白的第二結構域為TRAIL蛋白的胞外域的至少 一部分，具體而言，為對於結合TRAIL受體是必要的部分。結合TRAIL受體是必要的那部分。 TRAIL蛋白胞外域的野生型形式的變體、或者負責TRAIL受體結合的胞外域的部分，也被包 括在本發明中，只要變體提供與野生型蛋白質類似水平的生物學活性。因此，如本文使用的，術語「結合TRAIL受體的多肽」包括TRAL蛋白；TRAIL蛋白 的胞外域；作為TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分，負責結合TRAIL受體的部分的多肽； TRAIL受體的抗體(和抗體的部分)；和任一這些的衍生物和/或變體。術語「TRAIL」被 理解為包括對應於TRAIL蛋白的完整胺基酸序列的多肽，包括胞質、跨膜和胞外域，以及對 應於該蛋白質的較小部分的多肽，諸如胞外域，或者胞外域的一部分。在一個實施方式中， !^14-TRAIL融合蛋白的第二結構域為人TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分。在一個實施方式中，本發明包括i^ril4/TRAIL融合蛋白。在另一個實施方式中，術 "Fnl4/TRAIL融合蛋白」指由SEQ. ID. NO. :1確定的特定融合蛋白SEQ. ID. NO. 1 人 Fn 14-TRAILMARGSLRRLLRLLVLGLWLALLRSVAGEQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAA APPAPFRLLffRGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIY SQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCffSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRI FVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG在另一實施方式中，術語「i^ril4/TRAIL融合蛋白」指由SEQ. ID. NO. :2確定的特定
融合蛋白SEQ. ID. NO. 2 人 Fn 14-TRAILMARGSLRRLLRLLVLGLWLALLRSVAGEQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAA APPAPFRLLffETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSN LHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEY GLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGSEQ. ID NO. 1和SEQ. ID. NO. 2都包括原信號肽；這些信號肽可以根據使用者的需 要、表達系統和其它因素進行變化，如本領域技術人員所理解的。信號肽在本領域中是熟知 的，並且可以使用任何期望的信號肽，包括由本領域技術人員已知的公開可用的信號肽識 別軟體識別/預測到的那些。在另外的實施方式中，Fnl4/TRAIL融合蛋白是在SEQ. ID. NO. 1或SEQ. ID. NO. :2 中示出的胺基酸序列的變體和/或衍生物。在本發明的還另外方面，本文描述的任一融合蛋白的TRAIL組分可以用另一種抑 制性蛋白替代，即，阻止免疫應答的活化作用和/或誘導T細胞或其它細胞類型的凋亡， 所述其它細胞類型諸如B細胞、天然殺傷(NK)細胞、NKT細胞、淋巴祖細胞、樹突細胞、單核細胞/巨噬細胞、具有抗原呈遞能力的組織-基的巨噬細胞譜系細胞和多種非專職性 (non-professional)抗原呈遞細胞的任一種，例如，內皮細胞。抑制性蛋白的實例包括但不 限於 FasL、TNF、PDL-l、PDL-2、B7x、B7-H3 和 CD31。例如，BTLA是重要的抑制性受體，並且除了仍然待發現的其它配體之外，B7x可以 是配體。類似地，CTLA-4是另一種重要的抑制性受體，並且引發(驅動，drive)這種抑制性 CTLA-4受體的配體包括一些B7分子以及激動劑(agonist) Ab。在這種情況中，融合蛋白將 分別是 ^ηΗ/ΒΤχ和Π14/Β7激動劑融合蛋白。對於B細胞也是引發自身免疫的關鍵的了解不斷增加。引發B細胞抑制性受體 的另外的抑制性配體(融合到而14)也被包括在本發明的範圍內，所述抑制性配體諸如CD 100(結合到 CD72)、CD5(也結合到 CD72)、CD72 (結合到 CD5)、Ep-CAM (結合到 LAIR-1)、 FcgammaRII 的激動劑、CD22、PDL-1、PDL-2、CD66a 和 PIR-B。文獻富有另外的實例，諸如在以下文獻中列出的=Sinclair, N. 「 Why so Many Coinhibitory Receptors ？ , Scand. J. Immunol. 50,10-13(1999) ；Melero, I.等 入， "Immunostimulatory monoclonal antibodies for cancer therapy 「 ， Nature Rev. Cancer 7 :95-106 (2007)；禾口 Zang, X.等人，"The B7Family and Cancer Therapy Costimulation and Coinhibition" , Clin. Cancer Res. 13 :5271-5279 (2007),所有文獻 通過引用併入本文。本發明的融合蛋白和方法包括任一上述抑制性蛋白質，並且所述抑制 性蛋白質在本文統稱為「具有抑制功能的多肽」。因此，在另外的實施方式中，本發明提供而14/抑制性蛋白融合對，諸如而14/ FasL, Fnl4/PDL-1、Fnl4/PDL_2、Fnl4/TNF、Fnl4/CD100、Fnl4/CD5、Fnl4/CD72、Fn 14/ Ep-CAM、Fnl4/Fc-y-RII、Fnl4/CD22、Fnl4/CD66a、Fnl4/PIR_B、Fnl4/B7x、Fnl4/B7_H3 和 !^14/⑶31。在TWEAK/TRAIL信號軸的情況下，以上描述的任一的第一結構域，例如結合 TEEAK配體的多肽，將是這些實施方式中的合適的第一結構域。在一個實施方式中，本發明的融合蛋白通過阻止或減少髓鞘特異的T細胞的增殖 和分化來抑制免疫系統的活化作用。在一些實施方式中，本發明的融合蛋白抑制促炎細胞 因子和趨化因子諸如IL-6、IL-8、RANTES、IP-IO和MCP-I的產生，或者抑制其它細胞因子/ 趨化因子諸如TNF-α和IL-I β的增強；或者抑制基質金屬蛋白酶諸如MMP-I和ΜΜΡ-9的 誘導；或者抑制成纖維細胞和滑膜細胞的前列腺素Ε2分泌。本發明包括抑制/下調通過 TffEAK配體促進或通過TRAIL配體下調的任何和所有細胞因子。在其它實施方式中，本發明的融合蛋白抑制自體反應的T細胞增殖、自體反應的 抗體產生和炎症反應。在另外的實施方式中，本發明的融合蛋白減少炎症，如在測量促炎細胞因子和趨 化因子產生的抑制和/或抗炎細胞因子產生的升高的體外和體內分析所測定的；在炎症的 體內模型系統中測定的，諸如自身免疫病模型，例如，EAE和膠原誘導的關節炎，和延遲型超 敏性，以及其中促炎劑被局部或全身地引入動物中的其它模型。在這些體內模型中，炎症通 過發炎組織的組織檢查、疾病組織的炎症細胞的分離和患病動物中疾病表現的測量進行評 估。在其它實施方式中，本發明的融合蛋白抑制致病性T細胞的增殖、分化和/或效應器功 能，所述致病性T細胞如自身反應的CD4+T細胞和CD8+T細胞和其它致病性免疫細胞諸如B 細胞、天然殺傷(NK)細胞、NKT細胞、淋巴祖細胞、樹突細胞、單核細胞/巨噬細胞；誘導致
9病性免疫細胞的凋亡；促進具有調節性能的免疫細胞(諸如CD4+CD25+調節T細胞、Trl細 胞、CD8+、NKNKT和具有免疫抑制活性的樹突細胞)的生成；減少血腦屏障的滲透性並且因 此限制炎症細胞進入到CNS ；減少炎症細胞進入到其它疾病部位；和減少與炎症相關的血
管發生。如以上描述，TWEAK配體在包括NK細胞、巨噬細胞、樹突細胞、小膠質細胞、神經膠 質細胞和內皮細胞的多種免疫和非免疫細胞類型上表達。因此，通過幹擾來自這些細胞的 TffEAK信號，具有而14的融合蛋白阻斷TWEAK介導的信號，所述信號由這些細胞類型的每 一種引導至它們相互作用的各種具有而14的細胞。如同樣上述提到的，TWEAK促進一些具 有而14的細胞類型諸如星形膠質細胞、內皮細胞和某些人的腫瘤細胞系的增殖，並且抑制 其它的細胞類型諸如成紅血細胞、腎細胞、繫膜細胞、神經元細胞、NK細胞、單核細胞，並且 因此包含而14的融合蛋白可以逆轉這些TWEAK引發的生物學作用。而且，由於i^ril4/TRAIL 融合蛋白正在行使交換和再引發細胞內信號的功能，所以其它細胞靶標是被有效抑制的具 有TRAIL-受體的細胞諸如T細胞，和其它具有TRAIL-R的細胞，其包括多種腫瘤細胞類型， 諸如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、骨髓瘤、成膠質母細胞瘤和白血病。Fn 14Fnl4 是質膜錨定蛋白(plasma membrane-anchored protein)並且是長度為 1 個胺基酸的TNFR(TNF受體)超家族成員(Swiss Prot登錄號Q9CR75 (小鼠)和 Q9NP84(人))。Fnl4 的兩個變體是已知的，由 Swiss Prot. Isoform ID 號 Q9NP84. 1 和 Q9NP84. 2(NCBI登錄號分別是NP_057723和BAB 17850)鑑定。也在許多其它種中確定了 Fnl4序列，所述其它種包括非洲爪蟾(Xenopus laevis) (NCBI登錄號AAR21225)和大鼠 (NCBI 登錄號 NP_851600)。大多數TNFR超家族成員包括以一個至六個富半胱氨酸結構域(CRD)存在為結構 特徵的胞外域。典型的CRD為大約40個胺基酸長並且包含形成三個鏈內二硫橋的六個保 守的半胱氨酸殘基。CRD自身一般由兩個不同的結構模塊組成。Fnl4是I型跨膜蛋白，其包含53個胺基酸——胺基酸觀_80——的胞外域與一 個CRD。已經顯示，在該CRD內的某些帶電胺基酸殘基對有效的TWEAK-FnH相互作用是特 另丨J關鍵的° Brown, S. Α.等人，Tweak binding the Fnl4cysteine-rich domain depends on charded residues located in both the Al and D2 modules, J. Biochem. 397 ^7-304(2006)，其通過引用併入本文。基於Brown等人的文章中提供的信息，例如，本領域技術人員可以確定而14蛋白 的哪種變體將保留TWEAK結合活性以及哪種將不會保留TWEAK結合活性。例如，發現通過 在不是進化上保守的位置處進行位置特異突變製備的數種特異的變體具有TWEAK結合活 性。相反地，在CRD區域內的至少三個胺基酸對於TWEAK結合是至關重要的。通過比較各 個種中的而14蛋白的胺基酸序列，可以確定哪個胺基酸位置不是高度保守的，並且將是替 代/添加/缺失的良好候選者。在高度保守區域——特別是在TNFR同源性區域中——的 替代/缺失/添加，將不被認為是用於製備根據本發明的變體的可能的候選者。TRAILTRAIL是具有291個胺基酸的II型膜蛋白，並且已經在包括但不限於下述的多個 種中進行了測序小鼠:Swiss Prot.登錄號P50592 ；人=Swiss Prot登錄號P50591 ；褐家鼠(Rattus norvegicus) =NCBI 登錄 NP_663714 ；鱖(Siniperca Chuatsi)(桂魚(Chinese Perch)) :NCBI 登錄AAX77404 ；原雞(Gallus Gallus)(雞)NCBI 登錄BAC79267 ；野豬(Sus Scrofa)(豬):NCBI 登錄 NP_001019867 ；草魚(Ctenopharyngodon Idella)(草魚):NCBI 登錄 AAW22593 ；和黃牛(Bos Taurus)(牛):NCBI 登錄 XP_001250249。TRAIL的胞外域包括胺基酸39-281，並且，基於TNF同源性模型，負責受體結合的 TNF結構域是胺基酸121480。對於賦予活性特別重要的蛋白質的部分已經被鑑定。參見， 例如，「Triggering cell death :The crystal structure of Apo2L/TRAIL in a complex with death receptor"，Hymowitz SG，等人，Am. MoI. Cell. 19990ct ；4 (4) :563-71)，通過 引用併入本文，其報導了對於TRAIL結合其受體和活性最重要的胺基酸是在鋅區域周圍 的胺基酸諸如胺基酸(191-201-205-207-236-237)和胺基酸(150-216)，通過引用併入本 文。也參見l)Krieg A等人，2003，Br. J of Cancer 88 :918_927，其描述了沒有凋亡活 性的兩個人 TRAIL 變體，TRAIL- γ 和 TRAIL β ；2) 〃 Enforced covalent trimerization increases the activity of the TNF ligand family members TRAIL and CD95L"， D Berg 等人，Cell death and differentiation 0007) 14，2021-2034 ；和 3) 〃 Crystal Structure of TRAIL-DR5 complex identifies a critical role of the unique frame insertion in conferring recognition specificity" , S. Cha 等人，J. Biol. Chem. 275 31171-31177(2000)，通過引用併入本文。已知TRAIL連接兩種類型的受體觸發TRIL-誘導的凋亡的死亡受體和可能抑制 該通路的誘殺型受體。TRAIL的四種人受體已經被鑑定，其包括TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3 和TRAILR4。TRAIL也可以結合護骨蛋白(OPG)。與這些受體的每一種的結合已經被很好的 表徵。參見，例如，"The TRAIL apoptotic pathway in cancer onset, progression and therapy，，，Nature Reviews Cancer Volume 8(2008)782-798。另外的定義如本文使用的，術語「融合蛋白」指包括兩種或更多種不同蛋白質的胺基酸序列的 嵌合蛋白質。典型地，融合蛋白由本領域熟知的體外重組技術產生。如本文使用的，「生物學活性或者免疫學活性」指根據本發明的融合蛋白與為本發 明融合蛋白的構成區段的單獨野生型蛋白具有類似的結構功能(但是不必到相同的程度) 和/或類似的調節功能(但是不必到相同程度)和/或生化功能(但是不必到相同程度) 和/或免疫學活性(但是不必到相同程度)。如本文使用的，「缺失」被定義為與野生型蛋白質相比，其中一個或多個胺基酸殘 基不存在的胺基酸序列的變化。如本文使用的，「插入」或「添加」是與野生型蛋白質相比，導致一個或多個胺基酸 殘基的添加的胺基酸序列的變化。如本文使用的，與野生型蛋白質相比，「替代」產生於一個或多個胺基酸分別由不
同胺基酸置換。如本文使用的，術語「變體」指與野生型蛋白質相比，具有來自或對序列的一個 (或多個)胺基酸的替代、缺失或添加(或這些的任何組合)——包括等位變異——的任何 多肽，只要與如在本發明中使用的野生型蛋白質相比，生成的變體融合蛋白保留至少75%、 80%、85%、90%、95%、99%或更多的生物學或免疫學活性。典型地，本發明包括的FN14/TRAIL融合蛋白的變體將與SEQ. ID. NO. 1或SEQ. ID. NO. 2具有至少80%或更大的序列同一 性或同源性——如本領域中理解的這些術語，更優選地與SEQ. ID. NO. 1或SEQ. ID. NO. 2具 有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 甚至99%的序列同一性。序列同一性或同源性可以使用本領域中已知的標準技術進行測定，諸如由 Devereux 等人，Nucl. Acid Res. 12 :387-395(1984)描述的 Best Fit 序列程序或 BLASTX 程 序(Altschul等人，J. MoI. Biol. 215，403-410)。比對可以包括在待比對的序列中引入缺 口。另外，對於包含比本文公開的蛋白質更多或更少的胺基酸的序列，應理解的是，同源性 的百分比將基於同源胺基酸數相對於胺基酸的總數進行測定。另外，一般而言，雖然期望變體顯示增強的與給定分子結合的能力，但是在一些實 施方式中，變體可以被設計具有與本發明的其它融合相比稍微減小的活性，例如，在其中將 有目的地想削弱活性例如以減小神經毒性的情況中。而且，可以生成將更具選擇性地結合 TRAIL受體變體(在人中有三種TRWIL受體)之一的變體或衍生物。此外，可以生成將改變 多聚化性質的變體或衍生物。當改造變體時，這可以對整個TRAIL胞外域進行，或者對併入 融合蛋白自身的胞外域的組分進行。優選地，本發明的融合蛋白的變體或衍生物保持胺基酸序列的疏水性/親水性。 可以進行保守胺基酸的替代，例如進行1、2或3至10、20或30個替代，條件是修飾的序列 保留充當根據本發明的融合蛋白的能力。胺基酸替代可以包括使用例如非天然存在的類似 物以增加血漿半衰期。保守的替代在本領域是已知的，例如根據下表。在第二欄相同單元中並且優選地 在第三欄相同行中的胺基酸可以彼此替代
權利要求
1.包括第一結構域和第二結構域的融合蛋白，其中所述第一結構域是結合TWEAK配體 的多肽，而所述第二結構域是結合TRAIL受體的多肽。
2.權利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一結構域為而14蛋白的胞外域的至少一部 分，所述第二結構域為TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分。
3.權利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是SEQ.ID. NO 1或SEQ. ID. NO. 2。
4.基本上由第一結構域和第二結構域組成的融合蛋白，其中所述第一結構域為而14 蛋白的胞外域的至少一部分，所述第二結構域為TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分。
5.權利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一結構域是人而14，而所述第二結構域是 人 TRAIL。
6.與SEQ.ID. NO :1或SEQ. ID. NO. 2具有至少95%序列同一性的融合蛋白。
7.藥物組合物，其包括權利要求1所述的融合蛋白。
8.治療或改善患有自身免疫病的患者中的自身免疫病的方法，其包括施用權利要求7 所述的融合蛋白。
9.權利要求8所述的方法，其中所述自身免疫病是多發性硬化症。
10.權利要求8所述的方法，其中施用是腸胃外的。
11.抑制患者中T細胞的增殖和分化的方法，所述方法包括給需要這種治療的患者施 用!^14/TRAIL融合蛋白的步驟。
12.包括第一結構域和第二結構域的融合蛋白，其中所述第一結構域是結合TWEAK配 體的多肽，而所述第二結構域是具有抑制功能的多肽。
13.權利要求12所述的融合蛋白，其中所述具有抑制功能的多肽選自FasL、TNF、 PDL-I、PDL-2、B7x、B7-H3、B7 激動劑、CD 100、Cd5、Cd72、Ep-CAM、Fc y -RII、CD22、CD66a、 PIR-B 和 CD31。
14.權利要求12所述的融合蛋白，其中抑制性蛋白質是i^asL。
15.治療或改善患有自身免疫病的患者中的同種免疫性疾病的方法，包括施用權利要 求7所述的融合蛋白。
16.治療或改善患有癌症的患者中癌症的方法，包括施用權利要求7所述的融合蛋白。
17.權利要求16所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
18.權利要求16所述的方法，其中所述癌症是結腸癌。
19.權利要求16所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
20.權利要求16所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。
21.權利要求16所述的方法，其中所述癌症是惡性血液病。
22.權利要求16所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
23.權利要求16所述的方法，其中所述癌症是肝癌。
24.治療或改善患者中的自身免疫病、同種免疫性疾病或癌症的方法，通過給所述患者 施用有效量的編碼權利要求7所述融合蛋白的基因序列。
全文摘要
提供作用於TWEAK和TRAIL信號軸的融合蛋白。該蛋白質在治療或改善自身免疫病特別是多發性硬化症以及其它疾病諸如同種免疫性疾病和癌是有用的。
文檔編號C07K14/705GK102137869SQ200980133865
公開日2011年7月27日 申請日期2009年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者M·L·泰科辛斯基, M·拉茲馬拉 申請人:賓夕法尼亞大學