MAGE－10編碼cDNA,腫瘤排斥抗原前體MAGE－10,對該分子具有特異性的抗體及其用途的製作方法

2023-07-23 04:10:36

專利名稱：MAGE－10編碼cDNA,腫瘤排斥抗原前體MAGE－10,對該分子具有特異性的抗體及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤排斥抗原前體，編碼它們的核酸分子，對所述物質具有特異性的抗體及其用途。
背景及現有技術通過宿主生物體對癌細胞的識別或者缺乏識別的研究已經在許多不同的方面著手進行著。對該領域的了解假定對基礎免疫學和腫瘤學都有一些了解。
對小鼠腫瘤的早期研究表明當移植到同系基因的動物中時，這些物質表現為導致腫瘤細胞排斥的分子。這些分子被受體動物中的T-細胞「識別」，並且隨著被移植的細胞的溶解激發了細胞溶解的T-細胞的應答。這一證據首先是通過化學致癌劑、比如甲基膽蒽在體外誘導的腫瘤得到的。人們發現由腫瘤表達的並且引起T-細胞應答的抗原對每個腫瘤而言都是不相同的。對於用化學致癌劑誘導腫瘤的一般性的教導以及在細胞表面抗原方面的差別而言，參見Prehn等人，《J.Natl.Canc.Inst.》18769-778(1957)；Klein等人，《癌症研究》201561-1572(1960)；Gross，《癌症研究》3326-333(1943)；Basombrio，《癌症研究》302458-2462(1970)。這類抗原已經逐漸被稱作「腫瘤特異性移植抗原」或「TSTAs」。當由化學致癌劑誘導時隨著對上述抗原的呈遞的觀察，當在體外通過紫外輻射誘導腫瘤時得到了類似的結果。參見Kripke，《J.Natl.Canc.Inst.》53333-1336(1974)。
當對上述腫瘤的類型來說觀察了T-細胞介導的免疫應答的同時，人們認為自發性腫瘤通常是非免疫原性的。因此，人們相信這些腫瘤並不提供激發對腫瘤攜帶受試者中的腫瘤應答的抗原。參見Hewitt等人，《英國癌症雜誌》33241-259(1976)。
tum-抗原呈遞細胞系的家族是由小鼠腫瘤細胞或細胞系的誘變得到的免疫原性變體，正如Boon等人，《J.Exp.Med.》1521184-1193(1980)所述，該公開的內容插入本文僅供參考。為了進行仔細的研究，通過突變在同系基因小鼠中不產生免疫應答並且將形成腫瘤的腫瘤細胞(即「tum+」細胞)來得到tum-抗原。當誘變處理這些tum+細胞時，它們被同系基因小鼠排斥，並且不能形成腫瘤(因此為「tum-」)。參見Boon等人，《美國科學院學報》74272(1977)，該公開的內容插入本文僅供參考。已經表明許多的腫瘤類型呈現出這一現象。例如參見Frost等人，《癌症研究》43125(1983)。
tum-變體似乎不能形成進行性(progressive)腫瘤，這是因為它們引發了免疫排斥過程。支持這一假說的證據包括腫瘤的「tun-」變體、即那些沒有正常地形成腫瘤的變體在免疫系統受到亞致死照射抑制的小鼠中不形成腫瘤的能力，Van Pel等人，《美國科學院學報》765282-5285(1979)；並且觀察到肥大細胞瘤P815的腹膜內注射的tum-細胞按指數規律增殖12—15天，然後在淋巴細胞和巨噬細胞流入當中僅在幾天內tum-細胞就被清除了(Uyttenhove等人，《J.Exp.Med.》1521175-1183(1980))。進一步的證據包括即使當與隨後的細胞的攻擊一起供給免疫抑制劑量的輻射時，仍觀察到小鼠獲得了可以使它們抵抗隨後對同一tum-變體的攻擊的免疫記憶(Boon等人，《美國科學院學報》74272-275(1977)；Van Pel等人，如上所述；Uyttenhove等人，如上所述)。
隨後的研究發現當使自發性腫瘤發生突變時，生產出了產生應答的免疫原性變體。的確，這些變體能夠引起對原始腫瘤的免疫保護性應答。參見Van Pel等人，《J.Exp.Med.》1571992-2001(1983)。因此，已經表明可能會引起腫瘤中所謂的「腫瘤排斥抗原」的呈遞，而該抗原為同系基因排斥應答的目標。當已把外源基因轉染到自發性腫瘤中時，也已得到了類似的結果。關於這一點，參見Fearon等人，《癌症研究》482975-1980(1988)。
已經識別了一類抗原，它們呈遞在腫瘤細胞的表面上並且被溶解細胞的T細胞所識別、從而導致溶解。在下文中，這類抗原將被稱為「腫瘤排斥抗原」或「TRAs」。TRAs可以或者可以不引起抗體的應答。已對這些抗原研究的程度已經通過溶解細胞的T細胞的特徵鑑定研究來實現，即在體外通過具體的溶解細胞的T細胞(下文為「CTL」)亞型來鑑定抗原的研究。當識別了呈遞的腫瘤排斥抗原的時候，亞型便增殖，並且溶解呈遞腫瘤排斥抗原的細胞。特徵鑑定研究已經鑑定了特異性地溶解表達腫瘤排斥抗原的細胞的CTL克隆。在下列文獻中可以發現這一工作的實例Levy等人，《癌症研究進展》241-59(1977)；Boon等人，《J.Exp.Med.》1521184-1193(1980)；Brunner等人，《免疫學雜誌》1241627-1634(1980)；Maryanski等人，《歐洲免疫學雜誌》1241627-1634(1980)；Maryanski等人，《歐洲免疫學雜誌》12406-412(1982)；Palladino等人，《癌症研究》475074-5079(1987)。對於由CTLs識別的其它類型的抗原來說需要這種分析，其中包括次要組織相容性抗原，雄性特異性H—Y抗原，稱作「tum-」抗原的一類抗原以及在本文中討論的抗原。
上述主題的典型的腫瘤稱作P815。參見DePlaen等人，《美國科學院細胞》852274-2278(1988)；Szikora等人，《EMBO J》91041-1050(1990)，以及Sibille等人，《J.Exp.Med.》17235-45(1990)，這些公開的內容插入本文僅供參考。P815腫瘤為一種用甲基膽蒽在DBA/2小鼠中誘導的並且同時以體外的腫瘤和細胞系來培養的肥大細胞瘤。P815系在誘變後已經產生了許多的tum-變體，其中包括稱作P91A(DePlaen，如上所述)、35B(Szikora，如上所述)和P198(Sibille，如上所述)的變體。與腫瘤排斥抗原相反—並且這是一個主要的區別—tum-抗原僅僅呈遞於誘變處理腫瘤細胞之後。腫瘤排斥抗原呈遞於沒有誘變的某腫瘤的細胞上。因此，參考上述文獻，細胞系可以是tum+、比如稱作「P1」的系，並且可以被激發以生成tum-變體。由於tum-的表型不同於親代細胞系的表型，因此人們預料到與其tum+親代系相比在tum-細胞系的DNA中的差別，並且可以利用這一差別來確定在tum-細胞中感興趣的基因的位置。結果，發現tum-變體(比如P91A、35B和P198)的基因與其正常的等位基因的不同之處在於在所述基因的編碼區中的點突變。參見上述的Szikora和Sibille，以及Lurquin等人，《細胞》58293-303(1989)。這已經證明了不是本發明的TRAs具有的情況。這些論文也表明了由tum-抗原得到的肽是由用於通過CTLs識別的Ld分子呈遞的。P91A由Ld呈遞、P35由Dd呈遞、而P198由Kd呈遞。
於1992年5月22日提交的指定了同一代理人的作為主題申請的PCT申請PCT/US92/04354講述了一個人腫瘤排斥抗原前體編碼基因的家族、其稱作MAGE家族。這些基因中的幾種在van der Bruggen等人，《科學》2541643(1991)中也進行了討論。目前清楚的是在腫瘤細胞中表達MAGE家族的多種基因，並且對這些腫瘤的診斷以及對在那些文獻中討論的其它目的而言所述的基因可以起到標記物的作用。另外參見Traversari等人，《免疫遺傳學》35145(1992)；van der Bruggen等人，《科學》2541643(1991)和De Plaen等人，《免疫遺傳學》40360(1994)。
上面所引用的並且插入本文僅供參考的美國專利5,342,774講述了呈基因組DNA和cDNA形式的TRAPs的MAGE家族的多個成員。在上面引用的PCT申請PCT/US92/04354中，在SEQ ID NO22中講述了為920個鹼基對片段的MAGE-10的基因組DNA。DePlaen等人，《免疫遺傳學》40360-369(1994)討論了鑑定MAGE-10的485個核苷酸部分的PCR工作。另外參見Genbank登記號U10685，這些內容插入本文僅供參考。但是卻沒有討論cDNA分子。
前面引用的PCT申請一般性地討論了針對MAGE蛋白的抗體。Chen等人(Chen等人的美國專利5,541,104，這些內容插入本文僅供參考)講述了特異性地結合到腫瘤排斥抗原前體MAGE-1上的單克隆抗體。這份專利插入本文僅供參考。為了製備出單克隆抗體，Chen等人在大腸桿菌中生產出了不是全長的MAGE-1 TRAP，這是因為全長分子的表達有一定的困難。
但是，現在已經發現可以生產出既與MAGE-1又與MAGE-10 TRAP結合的單克隆抗體。考慮到上述文獻中的報導，這是令人吃驚的，因為用可以得到的有關MAGE-10的信息來生產上述抗體看起來是不可能的。根據SDS-PAGE發現由針對MAGE-10的cDNA編碼的TRAP為分子量約為72千道爾頓的分子。也已發現可以生產出對MAGE-10具有特異性的多克隆抗體。在下面的公開內容中顯示出這些以及本發明的其它方面。附圖的簡要描述

圖1顯示出Western印跡測定的結果，其中使用了電化學發光檢測以便測試出單克隆抗體與多種細胞裂解物的反應性。
圖2顯示出測試的結果，其中把該測試設計為確定在MAGE-1 cDNA存在的條件下是否可以誘導細胞系NA8-MEL生產出72千道爾頓的蛋白。優詵實施方案的詳細描述實施例1在大腸桿菌中以融合蛋白的形式製備出全長的重組MAGE-1蛋白。參見Schultz-Thater等人，《Int.J.Cancer》59435-439(1994)，該內容插入本文僅供參考。簡單說來，即把全長的MAGE-1 cDNA克隆到眾所周知的表達載體pET16b中。該載體可以使在N-末端含有10個組氨酸分子的融合蛋白表達。在Schultz-Thater操作後，培養大腸桿菌，在溶解所述細胞之後，在Ni2+柱上純化重組融合蛋白。當通過SDS-PAGE測試時，純化的物質顯示出48千道爾頓的主要的條帶。在接下來的實驗中使用了這種48kD的物質。實施例2在生產出重組MAGE-1融合蛋白後，每次都用溶解在含有完全弗氏佐劑的組合物中的20ug的重組蛋白對BALB/c小鼠進行腹膜內免疫接種，並接種兩次。接下來是兩次附加的注射，每次都用含有不完全弗氏佐劑的20ug的重組MAGE-1。然後按照Carrel等人，《癌症研究》402523-2528(1980)所述的方法，使小鼠的脾細胞與NS-1骨髓瘤細胞融合。培養得到的雜交瘤細胞，並且使用ELISA篩選來自培養物的上清液，以便測定出是否正在生成重組的MAGE-1特異性的單克隆抗體。ELISA涉及包被重組MAGE-1蛋白(250ng/50ul/孔)，接下來在4℃下培養過夜。加入上清液的樣品，接下來加入生物素綴合的綿羊抗小鼠Ig和鏈黴抗生物素蛋白—鹼性磷酸酶綴合物。
ELISA導致鑑定出289個生成了抗重組MAGE-1的抗體的雜交瘤。實施例3在接下來的一組實驗中，測試抗體以便確定是否可以使用這些抗體來免疫染色對MAGE-1的mRNA而言呈陽性的細胞。
一開始篩選雜交瘤，以便設法除去任何具有交叉反應性的單克隆。為了做到這一點，測試具有已知的並且具有MAGE-TRAP不同表達模式的細胞系。已知MZ2-MEL 3.1表達所有的MAGE-1，2，3和4；MZ2-MEL2.2表達MAGE-2和3；並且測試了U251、即對所有四種MAGE而言均呈陰性的成膠質細胞瘤的細胞系。在16孔的塑料室中培養細胞，所述的室安裝在冷丙酮中(0℃處理5分鐘)，然後儲存直至隨時可以在-20℃下使用。然後用0.3％H2O2封閉內源過氧化物酶(10分鐘)，隨後在0.1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝鹽水溶液中預溫育所述細胞30分鐘。這就生成了由Carrel等人如上所述的三層生物素/親和素/過氧化物酶系統的第一層。在固定了所述細胞之後，加入山羊抗小鼠IgG生物素綴合物(按照1∶50進行稀釋)，以生成第二層。最後，在以1∶1000進行稀釋後，加入親和素—過氧化物酶綴合物。在第二層和第三層的情況下，培養30分鐘、然後再培養15分鐘。用氨基—乙基咔唑觀察過氧化物酶，並使用Gill’s蘇木精記錄細胞染色的數目30秒。這組實驗結果發現了兩種mAbs、即6C1和6F2僅對MZ2-MEL 3.1細胞染色。然後將這兩個克隆用於一系列與已對MAGE-1，2，3和4的mRNA進行了測試的細胞有關的實驗中。針對MAGE-1 mRNA的表達，把細胞劃分為呈陽性或呈陰性。這是按照下列方法來測定的Rimoldi等人，《Int.J.Cancer》54527-528(1993)；Brasseur等人，《Int.J.Cancer》63375-380(1995)。簡單說來，使用眾所周知的可以通過商業途徑得到的方法和試劑從細胞樣品中提取總RNA，然後使總RNA進行逆轉錄並且使用MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3和MAGE-4特異性引物使其進行聚合酶鏈式反應。參見上述的Brasseur等人。下面的表1給出了這一工作的結果。它表明不管MAGE-2、3或4的表達狀態如何，兩種mAbs對所有的MAGE-1陽性細胞都染色。
在優選的實施方案中，在第二步驟中通過使用至少為1/秒的伸長速率至少5秒，使結晶作用得到增強。
可以根據本發明方法進行結晶的化合物是天然來源的維生素E的琥珀酸酯，或稱為d-α-琥珀酸生育酚酯(TS)。該化合物對應於以下結構式，其中鍵合到連接側鏈的相同碳原子上的甲基從雜環存在於其中的平面被定位朝向觀察者，而側鏈則被定位遠離觀察者和雜環存在於其中的平面，側鏈上兩個甲基被定位遠離觀察者和側鏈存在於其中的平面，而鍵合到側鏈中相同碳原子上的對應氫原子從側鏈存在於其中的平面定位朝向觀察者。我們也將該化合物稱為(2R，4』R，8』R)-α-琥珀酸生育酚酯。所述結構式為
在本發明中我們以其原意使用術語結晶以及類似含義的用語，並指結晶形成這個現象。
根據本發明，d-α-琥珀酸生育酚酯可在少量不妨礙本發明實施的其它物質的存在下進行結晶。因此，術語「d-α-琥珀酸生育酚酯」及縮寫TS指的是上述化合物以及適用於本發明方法中的、含有基於d-α-琥珀酸生育酚酯重量計不超過10％(重量)的其它物質的d-α-琥珀酸生育酚酯混合物。這些物質通常是存在的，因它們包括在此前的加工步驟中或存在於維生素E油(生育酚)原料中，並且將這些物質完全從TS中除去在經濟上是沒有吸引力的。具體的物質將取決於用來製備TS的特定方法，但我們通常可以將其認為是痕量的殘餘結晶溶劑、清洗試劑或琥珀酸或琥珀酸酐、生育酚等。
在本發明中TS是從流態中結晶出來的。術語「流體」以其一般含義使用，指TS由於一種外力而均勻地改變其形狀或方向。
表2—通過Western印跡用MAbs 6C1和6F12檢測細胞系中的MAGE-1蛋白和72kDa的蛋白western印跡 MAGE-mRNA細胞系MAGE-1 蛋白
黑素瘤；(b)成膠質細胞瘤；(c)骨髓白血病；(d)乳腺癌；(e)成神經細胞瘤；(f)成纖維細胞實施例7已知在體外在一些MAGE-1mRNA陰性細胞系中，通過5—氮雜—2』—脫氧胞嘧啶、一種甲基化不足試劑(「DAC」)可以誘導MAGE-1的表達。與三種MAGE-1mRNA陰性細胞系(IGR39，NA8-MEL和U251)一起培養上述試劑72小時，在取出裂解物之後，與單克隆抗體6C1一起進行培養。這一處理誘導了46kDa和72kDa兩種蛋白的生成。實施例8上面報導的令人感興趣的結果表明進一步進行實驗以測定72kDa蛋白的同一性。首先，使用可以通過商業途徑得到的系統，由黑素瘤細胞系MZ2-MEL43製備出黑素瘤的表達文庫。在製備之後，把噬菌體鋪成平板(約為4×105pfus)，並轉移到硝酸纖維素濾膜上。然後用5％奶粉的磷酸鹽緩衝鹽水的溶液封閉這些物質，隨後與單克隆抗體6C1一起進行培養(在RPMI/10％胎牛血清中以1∶4稀釋的雜交瘤上清液)。然後用PBS/0.5％Tween-20洗滌上述物質並與辣根過氧化物酶綴合的綿羊抗—小鼠IgG一起培養，其中是在PBS/5％奶粉的PBS溶液中以1∶3000進行稀釋的。接下來用5％的Tween-20再洗滌一次。如上所述採用ECL檢測信號。使所有的陽性噬菌斑進行第二次和第三次的篩選。然後挑選出陽性物質並將其轉移到含有噬菌體裂解緩衝溶液(20mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，0.1％Tween20)的試管中，並使用上述物質的等分試樣(5ul)來擴增噬菌體的插入片段。使用GTGGCGACGA CTCCTGGAG(SEQ ID NO1)和CAGACCAACT GGTAATGGTA GCG(SEQ ID NO2)它們均為λ引物、通過PCR擴增上述片段。循環參數為在94℃下處理1分鐘、在61℃下處理1分鐘、並在72℃下處理1分鐘、共循環30次，接下來在72℃下最後延伸10分鐘。
然後使用可以通過商業途徑得到的測序試劑盒以及SEQ ID NO1得到了所述克隆的一部分5』序列。參見Casanova，《分子生物學方法》23191-197(1993)。對12個克隆進行了測序，並且發現有三個與MAGE-10的基因組序列的是相同的，其中所述的序列如DePlaen等人，《免疫遺傳學》40360-369(1994)和Genbank登記號U10685所報導的。
然後使用SEQ ID NOS1和2以及可以通過商業途徑得到的系統來擴增一個插入片段。對這次擴增來說，循環參數為在94℃下處理15秒鐘、在61℃下處理30秒鐘、在72℃下處理1分鐘(循環10次)，在94℃下處理15秒鐘、在61℃下處理30秒鐘、在72℃下處理80秒鐘外加20秒鐘的循環延伸、共循環20次，接下來在72℃下處理10分鐘以進行最後的延伸。用限制性內切核酸酶NotI和SalI切割擴增產物，然後將其亞克隆到Bluescript質粒中。隨後使用T3和T7引物進行自動測序。經證實的為一部分的MAGE-10 cDNA序列(1400個鹼基對)，該序列對應於位於5』一端第2770個位置上的起點，並且在上述DePlaen等人所報導的基因組序列的3』一端之外延伸了660個鹼基對。實施例9使用從上述實驗中得到的信息，進行其它的工作以得到MAGE-10的全長的cDNA克隆。
正如所表明的那樣，上述部分的cDNA克隆長1.4kb。用限制性內切核酸酶使該片段進行消化，分離出對應於已知的gDNA序列的第2770-3510個核苷酸的HpaI片段，並且使用隨機引發DNA標記試劑盒對其進行32P標記。然後使用標記的探針篩選來自黑素瘤細胞系(Lyse-4)的兩個文庫，它們位於載體pcDNAI/Amp和pCEP4中。在65℃下，使用5×SSC、5×Denhardt’s、0.5％SDS和100ug/ml變性鮭精DNA，在濾膜上進行雜交。然後在室溫下用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜三次共10分鐘，在65℃下用1×SSC、0.1％SDS洗滌一次共洗20分鐘，並且在65℃下用0.1×SSC、0.1％SDS洗滌兩次共洗20分鐘。發現了10個陽性克隆，並使用用於pcDNAI/Amp載體的T7和SP6引物以及用於pCEP-4的pCEP-4正向引物自動進行測序。分離出幾種MAGE-10克隆，並且根據3』一端的不同而歸入兩個類別(分別為2.5kb和1.5kb)。這一差別可能是由於在針對所述文庫的cDNA合成期間由交替的(alternate)寡脫氧胸苷酸引發造成的。除了位於5』一端的開頭的50-70個核苷酸之外，所有的克隆看起來都是相同的。與至少四個外顯子的描述了其存在的已知的基因組序列相比，最後的兩個與上述DePlaen等人預測的是相同的(第1740—1814位，以及1890—末端)。第二個外顯子對應於第603—701位，而第一個外顯子似乎與任何事先識別的MAGE-10序列都不對應。在最後的外顯子中發現了開放讀框。序列示於SEQ ID NO3中。在通過這些實驗獲得的收集的序列信息的基礎上，開頭的大約100個鹼基表示共有序列。實施例10如上所述，從pcDNAI/Amp文庫中分離出三個克隆，並使用它們在體外進行轉錄和翻譯。這些插入片段大約長1.5千鹼基，在大約第3156的位置上終止，其中使用了基因組序列計數。使用可以通過商業途徑得到的系統翻譯1ug的每種DNA，並把螢光素酶對照質粒用作對照。對翻譯產物進行PAGE分析，並把非放射性標記的產物的複製凝膠轉移到膜上，在該膜上使用mAb 6Cl或如下所述製備的多克隆抗體進行Western印跡。放射性標記的物質顯示出來自經測試的所有三個克隆的72千道爾頓的蛋白，這表明mAb與MAGE-1和MAGE-10之間具有交叉反應性。實施例11抗MAGE-10的多克隆抗血清製備如下。製得了免疫原性的MAGE-10衍生的肽(H)QDRIATTDDTTAMASASSSATGSFSYPE(OH) (SEQ IDNO4)，即MAGE-10的一部分推導的胺基酸序列，這正好是這種肽與輔助肽P-30的雜交體。
如per Valmori等人，《免疫學雜誌》149717-721(1992)所述，輔助肽P30是眾所周知的。它是一種破傷風毒素T細胞表位，具有如下的胺基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO5)。把這些肽以400ug/ml溶解在100mM Tris-HCl，pH 7.5，0.9％NaCl中。在56天的時間內免疫接種兔子，其中在第0天用雜交的肽(0.5ml)接種、在第14天用MAGE-10肽(0.5ml)接種、在第28天第二次注射0.5ml的雜交肽、並且在第56天最後注射0.5ml的MAGE-10肽。
針對與MAGE-10的反應性，以不同的測定方法來測試根據這一方案生成的抗血清。具體地講，沿著上述提出的路線，在Western印跡實驗中測試對應於SEQ ID NO3的cDNA表達的體外翻譯產物。發現所述的抗血清結合到通過體外表達生成的蛋白上。從黑素瘤的裂解物中還識別出了72kDa的條帶。在ELISA中，發現多克隆抗體識別所述的MAGE-10肽。
前面的實驗描述了特異性地結合到腫瘤排斥抗原前體TRAP上的單克隆抗體的生產。
因此，本發明涉及MAGE-10結合的單克隆抗體以及生產所述抗體的雜交瘤。發現mAbs在測定MAGE-10的表達中是有用的。可以加入mAbs(例如以標記的形式)，結合到固相上，或者用其它方法處理以提高MAGE-10檢測的靈敏度。考慮到可以使用mAbs的方式，本發明包括任何一種標準類型的免疫測定，其中包括ELISAs、RIAs、競爭測定、凝集測定以及所有其它的測定。例如在診斷或監測癌症的存在或發展中，MAGE-10表達產物的檢測是很有用的。
分離的MAGE-10蛋白也是本發明的一個特徵。正如SDS-PAGE測得的，該分子的分子量約為72kDa，並且當為SEQ ID NO4的肽時它作為免疫原是很有用的，通過上述實施例所示它具有免疫原性。優選地，這些物質與合適的佐劑結合使用。
編碼MAGE-10的分離的cDNA也是本發明的一個特徵、比如SEQ IDNO3的cDNA。本發明的另一部分為cDNA分子，該分子具有在嚴格條件下(例如在65℃下0.2×SSC、0.1％SDS，或者更優選為0.1×SSC)與SEQ ID NO3雜交的互補序列。這些序列至少應當包括SEQ ID NO3的按照5』到3』順序的第164—574個核苷酸。由SEQ ID NO3的第164—185以及553—574個核苷酸組成的核酸分子作為探針和/或引物是特別有用的，並且它們也是本發明的一部分。當可操作地連接到啟動子上時，可以以表達載體的形式使用所述序列，然後用於轉化或者轉染細胞，以便生成多種重組的真核細胞系和原核細胞株。類似地，上述序列以及諸如SEQ ID NOS1和2這樣的序列可以用於各種雜交測定中、比如基於PCR的測定。對本領域的普通技術人員來說，這些都是眾所周知的並且在此不必重複。
把已經採用的術語和表達用作描述的術語、而並非是限制性的，並且不打算在上述術語和表達的使用中排除任何與所顯示的和描述的特徵或其部分等同的內容，應當認識到各種的改進都可能在本發明的範圍內。(1)一般信息(i)申請人Rimoldi，Donata；Jongeneel，Victor；Coulie，Pierre；Cerrottini，Jean-Charles；Carrel，Stefan；Reed，Daryl(ii)發明名稱MAGE-10編碼cDNA，腫瘤排斥抗原前體MAGE-10，對該分子具有特異性的抗體及其用途(iii)序列數3(iv)通訊地址(A)地址FelfeLynch(B)街道805第三大道(C)城市紐約市(D)州紐約(E)美國(F)郵政編碼10022(v)計算機可讀形式(A)存儲媒體類型軟盤，3.5英寸，144kb存儲量(B)計算機IBM(C)作業系統PC-DOS(D)軟體Wordpeffect(vi)目前申請資料(A)申請號(B)申請日(vii)在先申請資料(A)申請號US08/724,774(B)申請日1996年10月3日(C)分類號435(viii)律師/代理人信息
(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登記號30,946(C)證書號LUD5457-PCT(ix)電信信息(A)電話(212)688-9200(B)電傳(212)838-3884(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特徵(A)長度19個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO1GTGGCGACGA CTCCTGGAG19(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特徵(A)長度23個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2CAGACCAACT GGTAATGATA GCG 23(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特徵(A)長度2559個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO3TCCGGGGTCG CTCGAGCCGG CCGGGACTCG GGGATCASAA GTAACGGCGG 50YYMKYGTKCT GAGGGACAGG CTTGAGATCG GCTGAAGAGA GCGGGCCCAG 100GCTCTGTGAG GAGGCAAGGG AGGTGAGAAC CTTGCTCTCA GAGGGTGACT 150CAAGTCAACA CAGGGAACCC CTCTTTTCTA CAGACACAGT GGGTCGCAGG 200ATCTGACAAG AGTCCAGGTT CTCAGGGGAC AGGGAGAGCA AGAGGTCAAG 250AGCTGTGGGA CACCACAGAG CAGCACTGAA GGAGAAGACC TGCCTGTGGG 300TCCCCATCGC CCAAGTCCTG CCCACACTCC CACCTGCTAC CCTGATCAGA 350GTCATCATGC CTCGAGCTCC AAAGCGTCAG CGCTGCATGC CTGAAGAAGA 400TCTTCAATCC CAAAGTGAGA CACAGGGCCT CGAGGGTGCA CAGGCTCCCC 450TGGCTGTGGA GGAGGATGCT TCATCATCCA CTTCCACCAG CTCCTCTTTT 500CCATCCTCTT TTCCCTCCTC CTCCTCTTCC TCCTCCTCCT CCTGCTATCC 550TCTAATACCA AGCACCCCAG AGGAGGTTTC TGCTGATGAT GAGACACCAA 600ATCCTCCCCA GAGTGCTCAG ATAGCCTGCT CCTCCCCCTC GGTCGTTGCT 650TCCCTTCCAT TAGATCAATC TGATGAGGGC TCCAGCAGCC AAAAGGAGGA 700GAGTCCAAGC ACCCTACAGG TCCTGCCAGA CAGTGAGTCT TTACCCAGAA 750GTGAGATAGA TGAAAAGGTG ACTGATTTGG TGCAGTTTCT GCTCTTCAAG 800TATCAAATGA AGGAGCCGAT CACAAAGGCA GAAATACTGG AGAGTGTCAT 850AAAAAATTAT GAAGACCACT TCCCTTTGTT GTTTAGTGAA GCCTCCGAGT 900GCATGCTGCT GGTCTTTGGC ATTGATGTAA AGGAAGTGGA TCCCACTGGC 950CACTCCTTTG TCCTTGTCAC CTCCCTGGGC CTCACCTATG ATGGGATGCT 1000GAGTGATGTC CAGAGCATGC CCAAGACTGG CATTCTCATA CTTATCCTAA 1050GCATAATCTT CATAGAGGGC TACTGCACCC CTGAGGAGGT CATCTGGGAA 1100GCACTGAATA TGATGGGGCT GTATGATGGG ATGGAGCACC TCATTTATGG 1150GGAGCCCAGG AAGCTGCTCA CCCAAGATTG GGTGCAGGAA AACTACCTGG 1200AGTACCGGCA GGTGCCTGGC AGTGATCCTG CACGGTATGA GTTTCTGTGG 1250GGTCCAAGGG CTCATGCTGA AATTAGGAAG ATGAGTCTCC TGAAATTTTT 1300GGCCAAGGTA AATGGGAGTG ATCCAAGATC CTTCCCACTG TGGTATGAGG 1350AGGCTTTGAA AGATGAGGAA GAGAGAGCCC AGGACAGAAT TGCCACCACA 1400GATGATACTA CTGCCATGGC CAGTGCAAGT TCTAGCGCTA CAGGTAGCTT 1450CTCCTACCCT GAATAAAGTA AGACAGATTC TTCACTGTGT TTTAAAAGGC 1500AAGTCAAATA CCACATGATT TTACTCATAT GTGGAATCTA AAAAAAAAAA 1550AAAAAAAAGT TGGTATCATG GAAGTAGAGA GTAGAGCAGT AGTTACATTA 1600CAATTAAATA GGAGGAATAA GTTCTAGTGT TCTATTGCAC AGTAGGATGA 1650CTATAGTTAA CATTAAGATA TTGTATATTA CAAAACAGCT AGAAGGAAGG 1700CTTTTCAATA TTGTCACCAA AAAGAAATGA TAAATGCATG AGGTGATGGA 1750TACACTACCT GATGTGATCA TTATACTACA TATACATGAA TCAGAACATC 1800AAATTGTACC TCATAAATAT CTACAATTAC ATGTCAGTTT TTGTTTATGT 1850TTTTGTTTTT TTTTAATTTA TGAAAACAAA TGAGAATGGA AATCAATGAT 1900GTATGTGGTG GAGGGCCAGG CTGAGGCTGA GGAAAATACA GTGCATAACA 1950TCTTTGTCTT ACTGTTTTCT TTGGATAACC TGGGGACTTC TTTTCTTTTC 2000TTCTTGGTAT TTTATTTTCT TTTTCTTCTT CTTCTTTTTT TTTTTTAACA 2050AAGTCTCACT CTATTGCTCT GGCAGGAGTG CAGTGGTGCA GTCTCGGCTC 2100ACTGCAACTT CCGCCTCCTG GGTTCAAGCG ATTCTCCTGC CTCAGTCTCC 2150TGAGTAGCTG GGATTACAAG TGTGCACCAC CATACCCGGC TAATTTTGTA 2200TTTTTTAGTA GAGATGGGGT TTCACCATGT TGGCCAGGCT GGTCTCAAAC 2250TCCTGACCTC AGGTAATCTG CCCGCCTCAG CCTCCCAAAG TGCTGGGATA 2300ACAGGTGTGA GCCCACTGCA CCCCAGCCTC TTCTTGGTAT TTTAAAATGT 2350TGTTACTTTT ACTAGAATGT TTATGAGCTT CAGAATCTAA GGTCACACGT 2400TCGTTTCTGT TTATCCAGTT TAAGAAACAG TTTTGCTATT TTGTAAAACA 2450AATTGGGAAC CCTTCCATCA TATTTGTAAT CTTTAATAAA ATAACATGGA 2500ATTGGAATAG TAATTTTCTT GGAAATATGA AAAAATAGTA AAATAGAGAA 2550AATAATTTT 2559
權利要求
1. 編碼MAGE-10腫瘤排斥抗原前體的分離的cDNA分子，其互補序列在嚴格條件下與SEQ ID NO3的第164-574個核苷酸雜交。
2. 權利要求1的分離的cDNA分子，它包括SEQ ID NO3的第67-2559個核苷酸。
3. 權利要求1的分離的cDNA分子，它包括SEQ ID NO3。
4. 包括權利要求1的分離的cDNA分子的表達載體，所述cDNA分子可操作地連接到啟動子上。
5. 用權利要求3的表達載體轉染或轉化的真核細胞系或者原核細胞株。
6. 分離的MAGE-10腫瘤排斥抗原前體，它具有如SDS-PAGE測得的約為72千道爾頓的分子量。
7. 由權利要求1的分離的cDNA分子編碼的分離的MAGE-10腫瘤排斥抗原前體。
8. 結合到權利要求6的分離的腫瘤排斥抗原前體上的單克隆抗體。
9. 由SEQ ID NO4的胺基酸序列組成的分離的腫瘤排斥抗原前體衍生的肽。
10. 包括權利要求6的分離的MAGE-10腫瘤排斥抗原前體和佐劑的免疫原性組合物。
11. 包括權利要求9的肽和佐劑的免疫原性組合物。
12. 多克隆抗血清，它是通過在有利於對其產生免疫應答的條件下用權利要求8的肽免疫接種非人的動物並由此分離出生成的抗血清來獲得的。
13. 用於測定樣品中MAGE-10腫瘤排斥抗原前體的存在的方法，該方法包括將所說的樣品與權利要求8的單克隆抗體接觸並且測定它們之間的結合。
14. 用於測定樣品中MAGE-10腫瘤排斥抗原前體的存在的方法，該方法包括將所說的樣品與權利要求12的多克隆抗血清接觸並且測定它們之間的結合。
15. 雜交瘤細胞，在該細胞中生成了權利要求8的單克隆抗體。
16. 權利要求8的單克隆抗體，其中所說的抗體是人源化的。
全文摘要
編碼腫瘤排斥抗原前體MAGE－10的分離的cDNA分子、其蛋白質、針對其的抗體以及這些物質的用途為本發明的一部分。
文檔編號C07K14/00GK1239479SQ97180275
公開日1999年12月22日 申請日期1997年9月10日 優先權日1996年10月3日
發明者多娜塔·裡莫爾迪, 維克託·揚尼爾, 皮埃爾·庫利耶, 讓－查爾斯·切羅蒂尼, 斯特凡·卡雷爾, 達裡爾·雷德 申請人:路德維格癌症研究所