奶牛乳房炎多聯滅活菌苗的製作方法

2023-07-23 03:14:46

專利名稱：奶牛乳房炎多聯滅活菌苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種獸用生物製品及其製備方法，更確切地說，涉及一種預防奶牛乳房炎的多聯滅活菌苗及其製備方法。
背景技術：
奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是奶牛乳腺組織的炎症，主要為乳腺組織感染病原微生物所致，是奶牛的常見病、多發病。根據臨床表現可分為隱性型和臨床型乳房炎。引起奶牛乳房炎的致病菌約為一百五十多種，以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，約佔整個奶牛乳房炎病例的90％以上。其主要特徵是乳汁發生理化性質及細菌學變化，乳腺組織發生病理學變化。乳汁最重要的變化是顏色發生改變，乳汁中有凝塊及大量細胞。發生乳房炎時，雖然在許多病例乳腺出現腫大及疼痛，但大多數隱性奶牛乳房炎病例在用手觸診時難以發現異常，肉眼檢查也難以觀察到病理變化。
目前對奶牛乳房炎的防治，仍然以抗生素治療和環境衛生控制為主，但抗生素治療常常因為耐藥性的產生而療效不佳，造成嚴重的乳中抗生素殘留，危害人類身體健康。針對這一問題，國內外近些年來已經開始研究和使用菌苗免疫方法來預防和控制本病，並收到了一定的效果，如Ze′ev Trainin等人從金黃色葡萄球菌中分離出三種菌株，用其製成滅菌疫苗以防治牛羊乳房金黃色葡萄球菌感染(專利申請WO99/33954)，羅金印等人(《中國獸醫科技》，2003，33(4)61-63)以金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和停乳鏈球菌按一定比例混合輔以佐劑製成了鋁膠疫苗、油乳劑疫苗、蜂膠疫苗、脂質體疫苗和脂質體蜂膠疫苗，在臨床乳牛免疫接種實驗中蜂膠疫苗、油乳劑疫苗和鋁膠疫苗均表現出一定的效果，但總體免疫水平還不夠高。

發明內容
本發明的目的旨在提供一種成本低、安全、能夠用於預防奶牛隱性和臨床型乳房炎的多聯滅活菌苗及其製備方法。
本發明奶牛乳房炎多聯滅活菌苗，包含由金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌的滅活菌液以等量的比例(在混合前，金色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌的各自濃度均為6×1010CFU/ml。)混合得到的菌液，還包含經滅菌的20％氫氧化鋁凝膠，其中混合菌液與20％氫氧化鋁凝膠的按體積比例為4∶1。
本發明的多聯滅活菌苗的製備方法如下(1)選用臨床型奶牛乳房炎致病菌株作為制苗菌株；(2)製備菌苗生產用的種子液和增菌菌液；(3)純檢與滅活；(4)配製鋁膠多聯滅活菌苗；(5)無菌檢驗、安全性檢驗和效力檢驗。
具體步驟如下(1)選用臨床型奶牛乳房炎致病菌株作為制苗菌株將金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌劃線接種於含5％綿羊鮮血瓊脂培養基，大腸桿菌劃線接種於伊紅美藍和麥康凱培養基，37℃培養24h，觀察菌落生長情況，生化特性按常規方法進行。各菌株形態及主要生化特性應符合各自菌株的特徵，如金黃色葡萄球菌致病性檢測具有如下特徵能夠產生莢膜和溶血毒素，甘露醇發酵、過氧化氫酶、血漿凝固酶、溶纖維蛋白酶、耐熱Dnase試驗均為陽性。
(2)製備菌苗生產用的種子液和增菌菌液將菌種分別接種於10％綿羊血瓊脂培養基，37℃培養24h，經生物學特性檢定合格的純粹培養物，金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌分別接種於適量的BHI液體培養基，大腸桿菌接種於TSB液體培養基中，在37℃震蕩培養20～24h，置於2～8℃保存，作為種子液。將種子液按1～2％的量分別接種於BHI和TSB液體培養基中，在37℃培養20～24h，振蕩培養或連續通氣培養。菌懸液置2～8℃保存備用。
(3)純檢與滅活菌液培養完成後，分別取樣作純檢並計算菌數，合格菌液中分別加入終濃度為0.4％的甲醛溶液(v/v)，37℃振蕩培養24h，滅活徹底後，在4℃條件下，7000rpm/min離心20min，應用生理鹽水或pH7.2的PBS洗滌3次，得滅活菌懸液。其中金色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌的各自濃度均為6×1010CFU/mL。各滅活菌液分別加入0.01％的硫柳汞，混勻後置於2～8℃保存。
(4)配製鋁膠多聯滅活菌苗將所得5種滅活菌液等體積混勻，每4份菌液加入1份經滅菌的20％氫氧化鋁膠，混勻，分裝，製成鋁膠多聯滅活菌苗；菌苗充分振蕩後進行無菌檢驗、安全性檢驗和效力檢驗，合格後，放冷暗處保存。
(5)無菌檢驗、安全性檢驗和效力檢驗採用本發明的方法生產的產品可用於預防奶牛隱性和臨床型乳房炎。
本發明的產品優點體現在(1)由於該制苗菌液經甲醛徹底滅活，所以安全，絕無散毒危險。
(2)作為免疫原性強的多個菌株製備多聯滅活菌苗，其免疫效果好，特異性強。
(3)生產工藝先進、性能穩定，生產成本低，產品附加值高，適合工廠化生產，市場應用前景廣闊。
具體實施例方式
通過下面給出的本發明的具體實施例和安全性及免疫效力試驗可以進一步清楚地理解本發明，但下述實施例不是對本發明的限定。
實施例1取金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌劃線接種於含5％綿羊鮮血瓊脂培養基，大腸桿菌劃線接種於伊紅美藍和麥康凱培養基，37℃培養24h，觀察菌落生長情況並用常規生化方法鑑定其特性。
分離出的菌種分別接種於10％綿羊血瓊脂培養基，37℃培養24h，經生物學特性檢定合格的純粹培養物，金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌分別接種於適量的BHI液體培養基，大腸桿菌接種於TSB液體培養基中，在37℃震蕩培養24h，置於4℃保存，作為種子液。將種子液按1.5％的量分別接種於BHI和TSB液體培養基中，在37℃培養24h，振蕩培養或連續通氣培養。所得菌懸液置4℃保存備用。
菌液培養完成後，分別取樣作純檢，同時計算菌數，通過離心、濃縮，將金色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌的濃度均調整為6×1010CFU/mL。各菌液中分別加入終濃度為0.4％的甲醛溶液(v/v)，37℃振蕩培養24h，滅活徹底後，在4℃條件下，7000rpm/min離心20min，應用生理鹽水或pH7.2的PBS洗滌3次，得滅活菌懸液。各滅活菌液分別加入0.01％的硫柳汞，混勻後置於4℃保存。
將所得5種滅活菌液等體積混勻，每4份菌液加入1份經滅菌的20％氫氧化鋁膠，混勻，分裝，製成鋁膠多聯滅活菌苗；菌苗充分振蕩後進行無菌檢驗、安全性檢驗和效力檢驗，合格後，放冷暗處保存。
實施例2(1)安全性試驗選擇21-25日齡標準小白鼠10隻腹腔接種1mL菌苗，健康家兔5隻，背部皮下接種1mL菌苗，觀察14d。結果均正常，未見異常症狀。
選擇健康育成牛、正常泌乳牛和懷孕母牛各4頭，分別接種實施例1所得多聯滅活菌苗，每頭牛皮下分點注射10mL，觀察7d，檢查接種局部和全身的反應。結果只有1頭育成牛注射部位腫脹，1周左右恢復正常；其他接種牛均無明顯局部和全身反應。精神、體溫、食慾、呼吸和脈搏正常，泌乳母牛產奶量正常，懷孕母牛胎兒正常，無流產現象。
(2)免疫效力試驗取健康標準小白鼠50隻，分成兩組，每組25隻。一組小白鼠每隻皮下注射實施例1所得多聯滅活菌苗0.5mL，另一組皮下注射生理鹽水0.5mL。15d後，兩組分別應用致死量的(107CFU/mL)金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌液體培養物攻毒，每組各菌株分別腹腔接種5隻小白鼠，每隻接種1mL，觀察一周。結果無乳鏈球菌和乳房鏈球菌的免疫組和對照組均未見死亡，因為這兩種細菌對小白鼠沒有致病性；其它試驗免疫組中除1隻注射停乳鏈球菌的小白鼠死亡外，其餘均健活，對照組全部死亡。
(3)臨床免疫試驗在同樣飼養管理條件下，試驗隨機選擇了一個奶牛小區無乳房炎臨床症狀的泌乳期奶牛100頭，應用實施例1所得菌苗間隔21d進行兩次免疫接種，每次頸部皮下接種5mL，同時設對照組100頭。另外還選擇了一個奶牛小區無乳房炎臨床症狀的幹奶期奶牛30頭，同時設對照組30頭。在幹奶時、產前30d和產後48h進行3次免疫，每次頸部皮下接種5mL。免疫後觀察2周，奶牛的精神、食慾、體溫、注射部位和泌乳量均正常。經免疫後整個泌乳期的臨床發病情況觀察，兩個奶牛小區免疫牛群對臨床型奶牛乳房炎的保護率分別為60％和81％。
試驗證明奶牛乳房炎多聯滅活菌苗對育成牛、正常泌乳牛和懷孕母牛均安全、毒性小、無明顯副作用；該菌苗免疫小白鼠15d產生較強免疫力，保護率達80％以上；臨床應用表明，對臨床型乳房炎具有良好的預防效果，尤其是幹奶牛免疫效果更好，保護率達81％，免疫持續期最長可達10個月。
權利要求
1.一種奶牛乳房炎多聯滅活菌苗，由臨床型奶牛乳房炎致病菌的混合滅活菌液和經滅菌的20％氫氧化鋁凝膠組成，其中臨床型奶牛乳房炎致病菌包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌。
2.如權利要求1所述多聯滅活菌苗，其中臨床型奶牛乳房炎致病菌的混合滅活菌液由金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌的滅活菌液以等體積的比例配製而成。
3.如權利要求1或2所述多聯滅活菌苗，其混合滅活菌液在混合前金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌的各自濃度均為6×1010CFU/ml。
4.如權利要求1或2所述多聯滅活菌苗，其特徵在於混合菌液與20％氫氧化鋁凝膠的按體積比例為4∶1。
5.如權利要求1或2所述的多聯滅活菌苗的製備方法，其步驟如下(1)選取臨床型奶牛乳房炎致病菌株金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌，生化特性檢測合格後作為制苗菌株。(2)金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌分別接種於BHI液體培養基，大腸桿菌接種於TSB液體培養基，37℃培養24h，作為種子液。將種子液按1～2％的量分別接種於BHI和TSB液體培養基中，在37℃振蕩或連續通氣培養20～24h製備增菌菌液。(3)對步驟(2)所得菌液取樣作純檢，同時計算菌數。所得菌液分別加入最終濃度為0.4％的甲醛溶液(v/v)，37℃振蕩培養24h滅活，滅活徹底後，在4℃條件下，7000rpm/min離心20min，去上清液，沉澱物應用生理鹽水或pH7.2的PBS洗滌3次，得滅活菌懸液。其中金色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌的各自濃度均為6×1010CFU/mL。各滅活菌液中分別加入0.01％的硫柳汞，混勻後置於2～8℃保存。(4)將所得各滅活菌液等體積混勻，每4份混合菌液加入1份經滅菌的20％氫氧化鋁凝膠製成鋁膠多聯滅活菌苗。(5)對所得鋁膠多聯滅活菌苗進行無菌檢驗、安全性檢驗和效力檢驗。
全文摘要
本發明涉及一種用於預防奶牛乳房炎的多聯滅活菌苗，該菌苗組成為由4份一定濃度的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌的滅活混合菌液和1份經滅菌的20％氫氧化鋁膠組成。本發明還提供了該多聯滅活菌苗的製備方法(1)選用臨床型奶牛乳房炎致病菌株作為制苗菌株；(2)製備菌苗生產用的種子液和增菌菌液；(3)純檢與滅活；(4)配製鋁膠多聯滅活菌苗製劑；(5)無菌檢驗、安全性檢驗和效力檢驗。該製劑採用免疫原性強的多個菌株製備而成，其免疫效果好，特異性強，成本低，安全，避免了抗生素的耐藥性和汙染問題。
文檔編號A61P31/00GK1895666SQ200510012160
公開日2007年1月17日 申請日期2005年7月13日 優先權日2005年7月13日
發明者崔玉東, 朱戰波, 樸範澤 申請人:崔玉東, 朱戰波, 樸範澤