具有血栓溶解、抗炎和細胞保護性能的藥物組合物的製作方法

2023-07-22 19:32:21

專利名稱：具有血栓溶解、抗炎和細胞保護性能的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，特別涉及藥理學和以酶製劑為基礎的藥劑，它可能用於綜合治療局部缺血性心臟病、局部缺血性腦中風、類風溼病以及其他伴有局部缺血、血栓形成和非特異性炎症等疾病。
本發明包含血栓形成蛋白的酶水解領域，主要是血纖維蛋白領域，該蛋白是所有血栓的結構形成蛋白，並且與肽的位置和大小無關。本發明比較具體地涉及含有蛋白水解酶的化合物，酶固定(附加)於親水的水溶的聚合物上並具有溶解纖維蛋白的特性。本發明還涉及治療急性心肌梗塞、局部缺血腦中風時，使用上述化合物進行溶解纖維蛋白治療的方法以及涉及治療各種病原(包括由於微血栓形成)的器官和組織局部缺血損傷而進行的血液流變特徵的矯正(改善)的治療方法。
背景技術：
已知已經有應用於治療局部缺血性心臟病和局部缺血性腦中風疾病的各種藥劑。通常，這些疾病的晚期，其基本發病機制因素是形成血管內血栓。在現代醫學實踐中，治療急性心肌梗塞和局部缺血腦中風，普遍應用血栓溶解藥劑作為病原治療的手段。已知的藥劑有，諸如，鏈激酶、鏈球菌激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化劑(組織纖維蛋白溶酶原激活物)和纖維蛋白溶酶(對急性心梗塞病人早期治療措施的推薦方法，美國心臟病學院和美國心臟學協會通報，「彙編」，V.N.加紐克夫主編，新西伯利亞市，1998年，第100頁俄文譯本)。這些藥劑都是直接或者藉助活化血液的抗凝系統，使之作用於纖維蛋白，使其遭到破壞，從而達到使血管內的血栓得到溶解的目的。這種治療法儘管能夠獲得很高的治療效果，可是具有明顯的副作用，那就是容易造成無法控制的和危險的出血事故，這是因為服用上述那些藥劑，會使凝血系統衰竭(Saunders W.B.Indications for Fibrinolytic Therary Trialists CollaborativeGroup.//Lancet Ltd.，1994，vol.343，pp.311-322)。另外，對於鏈激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑，難於確定適當的治療劑量，因為在人體內具有對鏈球菌的單獨的抗血清活性，其會導致使這些藥劑失活。
已知，有的藥劑具有降低炎症反應的能力，其中最為普遍應用的是非類固醇抗炎藥，諸如，阿斯匹林、抗炎痛(吲哚美辛)、雙氫芬鈉及其他(納索諾夫E.L.，赤維特克娃V.S.，和託福N.L.，環氧化酶-2的選擇性抑制劑人類疾病治療的新前景，「藥劑檔案」，1998，No.5，第8-14頁，俄文本)，上述已知的藥劑具有很大缺點，那就是會損傷胃，從而引發非類固醇胃病、出血和腸胃道系統黏膜潰瘍。
已知的具有細胞保護特性的藥劑，諸如，普列都塔(preductal)(心臟保護作用)和H2受體阻滯劑[胃則平(gastrozepine)、雷尼替丁]。長期使用上述已知的藥劑時，會顯現出抗藥性，造成這些藥只有很弱的細胞保護作用(Brottier L，Barat j.L.Combie C et al.Therapeutic value of acardioprotective agent in patients with severe ischaemic cardiomyopathy//Eur.Heart J，1990，vol.11，pp 207-212)。
目前在科學和醫學文獻中還沒有記載治療局部缺血、發炎和血栓形成的主要發病環節的具有多目協同作用的藥物組合物，該藥物還應具有細胞保護特性。
曾經報導過關於使酶包括蛋白酶，固定在一系列聚合物載體上的各種方法。例如，R.I.隆爾塔尼克等在「治療化膿性疾病過程中被固定的蛋白酶」(新西伯利亞市，(1981)，第3-8頁，俄文本)工作中闡述了用共價地結合於纖維素固體小顆粒的蛋白水解酶治療化膿性疾病、膿腫和蜂窩織炎的方法。O.A.別列金等在「眼科學」雜誌，1987，No.3，第145-148頁和貢恰爾等在「獸醫學」雜誌，1989，No.4，第52-55頁闡述了具有附著蛋白酶的液體聚合物的應用。在大多數情況下，曾經使用了雙功能的化學試劑作為連接劑，後者的一個化學基團與酶蛋白的胺基酸殘基結合，同時另一個反應基團與聚合物載體連接。曾經研究了一系列化學操作方法，以便使各種酶共價地結合到固體載體上。然而，結合到固體小顆粒或纖維上的蛋白酶，不但不能治療導致血管內的血栓形成的損傷和疾病，還會造成組織和器官的微循環通道內的血液流變學的負面變化。
綜上所述，急需能夠有效地水解蛋白的化合物，這些蛋白主要是會造成在不同直徑的血管中形成血栓，而後者又是發展像諸如，急性心肌梗塞和腦中風的病因。用於綜合治療局部缺血性心臟病、高血壓、類風溼疾病的這些含有無毒性的血栓溶解體的化合物和血液流變學的修正功能的物質在目前還沒有合成成功。同樣，也需要一種簡單、價廉和方便的方法，而且能夠同時將蛋白酶附加到聚合物載體絡合物上，並且提供最終產品的滅菌消毒。理想的方法是可以生產出各種粘度和聚集狀態、能夠用於各種目的和各種施藥方法的化合物。

發明內容
本研究可以滿足上述要求並且比其他藥劑和藥物組合物製備方法優越，對局部缺血性心臟疾病的各種發病環節具有綜合協同治療作用。此外，由於細胞保護、血栓溶解和抗局部缺血效應本發明要求的藥物組合物以及其製備方法在治療非特異性炎症時能夠達到很高的治療效果。
本發明涉及提供藥物組合物，其用於選擇性水解血栓形成蛋白，該藥劑由活性蛋白酶組成，它附加於親水的、水溶性的聚合物上。本組合物主要由固定於親水聚合物上的枯草溶菌素組成。
本發明致力於開發這樣的藥物組合物的製備方法，即使蛋白酶附加於水溶性聚合物上，從而形成混合物，同時用照射，具體是用加速電子流，或者γ-射線以及其他種類的離子化照射，包括使用雷射源，對混合物進行滅菌消毒。
本發明致力於開發新的藥物組合物，用於水解血栓形成蛋白，該藥劑由附加於親水性的聚合物的活性蛋白酶組成。這樣的組合物有利於去除血栓，包括血纖維蛋白和其它形成物。本發明還致力於開發新的化合物，以修正組織和器官內由於形成血栓和局部缺血造成的病理學變化，也致力於改善非特異性炎症反應，並可以作為治療和預防由於使用非類固醇的抗炎症藥劑造成的胃病的輔助手段。本發明的固定在水溶性的、親水性聚合物上的蛋白酶能夠選擇性地使血栓蛋白、主要是血纖維蛋白降解。與此同時，活細胞和功能性活性蛋白會完整保留下來並不被損壞。為了血栓物質蛋白的有效水解，優選使用善於辨別和能夠水解各種肽鍵的蛋白酶的多功能混合物。天然的蛋白酶包括，例如，枯草溶菌素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、番木瓜蛋白酶以及其他具有纖維蛋白溶解的和蛋白水解活性的動物和細菌來源的酶。
雖然蛋白酶可以由任意來源得到，包括動物和植物蛋白酶，但是特別優先選擇細菌蛋白酶。因為細菌蛋白酶與其他類型的蛋白酶相比，比較便宜，而且一般是可以數量不受限制地獲得。本發明優先選擇的細菌蛋白酶可以由Bac·Subtilis(枯草桿菌)繁殖，已知的如枯草溶菌素。優先選用中性和/或鹼性的枯草溶菌素混合物，因為該混合物可以選擇性地降解各種肽鍵並在PH值為6-10的範圍內保留其活性。
本發明的蛋白酶附加於水溶性聚合物組合，後者的作用是作為蛋白水解酶的載體。比較優先選用的水溶性聚合物是聚氧化乙烯物(PEO)synonym聚乙二醇(PEG)，其分子量為1500KDa(PEO-1500)和葡聚糖，其分子質量為30-40KDa。聚氧化乙烯和葡聚糖具有或多或少的分子量，也可用於代替PEO-1500或者與PEO-1500和具有30-40KDa分子量的葡聚糖共同使用。也可以使用其他合適的水溶性聚合物以及它們可以使用的組合包括，例如，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮等。
本發明的組合物可以呈任何非固態或者固態形式，或者呈團粒組合形式。本組合物根據該化合物計劃用於何領域，優先選用與水溶性聚合物的各種組合的凍乾粉(物質)。
為了達到總的治療特性，可以向本組合物中添加抗體、治療性消毒劑、糖類皮質激素、組織再生刺激素以及其他治療劑。為獲得好效果，在沒有查明上述這些添加劑對本發明組合物的特殊的和治療活性的影響之前，上述這些添加劑不應該大量與蛋白酶混合使用。
本發明也推薦將蛋白酶附加於水溶性聚合物並同時用照射對所形成的混合物進行滅菌消毒來製備組合物的方法。優先選擇的照射種類為加速電子或者γ-射線。
製藥工藝簡述如下蛋白酶混合物溶液(優先選用枯草溶菌素及水溶性聚合物，優先選用聚氧化乙烯和葡聚糖)被來自電子加速器的電子進行作用，其劑量能夠促進附加於聚合物載體並且同時對所得到的化合物進行滅菌消毒。另一方面，鈷-60發射的γ-射線可用於代替電子束並能提供組份的附加和滅菌消毒。該領域的專家能夠選擇足夠的劑量，其既要考慮提供混合物無菌同時還要考慮對酶的蛋白水解活性不產生明顯的影響。
最後，本發明也致力於清除血管中的血栓的方法，即施用或者使用有效數量的本發明組合物去除血栓。本發明的組合物可用作治療劑，在各個方面，諸如醫學、口腔學、獸醫學和個人護理方面均能取得良好的功效。
據此，本發明的組合物特別適用於治療局部缺血性心臟病及其併發症、還有局部缺血腦中風、類風溼病以及其他疾病。它們的發病機制中具有發炎反應、組織局部缺血、破壞血液流變學和由於形成血栓破壞了血管的微循環。本發明的藥物組合物也適用於粘性生物液體，諸如，分泌粘液(例如，支氣管分泌物)的酶促破壞，所以本組合物可以有效治療肺病，可用於治療和預防支氣管梗阻。本發明的藥物組合物也適用於壞死組織的蛋白和肽的酶促破壞，這種壞死組織總是存在於外傷性的和傳染髮炎病例中，所以本組合物對治療各種病因學和局部化膿性、發炎性病症均有效。
這些組合物可以用醫學上，用已知的任何方法施加到病灶患處。這些方法包括，例如，非腸道的施用，腔內用和外用，氣溶膠噴霧，使用導液管注射，支氣管鏡檢驗或者其他合適的施用。施藥方法至少部分地與損傷部位的狀況和需要去除的血栓形成組織的類型和數量或者與壞死組織有關係。
本藥劑(組合物)優選的施藥方法是非腸道給藥的方法。


圖1表示在體外血栓溶解模型上研究的本發明組合物的血栓溶解性。
標準治療劑量即50生理單位/ml(50PhU/ml)的本發明組合物確實勝過了纖維蛋白溶酶(P＜0.02)；胰蛋白酶(P＜0.01)；和在生理作用溶液中的自發血栓溶解(P＜0.01)。
圖2表示隨著血栓「年齡」的增長到7天，本發明組合物仍然保持血栓溶解特性。纖維蛋白溶酶不作用於7天的血栓。在生理作用的溶液中頭兩個小時，纖維蛋白溶酶對血栓的作用與自發的背景溶解準確地無差異。在臨近第4個小時終結時，本發明組合物完全溶解了血栓，而與此同時，纖維蛋白溶酶只溶解了「陳舊」血栓質量的20％。
圖3表示本發明組合物的抗炎特性，這是在發炎介體感應模型上，即在線鼠CBA內黴素休克時腫瘤的壞死因子(αTNF)模型上進行的研究。使用L929細胞[以活性單位(Au)表示]測定了αTNF的活性。
圖中1-完整的動物的αTNF；2-對動物給予內黴素後αTNF的活性3-動物在給予內黴素前1小時，給予本發明組合物的αTNF的活性。可以看出，本發明組合物降低了αTNF的活性50倍。
圖4表示本發明組合物的細胞保護特性，這是在對大鼠腎上腺素心肌炎模型上研究的。給出了大鼠心肌壞死和營養不良變化的容積量的組織學和形態測量學的研究數據。採用測面積的方法，測定被損害的體積並用體積密度％表示，它等於被損害的體積/比上組織的總體積，再乘以100％。
圖中符號標示K壞死—對照組的動物，對它們引入腎上腺素後，往腹部引入1ml NaCe等滲溶液，2次/天；TRB壞死—試驗組的動物，往腹部引入腎上腺素後情況，引入1ml本發明組合物，2次/天。
圖4的頭兩個柱形圖表示動物處理到第三天臨近終結時，本發明組合物的正面效果(降低心臟肌肉壞死數量大約1.5倍)。
後兩個的兩個柱形圖，表示動物被處理到第7天臨近終結時，本發明組合物的正面效果(心肌內減少營養不良(萎縮)變化，大約降低2.5倍)。
下面舉例演示本發明組合物的成分，製備方法和藥理學特徵。當然，本發明並不受它們局限。
具體實施例方式
實施例1採用下列方法製備本發明的藥物組合物製備反應混合物的方法是在葡聚糖(分子量為40-70kDa、優選40kDa)溶液中，在0.025M的磷酸鈉緩衝溶液中(其pH值為7.5-8.2)溶解原枯草菌素(protosubtilin)，優選原枯草菌素G3Kh和聚氧化乙烯(PEO)(其分子質量為400-20000Da，優選1500Da)。將所得到的混合物用去除惰性和無用的蛋白辦法進行純化，具體辦法是用鹽沉澱，接下來進行過濾。用γ-射線或者加速電子束(能量為2.0MeV)，劑量為0.5-1.5Mrad，對所得到的溶液進行照射。照射之後對溶液進行滅菌消毒性過濾並按10ml為一份分裝到小瓶中，每個小瓶的容量為15ml。然後用凍幹法將溶液乾燥到殘餘水分不大於2％。
結果得到含有固定在聚氧化乙烯和葡聚糖上、由枯草芽孢桿菌(Bac.Subtilis)組成的蛋白酶絡合物的組合物。所製得的組合物在一個小瓶內的蛋白水解活性為500-1000.0蛋白水解單位/克(PU/g)。本組合物呈多孔狀、均質的略帶黃色的物質。
為了治療目的，使用本發明組合物溶液(暫命名為「血栓瓦吉姆」(Trombovazim))，可將其當場製成。為此，溶解小瓶內的內含物於10ml氯化鈉的滅菌的等滲溶液內或者溶解於10ml注射用水中。
實施例2本發明組合物可以用另外的方法製取，即分別製備含有固定在聚氧化乙烯和葡聚糖上的蛋白酶絡合物的活性組份(第1組份)和溶劑——聚氧化乙烯溶液(第2組份)。通過改變活性組份/溶劑的比例關係的辦法，組合物的雙組分成分可以改變本發明藥物組合物的活性，從而能夠選擇各種單獨的治療方案。
採用下列辦法製取上述雙組份組合物第1組份(活性物質)用下列方法製備反應混合物在葡聚糖(分子量為40-70kDa、優選40kDa)的0.025M的磷酸鈉緩衝溶液中(其pH值為7.5-8.2)溶解原枯草菌素(優選原枯草菌素G3Kh)和聚氧化乙烯(PEO)(其分子量為400-20000Da(優選1500Da)。將所得到的混合物用去除惰性和無用的蛋白的辦法進行純化。具體辦法是用鹽沉澱，接下來進行過濾。用γ-射線或者加速電子束(能量為2，0MeV)，劑量為1.0Mrad對所得到的溶液進行照射。照射之後對溶液進行滅菌消毒性過濾並按10ml為一份，分裝到小瓶(帶長頸的小瓶)中，每個小瓶的容量為15ml。然後用凍幹法乾燥到殘餘水分不大於2％。
結果得到組合物的第1組份，它含有固定在聚氧化乙烯和葡聚糖上、由Bac.Subtilis組成的蛋白酶絡合物。所製取的組合物在一個小瓶內的水解蛋白活性為500-1000.0PU/g。第1組份呈多孔狀、均質的略帶黃色的物質。
第2組份(溶劑)在0.025M的磷酸鈉緩衝溶液中(其pH值為7.5-8.2)製備聚氧化乙烯溶液(優選聚氧化乙烯，其分子量為1500Da)。用γ-射線或者加速電子束(能量為2.0MeV)，劑量為1.0Mrad，對所得到的溶液進行照射。照射之後，對溶液進行消毒滅菌性過濾並按10ml為1份，分裝到小瓶(帶長頸的小瓶)中，每個小瓶的容量為15ml。
結果，得到本發明組合物的第1組份用的無菌的溶劑。該溶劑呈略帶黃色的液體。
為了臨床治療的目的，使用本發明組合物溶液(暫命名為「血栓瓦吉姆」)，將其當場製成，為此，將小瓶內的含有第1組份的內含物(它含有固定的蛋白酶)溶解於10ml組分(2)(溶劑)中。
當在溶劑(第2組份)內當場溶解第1組份以及並接著凍幹時，得到本發明藥物組合物。
實施例3將15g聚氧化乙烯PE0-1500溶解於300ml 10％的葡聚糖的0.025M的磷酸緩衝(pH為7.5)溶液中，葡聚糖的分子量為40kDa，添加6.3g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃，將混合物攪動30分鐘。然後用鹽沉澱法進行沉澱惰性和無用的蛋白。為此，往混合物中按順序添加1.3g雙取代的磷酸鈉(Sodium phosphatedisubstituted)，使之完全溶解並且最終濃度達到0.45％並添加1.9g氯化鈣到最終濃度為0.63％。氯化鈣在反應混合物中溶解後，沉降下來不溶的磷酸鈣沉降物，後者吸附惰性無用的蛋白。在4-8℃的溫度條件下，將混合物保持12小時，使之完全沉澱惰性無用的蛋白。接下來經過濾紙(白帶)過濾反應混合物。濾液體積為300ml。對所得到的溶液進行γ-射線照射，劑量為1.0Mard。照射後，對溶液進行滅菌消毒性過濾。將溶液按10ml為一份，分裝到小瓶中，每個小瓶的容量為15ml，再經凍幹到殘餘水分不大於2％。
結果，得到下列成分的組合物，用重量％表示1、原枯草菌素G3Kh2.12、葡聚糖(分子量40kDa) 10.03、聚氧化乙烯15005.04、0.025M的磷酸鈉緩衝液 82.9組合物的蛋白水解活性 850PU/g。
實施例4將15g聚氧化乙烯(PEO-1500)溶解於300ml 5％葡聚糖的pH為8.2的0.025M磷酸鈉緩衝液溶液中，葡聚糖的分子量為40KDa，添加6.0g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃溫度條件下，將混合物攪拌30分鐘。然後用鹽沉澱法進行沉澱惰性無用的蛋白。為此，往混合物中按順序添加1.3g雙取代的磷酸鈉，使之完全溶解並達到最終濃度為0.45％並添加1.9g氯化鈣到最終濃度為0.63％。氯化鈣在反應混合物中溶解後，沉降下來不溶的磷酸鈣沉澱物，後者吸附惰性無用的蛋白。在4-8℃的溫度條件下，將混合物保持12小時，使之完全沉澱無用惰性的蛋白。接下來，通過濾紙(白帶)過濾反應混合物，濾液的體積為300ml，將所得到的溶液進行γ-射線照射，劑量為1.0Mrad。照射後，對溶液進行滅菌消毒過濾，將溶液按10ml為1份，分裝到小瓶中，每個小瓶的容量為15ml再經凍幹到殘餘水分不大於2％。
結果，得到下列成分的組合物，重量％1、原枯草菌素G3Kh 2.02、葡聚糖(分子量40kDa)5.03、聚氧化乙烯1500 5.04、0.025M的磷酸鈉緩衝液 88.0組合物的蛋白水解活性 800PU/g。
實施例5將0.5g聚氧化乙烯(PEO-1500)溶解於300ml 10％葡聚糖在pH8.2的0.025M磷酸鈉緩衝液的溶液中，葡聚糖的分子量為40kDa，添加5.7g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃的溫度條件下，將混合物攪拌30分鐘。然後用鹽沉澱法進行沉澱惰性和無用的蛋白。為此，往混合物中按順序添加1.3g雙取代的磷酸鈉，使之完全溶解並且最終濃度達到0.45％並添加1.9g氯化鈣到最終度為0.63％。氯化鈣在反應混合物中溶解後，沉降下來不溶的磷酸鈣沉降物，後者吸附惰性無用的蛋白。在4-8℃的溫度條件下，將混合物保持12小時，使之完全沉澱惰性無用的蛋白。接下來通過濾紙(白帶)過濾反應混合物。濾液體積為300ml。對所得到的溶液進行γ-射線照射，劑量為1.0Mrad。照射後對溶液進行滅菌消毒性過濾，將溶液按10ml為1份，分裝到小瓶中，每個小瓶的容量為15ml，再經凍幹到殘餘水分不大於2％。
結果，得到下列成分的組合物，重量％1、原枯草菌素G3Kh 1.92、葡聚糖(分子量40kDa) 10.03、聚氧化乙烯PEO-1500 0.54、0.025M的磷酸鈉緩衝液 87.6組合物的蛋白水解活性750PU/g。
實施例6將15g聚氧化乙烯PEO-1500溶解於300ml 5％的葡聚糖在pH為8.2的0.025M磷酸鈉緩衝液溶液中，葡聚糖分子質量為40kDa，添加7.5g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃的溫度條件下，將混合物攪拌30分鐘。然後用鹽沉澱法進行沉澱惰性和無用的蛋白。為此，往混合物中按順序添加1.3g雙取代的磷酸鈉，使之完全溶解並且最終濃度達到0.45％並添加1.9g氯化鈣到最終濃度0.63％。氯化鈣在反應混合物中溶解後，沉降下來不溶的磷酸鈣沉降物，後者吸附惰性無用的蛋白。在4-8℃的溫度條件下，將混合物保持12小時，使之完全沉澱惰性無用的蛋白。接下來通過濾紙(白帶)過濾反應混合物。濾液體積為300ml。對所得到的溶液進行γ-射線照射，劑量為1.2Mrad。照射後，對溶液進行滅菌消毒過濾。將溶液按10ml為一份，分裝到小瓶中，每個小瓶的容量為15ml，再經凍幹到殘餘水份不大於2％。
結果，得到下列成分的組合物，重量％1、原枯草菌素 2.52、葡聚糖(分子量40kDa) 5.03、聚氧化乙烯PEO-1500 5.04、0.025M磷酸鈉緩衝液 87.5組合物蛋白水解活性 500PU/g。
實施例7將15g聚氧化乙烯PEO-4000溶解於300ml 5％的葡聚糖在pH為8.2的0.025M磷酸鈉緩衝液溶液中，葡聚糖分子質量為70kDa，添加7.5g原枯草菌素G10Kh，在18-20℃的溫度條件下，將混合物攪拌30分鐘。然後用鹽沉澱法進行沉澱惰性和無用的蛋白。為此，往混合物中按順序添加1.3g雙取代的磷酸鈉，使之完全溶解並且最終濃度達到0.45％和添加1.9g氯化鈣到最終濃度為0.63％。氯化鈣在反應混合物中溶解後，沉降下來不溶的磷酸鈣沉降物，後者吸附惰性無用的蛋白。在4-8℃的溫度下，將混合物保持12小時，使之完全沉澱惰性無用的蛋白。接下來，通過濾紙(白帶)過濾反應混合物。濾液體積為300ml。對所得到的溶液進行γ-射線照射，劑量為0.8Mrad。照射後，對溶液進行滅菌消毒過濾。將溶液按10ml為一份，分裝到小瓶中，每個小瓶的容量為15ml，再經凍幹到殘餘水份不大於2％。
結果，得到下列成分的組合物，重量％1、原枯草菌素G10Kh2.52、葡聚糖(分子量70kDa)5.03、聚氧化乙烯PE0-4000 5.0
4、0.025M磷酸鈉緩衝液 87.5組合物蛋白水解活性 1000PU/g。
實施例8製備由活性組份和溶劑組成的本發明組合物(雙組份成分)第1組份將0.5g聚氧化乙烯PEO-1500溶解於300ml 10％的葡聚糖在pH為8.2的0.025M磷酸鈉緩衝液溶液中，葡聚糖分子質量為40kDa，添加5.7g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃的溫度下，將混合物攪拌30分鐘。然後用鹽沉澱法進行沉澱惰性和無用的蛋白。為此，往混合物中按順序添加1.3g雙取代的磷酸鈉，使之完全溶解並且最終濃度達到0.45％和添加1.9g氯化鈣到最終濃度0.63％。氯化鈣在反應混合物中溶解後，沉降下來不溶的磷酸鈣沉降物，後者吸附惰性無用的蛋白。在4-8℃的溫度下，將混合物保持12小時，使之完全沉澱惰性無用的蛋白。接下來，通過濾紙(白帶)過濾反應混合物。濾液體積為300ml。對所得到的溶液進行γ-射線照射，劑量為1.0Mrad。照射後，對溶液進行滅菌消毒過濾。將溶液按10ml為一份，分裝到小瓶中，每個小瓶的容量為15ml，再凍幹到殘餘水份不大於2％。
結果得到下列成分的組合物第1組份，重量％1、原枯草菌素G3Kh 1.92、葡聚糖(分子量40kDa) 10.03、聚氧化乙烯PEO-1500 0.54、0.025M磷酸鈉緩衝液 87.6組合物第1組份的蛋白水解活性為 750PU/g。
第2組份(溶劑)將15.0g聚氧化乙烯PEO-1500溶解於300ml 0.025M的磷酸鈉緩衝液。然後將溶液經濾紙(「白帶」)進行過濾。過濾液體積為300ml。對所得到的溶液進行γ-射線照射，劑量為1.0Mrad。照射後，對溶液進行滅菌消毒過濾，將溶液按10ml為1份，分裝到小瓶中，每個小瓶的容量為15ml。結果，得到下列成分的組合物的第2組份，以重量％表示1、聚氧化乙烯PEO-1500 5.02、0.025M的磷酸鈉緩衝液95.0
當在溶劑(第2組份)中溶解第1組份和凍幹後，得到本發明的藥物組合物。
實施例9對本發明組合物(「血栓瓦吉姆」)的藥理學物性研究對本發明組合物(暫命名為「血栓瓦吉姆」)的藥理學特性的研究，是在實驗室的體外和體內條件下進行的。
在體外血栓溶解模型上(圖1)研究組合物的血栓溶解特性。從所提供的圖上得知，「血栓瓦吉姆」具有極明顯的血栓溶解作用，而且確實勝過了標準治療濃度--50PhU/ml的纖維蛋白溶酶(p＜0.02)、胰蛋白酶(P＜0.01)和生理溶液中的血栓的自發的溶解(P＜0.01)。應當指出，隨著血栓「年令」的增加到7天，「血栓瓦吉姆」的血栓溶液解特性仍能夠保持住(圖2)，此時，纖維蛋白溶酶對7天的血栓實際已不發生作用。頭兩個小時期間，纖維蛋白溶酶對血栓的作用與生理溶液中的自發的背景的溶解準確地一致。臨近第4小時終結時，「血栓瓦吉姆」完全溶解了血栓，而在這個時間，纖維蛋白溶酶只溶解「陳舊」血栓質量的20％。
眾所周知，纖維蛋白溶酶是最活性的溶纖劑(2)，這樣的製劑有，諸如，鏈激酶、尿激酶、組織纖維蛋白溶酶原激活劑和組織纖維蛋白溶酶原，這些是非直接的纖維蛋白溶體並且它們的血栓溶解作用是通過活化纖維蛋白溶解系統和產生內生的纖維蛋白溶酶的間接方式發生影響的，後者導致已經形成的血栓發生溶解(1)。
在對大鼠應用氯化鐵引起的頸動脈血栓模型上，研究了「血栓瓦吉姆」體內的血栓溶解的活性。
表2提供Wistar線鼠經過應用氯化鐵後(0-15分鐘)，預防性給予「血栓瓦吉姆」(每隻動物80PU)對同側頸動脈血流(ml/分)影響的結果。
表2

從所提供的結果看出，在氯化亞鐵起作用後的頭1，5小時，預防性地引入「血栓瓦吉姆」可以有效地限制頸動脈中的血栓形成過程。
表3提供了給Wistar線鼠應用氯化鐵(0-15分鐘)後，治療性地給予「血栓瓦吉姆」(每隻動物80PU)對同側頸動脈血流(ml/分)的影響結果。
表3

從所提供的結果看出，往大鼠頸動脈作用氯化亞鐵後的頭1，5小時，治療性給予「血栓瓦吉姆」」，可以有效地抑制頸動脈處的血栓形成的進程。此外，組織學的(形態測量學的)研究表明，當治療性給予「血栓瓦吉姆」24小時後，頸動脈完全閉塞和存在血栓的動物比例降低3倍。這證明本藥劑具有明顯的血栓溶解活性。
在誘導基本發炎介體之一的模型即發生內黴素休克(圖3)的CBA線鼠的腫瘤壞死因子(αTNF)上，研究了本發明組合物的抗炎物性。採用生物方法和利用線細胞L929，測定了腫瘤壞死因子(αTNF)的活性並用作用單位(UA)表示。在圖3上提供了完整動物(1)的腫瘤壞死因子(αTNF)的活性和給予內黴素(2)後的活性在給予內黴素(3)之前的1小時，給予「血栓瓦吉姆」可以降低腫瘤壞死因子(αTNF)活性50倍。這證明了「血栓瓦吉姆」的抗炎特性。
在大鼠的抗炎痛胃病模型上(表1)和腎上腺素心肌炎模型上(圖4)研究了「血栓瓦吉姆」的細胞保護特性。
表1

從上述表中看出，對照的和試驗的各組的大鼠，按它們的胃的總面積(SH)具有可比性，即指標沒有可信的差異。各組內的出血(溢血)面積(SB)具有可信差異預先引入「血栓瓦吉姆」(試驗組)的SB組比對照組減少3倍(P＜0.01)。在比較相對損傷面積(S％)時，也觀察到上述同樣的可靠的比例關係。綜上所述，在胃黏膜受到抗炎痛損傷時，「血栓瓦吉姆」具有明顯的細胞保護作用。
圖4提供患有腎上腺素心肌炎的大鼠壞死和心肌內營養不良的變化容積量的組織學和形態測量學的研究數據。採用測量面積法測定了受損體積，並用體積密度％來表示，它等於受損體積比上組織的總體積的比例再乘上100％。在對照組(K)給予腎上腺素後，往腹部引入NaCL等滲溶液1.0ml，2次/天，在試驗組內(TRB)給予「血栓瓦吉姆」1.0ml，2次/天。從所提供的結果得出，腎上腺素心肌炎發作發展後，與對照組(K壞死)相比，用「血栓瓦吉姆」治療在第3天終結時，可靠地降低心肌壞死的數量1.5倍(TBR壞死)。臨近第7天終結時，試驗組(TBR營養不良)心肌營養不良變化比對照組(K營養不良)可信地減少2，5倍。
表1和圖4所提供的結果證明，「血栓瓦吉姆」具有明顯的心臟保護和細胞保護作用。在由非類固醇的抗炎藥劑引起的，具體是抗炎痛引起的特定的胃病時，準確地顯示出「血栓瓦吉姆」的保護效果，並且對於急性腎上腺素心肌炎，其中對發病機制起關鍵作用的是急性局部缺血、壞死並發展為心肌萎縮症(營養障礙)，也具有治療效果。
此外，還在肝局部缺血/再灌注模型上研究了解毒、抗局部缺血和細胞保護效果。為此，在Wistar線鼠試驗組和對照組(每組各10支大鼠)的動物解剖後20分鐘壓迫了肝三岔脈，即完全閉鎖了區域淋巴和血液循環。然後恢復血流並研究動物肝臟的組織學結構(基本的數量依據標準是指在區域性的淋巴結內白細胞的蓄積，作為由於局部缺血/再灌注的產物過氧化物和自由基造成對肝臟組織的細胞毒素損傷的反應特徵)。研究結果在圖5上表示。
正如上面提供的結果，「血栓瓦吉姆」在肝臟局部缺血/再灌注模型上顯示出具有肝臟保護作用，進一步肯定了本組合物具有的細胞保護、解毒和抗炎的特性。
雖然本發明的描述作為優選使用，具有推薦的性質，但是應當理解的是可以做各種修改而不會偏離本發明的實質精神。綜上所述，本發明僅受限於下列權利要求書。
權利要求
1.具有溶栓、抗炎、解毒和細胞保護特性用於治療伴有局部缺血、血栓形成、中毒、發炎疾病的組合物，所述組合物包括固定在水溶性聚合物混合物上的活性蛋白酶。
2.按照權利要求1的組合物，其特徵在於蛋白酶在水溶性聚合物混合物上的固定是藉助離子化的照射，使其作用於含有活性蛋白酶和水溶性聚合物混合物的水溶液。
3.按照權利要求1的組合物，其特徵在於離子化照射採用加速電子流、γ-射線和紫外線照射。
4.按照權利要求1的組合物，其特徵在於將由微生物、動物或者植物原料製取的蛋白水解酶作為活性蛋白酶。
5.按照權利要求4的組合物，其特徵在於使用由枯草芽孢桿菌生產的蛋白酶作為活性蛋白酶。
6.按照權利要求1的組合物，其特徵在於使用聚氧化乙烯和葡聚糖混合物作為水溶性聚合物載體用於活性蛋白酶的固定。
7.按照權利要求1的組合物，其特徵在於它包含含有凍幹的固定在聚氧化乙烯葡聚糖混合物上的活性蛋白酶的單組份的藥劑形式，並與阿斯匹林、抗炎痛和雙氫芬酸組合。
8.按照權利要求1的組合物，其特徵在於它包含含有凍幹的固定在聚氧化乙烯和葡聚糖的混合物上的活性蛋白酶，和溶劑的雙組份的藥劑形式。
9.按照權利要求8的組合物，其特徵在於使用經離子化照射活化的聚氧化乙烯溶液作為溶劑。
10.按照權利要求1的組合物，其特徵在於，它是下列疾病的有效的治療製劑局部缺血性心臟病和急性心肌梗塞、腦循環的局部缺血障礙、動脈和靜脈血栓形成、肺梗阻症、胃炎和胃潰瘍病、婦科、口腔科和外科疾病。
11.按照權利要求10的組合物，其特徵在於採用非腸道、口服、腔內和局部施藥獲得治療效果。
12.在與非類固醇的止痛劑共用時，可以對胃黏膜產生保護效果的組合物。
13.權利要求1的組合物的製備方法，其包括將蛋白酶附加到凝膠或者將蛋白酶附加到凝膠和水溶性聚合物的混合物上，以便形成非固態混合物並同時用照射對混合物進行滅菌消毒。
14.按照權利要求13的方法，其中的照射為加速電子流或者γ-照射。
15.按照權利要求13的方法，其中的所述以枯草溶菌素作為蛋白酶和所述凝膠為聚乙二醇，所述水溶性聚合物為聚乙二醇。
16.蛋白的水解方法，其在於將有效量的化合物用於水解上述的蛋白，所述化合物是由附加到凝膠或者附加到凝膠與水溶性聚合物的混合物上的蛋白酶組成。
17.按照權利要求16的方法，其中化合物是以局部應用形式應用的例如，氣溶膠、注射、套針、支氣管鏡檢驗或栓劑施用的。
18.按照權利要求16的方法，其中所述蛋白酶是枯草溶菌素、糜蛋白酶、番木瓜蛋白酶或者鏈激酶。
19.按照權利要求18的方法其中所述蛋白酶為枯草溶菌素。
20.按照權利要求16的方法，其中所述凝膠是聚乙二醇凝膠、葡聚糖凝膠或多聚糖凝膠。
21.按照權利要求16的方法，其中所述的凝膠為聚乙二醇凝膠。
22.按照權利要求16的方法，其中所述的水溶性聚合物為聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖或者多聚糖。
23.按照權利要求22的方法，其中所述聚合物為聚乙二醇。
全文摘要
本發明描述了具有血栓溶解、抗炎和細胞保護特性的藥物組合物。該組合物含有活性蛋白酶，該酶附加於凝膠或者凝膠和水溶性聚合物的混合物上，所述的附加是藉助照射，優選是用γ－射線或者用加速電子流實現的。本組合物含有蛋白酶，它在高達70℃，優選在30－40℃是穩定的，例如，作為蛋白酶的有枯草溶菌素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶或者鏈激酶。凝膠優選聚乙二醇凝膠、葡聚糖或者多聚糖凝膠，並且水溶性聚合物是聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖或者多聚糖。也公開了製備上述組合物的方法及其應用。優點本發明組合物具有廣泛的應用領域並且可用於心臟病學、腎病學、外科學、風溼病學、如產科學和胃腸病學。
文檔編號A61K9/00GK1517126SQ02154290
公開日2004年8月4日 申請日期2002年12月25日 優先權日2001年12月26日
發明者A·V·阿塔默諾夫, A V 阿塔默諾夫, E·I·維利思查津, 維利思查津, O·V·格裡施因, 格裡施因, A·V·特羅伊特斯基, 特羅伊特斯基 申請人:阿克塞絲封閉股份公司