間皮瘤診斷劑、間皮瘤診斷試劑盒和間皮瘤診斷方法

2023-07-23 02:13:46

專利名稱：：間皮瘤診斷劑、間皮瘤診斷試劑盒和間皮瘤診斷方法
技術領域：
：本發明涉及可用於間皮瘤早期診斷的間皮瘤診斷劑、間皮瘤診斷試劑盒和間皮瘤診斷方法。
背景技術：
：近年來，具有接觸石棉經歷的人高頻率地發生間皮瘤已經發展成社會問題。間皮瘤有惡性的也有良性的，多數惡性間皮瘤患者具有石棉接觸經歷,從接觸石棉起經過30-35年的長潛伏期而發生惡性間皮瘤。因此，不能否認今後存在間皮瘤患者增加的可能性。此外，間皮瘤是難以早期發現的疾病，現在通過使用MRI、CT等的方法來診斷間皮瘤，但這些方法難以進行早期診斷，存在的問題是很多情況下，診斷出間皮瘤時疾病已經處於進展之中。僅僅考慮到這種情況，也迫切希望本疾病的早期診斷，但是目前為止還沒有發現有效的早期診斷標誌物。目前為止，已經發現的間皮瘤相關的標誌物包括被稱作Erc、MPF和間皮素(Mesothelin)的蛋白。這其中的來龍去脈如下。首先，1994年Yamaguchi等報導從人胰臟癌細胞HPC-Y5上清純化出了稱作MPF(Megakaryocytepotentiatingfactor,巨核細胞強化因子)的蛋白(文獻1)，而且1995年Kojima等報導從人胰臟癌細胞HPC-Y5的cDNA克隆化了MPF(文獻2)。其後，Chang等製作了與在間皮細胞、卵巢癌和間皮瘤的表面表達的40kDa表位反應的單克隆抗體K1，在使用該抗體尋找編碼其抗原蛋白的基因時，分離出了具有編碼69kDa蛋白的1884bp開放閱讀框(openreadingframe)的基因。然後Chang等又闡明該69kDa蛋白為上述40kDa蛋白的前體，該69kDa蛋白因磷脂醯肌醇特異性磷脂酶(PI-PL)的作用而被切斷，從而在細胞表面表達40KDa蛋白。這以後，Chang等將該69kDa蛋白命名為間皮素(文獻3)，接下來又闡明上述的MPF與間皮素是同一蛋白。另一方面，Scholler等免疫卵巢癌細胞製作了單克隆抗體0V569,並對單克隆抗體0V569所識別的蛋白進行了檢索，結果發現該蛋白具有與間皮素的膜結合區域相同的序列，其分子量為42_45kDa,並將其稱作可溶性間皮素(Solublememberofmesothelin)。研究表明該蛋白在中途發生了框移突變，其結果是變成C末端區域的GPI錨定部分不同的序列，因此變為可溶性。而且，使用與0V569識別相同蛋白的另一單克隆抗體4H3構建了夾心EIA(SandwichEIA)測定系統,發現對卵巢癌患者血清的測定結果顯示出比健康正常人高的上述蛋白的值(文獻4)。而且，Robinson等報導使用該測定系統對間皮瘤患者進行了測定，結果顯示出比健康正常人高的上述蛋白的值(文獻5)。作為本發明人的樋野等通過長年對疾病模型動物進行研究，搜尋了腎癌發病模型Eker大鼠的原因基因。其結果，發現了與正常腎組織相比、在Eker大鼠腎癌來源的細胞系中顯示高表達的基因，並將其中的I個命名為Ere。而且，對大鼠Erc的人同源物進行搜尋的結果表明人的MPF與大鼠Erc具有56.I%的同源性(文獻6、7)。根據以上情況可以認為(1)人Ere、MPF和間皮素(以下將它們稱為「Erc/MPF/間皮素」)是全長622胺基酸的糖蛋白，其第290-295位胺基酸具有RPRFRR序列，因而受到費林(Furin)樣蛋白酶的加工，裂解為31kDa和40kDa的片段；(2)40kDa片段的C末端側區域因其C末端包含GPI錨定區域而以與細胞膜結合的形式保留下來，而N末端側的31kDa片段以可溶性蛋白的形式分泌(以下將其稱作「31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素」)；(3)此外，結合在細胞膜上的40kDa片段的C末端側也可因磷脂醯肌醇-特異性磷脂酶C(phosphatidiylinositol-specificphospholipaseC:PI_PLC)處理而從細胞中釋放出來；等等。有報導稱這些通過不同方法鑑定出的Erc/MPF/間皮素不僅在正常間皮細胞和間皮瘤中強表達，而且還存在於間皮瘤患者的血液中。然而，憑藉這些認識還無法明確在間皮瘤中分泌什麼類型的Erc/MPF/間皮素。目前為止，本發明人等提示上述31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在間皮瘤患者的血清中以高濃度存在，並且報導了據此可以診斷間皮瘤(文獻8)。但是，該報導不能對目的蛋白在患者試樣中以怎樣的狀態存在進行可視化。此外，該報導中是使用識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的C末端區域的抗體來進行測定，因而僅能測定完整地保持了全長的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，而不能測定C末端因某種作用分解缺損而產生的片段。此外，在本發明人等的報導之後，還有人報導通過檢測3IkDa分泌型Erc/MPF/間皮素，能夠診斷間皮瘤(文獻9)，但該報導中ELISA系統測定的MPF的測定值並非以絕對值表示。此外，在該報導中，雖然實際測定了間皮瘤患者和健康正常人的血清，但其結果並非以MPF的絕對值表示，而只是簡單地以吸光度表示，這樣就無法對不同試驗的值進行比較。推測其中的原因是無法將標準物質與血液中的MPF進行換算。此外，作為其中的原因，還可以推測是抗體的特異性、親和性在重組體與血液中的天然型之間不同。而且，在該報導中雖然對所得數個抗體之間識別表位的差異進行了研究，但實際上僅考察了各自的表位是否不同，而並未明確各抗體的識別表位的位置。由此可以斷定現有技術並不適用於實用性診斷。非專利文獻IYamaguchiN,HattoriK,Oh-edaM,KojimaT,ImaiN,OchiN.AnovelcytokineexhibitingmegakaryocytepotentiatingactivityfromahumanpancreatictumorcelllineHPC-Y5.,JBiolChem.269:805-808,1994.PMID:8288629非專利文獻2Kojima,T.;0h_eda,M.；Hattori,K.；Taniguchi,Y.；Tamura,M.；0chi,N.；Yamaguchi,N.MolecularcloningandexpressionofmegakaryocytepotentiatingfactorcDNA.,J.Biol.Chem.270:21984-21990,1995.PubMedID:7665620非專利文獻3Chang,K；Pastan,I.Molecularcloningofmesothelin,adifferentiationantigenpresentonmesothelium,mesotheliomas,andovariancancers.,Proc.Nat.Acad.Sci.93:136-140,1996.PubMedID:8552591非專利文獻4Scholler,N;Fu,N;Yang,Y;Ye,Z;Goodman,G.E.；Hellstrom,K.E.；Hellstrom,I.Solublemember(s)ofthemesotheIin/megakaryocytepotentiatingfactorfamilyaredetectableinserafrompatientswithovariancarcinoma.,4Proc.Nat.Acad.Sci.96:11531-11536,1999.PubMedID:10500211非專利文獻5RobinsonBW,CreaneyJ，LakeR，NowakA，MuskAW,deKlerkN，WinzellP，HellstromKE，HellstromI.SolublemesotheIin-relatedprotein—Abloodtestformesothelioma.LungCancer.49Suppll:S109_111，2005.PMID:15950789非專利文獻6Hino0，KobayashiE，NishizawaM，KuboY，KobayashiT，HirayamaY，TakaiS，KikuchiY，TsuchiyaH，OrimotoK，etal.RenalcarcinogenesisintheEkerrat.，JCancerResClinOncol.121:602-605,1995.PMID:7559744非專利文獻7YamashitaY，YokoyamaM，KobayashiE，TakaiS，Hino0MappinganddeterminationofthecDNAsequenceoftheErcgenepreferentiallyexpressedinrenalcellcarcinomaintheTsc2genemutant(Eker)ratmodel.，BiochemBiophysResCommun.275(1)134-140,2000.PMID10944454非專利文獻8ShiomiK，MiyamotoH，SegawaT，HagiwaraY，OtaA，MaedaM，TakahashiKiMasudaK,SakaoY，Hino0.NovelELISAsystemfordetectionofN-ERC/mesothelinintheseraofmesotheliomapatients.CancerSci.97:928-932,2006.PMID:16776777非專利文獻90ndaM，NagataS,HoM，BeraTK，HassanR，AlexanderRH，PastanI.Megakaryocytepotentiationfactorcleavedfrommesothelinprecursorisausefultumormarkerintheserumofpatientswithmesothelioma.ClinCancerRes.12:4225-4231,2006.PMID:1685779
發明內容發明所要解決的問題因此，本發明的目的是提供間皮瘤診斷劑和間皮瘤診斷試劑盒，與目前為止報導的間皮瘤診斷試劑盒等相比，其能夠有效地高靈敏度地識別健康正常人與間皮瘤患者，從有接觸石棉經歷的人中鑑別出間皮瘤患者，識別肺癌等其它疾病的患者與間皮瘤患者，等等。解決問題的方法本發明人等使用間皮瘤患者來源的體液進行了詳細研究，結果發現在體液中，與31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素一起還存在其分解片段。於是知曉了下述情況採用現有的測定系統無法檢測出31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的片段，所述測定系統使用以下述多肽作為抗原而得到的抗體，所述多肽包含在抗體製作中常規使用的抗原部位即31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的N末端和C末端的胺基酸。於是，本發明人等對能夠測定31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素與其片段這兩者的測定系統進行了深入研究，發現通過選擇識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的適當部位的抗體，能夠與31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素一起高靈敏度地測定其片段，其結果是能夠比傳統上準確度更好地診斷間皮瘤；從而完成了本發明。即，本發明涉及識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的抗體，更具體地說，本發明的抗體識別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在體液中室溫下放置而產生的片段的N端側片段。此外，本發明涉及以識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的抗體為有效成分的間皮瘤診斷劑，更具體地說，本發明涉及以下述抗體為有效成分的間皮瘤診斷劑，所述抗體識別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在體液中室溫下放置而產生的片段的N端側片段。而且，本發明涉及具備識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的抗體的間皮瘤診斷試劑盒，更具體地說，所述間皮瘤診斷試劑盒由含有第I種抗體的第I試劑、和含有第2種抗體的第2試劑組合而成；所述第I種抗體識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽；所述第2種抗體識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽；並且，所述第2種抗體的識別部位與所述第I種抗體的識別部位不同。而且，本發明涉及間皮瘤診斷方法，該方法採用上述間皮瘤診斷試劑盒測定試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量，並以該量作為指標。發明的效果本發明的抗體不僅可以檢出31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，還可以檢出由31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素因種種原因而生成的片段中的N端側片段。因此，通過使用本測定系統，能夠測定生物體內本來存在的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量，與傳統上採用的測定系統比較，能夠準確度更好地診斷間皮瘤和判斷進展狀況。而且，通過使用本測定系統，能夠進行高靈敏度測定，而不依賴於試樣的採集條件、保存條件等。具體地，本發明涉及如下方面I.識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的抗體。2.識別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在體液中室溫下放置而產生的片段的N端側片段的抗體。3.識別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中室溫下放置而產生的片段的N端側片段的抗體。4.識別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中室溫下放置3小時以上而產生的片段的N端側片段的抗體。5.一種抗體，該抗體的識別部位包含SEQIDNO1的胺基酸序列的第34229位。6.一種抗體，該抗體的識別部位包含SEQIDNO1的胺基酸序列的第34139位。7.一種抗體，該抗體的識別部位包含SEQIDNO1的胺基酸序列的第68139位。8.根據項I7中任一項所述的抗體，該抗體還識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素。9.一種間皮瘤診斷劑,其具備項I8中任一項所述的抗體。10.一種間皮瘤診斷試劑盒,其具備項I8中任一項所述的抗體。11.一種間皮瘤診斷試劑盒，其由含有第I種抗體的第I試劑、和含有第2種抗體的第2試劑組合而成；所述第I種抗體識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽；所述第2種抗體識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽，且識別部位與所述第I種抗體的識別部位不同。12.一種間皮瘤診斷方法，其中，採用根據項10或11所述的間皮瘤診斷試劑盒來測定試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量，並以該量作為指標。13.根據項12所述的間皮瘤診斷方法，其中，所述試樣為血清、血漿、胸腔積液或腹水。圖I顯示了單克隆抗體7E7的通過western印跡進行的特異性試驗的結果(這裡，各泳道分別顯示以下述材料作為樣品的結果泳道I為導入了完整人Erc/MPF/間皮素的cDNA的C0S-1細胞的裂解液，泳道2為導入了完整人Erc/MPF/間皮素的cDNA的C0S-1細胞的培養上清，泳道3為僅導入了載體的C0S-1細胞的培養上清，泳道4、5、6分別為HeLa細胞、MKN-28細胞、NRC-12細胞的培養上清)。圖2顯示了單克隆抗體16K16的通過western印跡進行的特異性試驗的結果(這裡，各泳道分別顯示以下述材料作為樣品的結果泳道I為導入了完整人Erc/MPF/間皮素的cDNA的CHO細胞的培養上清，泳道2為未導入基因的CHO細胞的培養上清，泳道3和4分別為上述兩者的細胞裂解液)。圖3顯示了單克隆抗體7E7的通過western印跡進行的識別部位確認試驗的結果(圖中X符號表示假陰性)。圖4顯示了單克隆抗體16K16的通過western印跡進行的識別部位確認試驗的結果(圖中X符號表示假陰性)。圖5顯示了多克隆抗體4的通過western印跡進行的特異性試驗的結果(各泳道的樣品與圖I中相同)。圖6為使用各種抗體進行的間皮瘤患者胸腔積液中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量的測定的結果(圖中，IVIII顯示了用於ELISA試劑盒的抗體組合(I為4和34、II為211和34、III為7E7和34、IV為211和4、V為16K16和4、VI為7E7和4,VII為34和4、VIII為7E7和16K16的組合))。圖7顯示了使用7E7-16K16試劑盒製作的代表性校正曲線。圖8顯示了採用7E7-16K16試劑盒測定的培養細胞的培養上清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。圖9顯示了使用7E7-4試劑盒製作的代表性校正曲線。圖10顯示了採用7E7-4試劑盒測定的培養細胞的培養上清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。圖11顯示了採用7E7-4試劑盒測定的健康正常人血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度。圖12為採用7E7-16K16試劑盒對血清中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度進行測定的結果(圖中，A為對下述試樣進行測定的結果，所述試樣是這樣獲得的採血並室溫放置I小時，再於室溫放置16小時，接著離心分離出血清，然後冷凍；B為對下述試樣進行測定的結果，所述試樣是這樣獲得的採血並室溫放置I小時，接著離心分離出血清，再於室溫放置16小時，然後冷凍)。圖13為使用7E7-4試劑盒對血清中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素濃度進行測定的結果(圖中，A為對下述試樣進行測定的結果，所述試樣是這樣獲得的採血並室溫放置I小時，再於室溫放置16小時，接著離心分離出血清，然後冷凍；B為對下述試樣進行測定的結果，所述試樣是這樣獲得的採血並室溫放置I小時，接著離心分離出血清，再於室溫放置16小時,然後冷凍)。圖14顯示了使用間皮瘤患者胸腔積液、通過單克隆抗體7E7和多克隆抗體34、211、4進行的western印跡的結果(圖中，各泳道分別顯示以下述材料作為樣品的結果泳道I為未處理的間皮瘤患者胸腔積液，泳道2為C末端抗體柱吸附級分，泳道3為N末端、C末端抗體柱非吸附級分，泳道4為7E7抗體柱非吸附級分，泳道5為7E7抗體柱吸附級分；箭頭表示31kDa)。圖15顯示了採用ELISA測定系統(7E7-16K16試劑盒)，對間皮瘤患者、健康正常者、石棉關聯疾病患者/有石棉接觸經歷者(胸膜斑塊(胸膜7)患者、有接觸經歷者、石棉沉著病(石綿症)患者、良性石棉胸膜炎患者)、肺癌患者、其它鑑別疾病患者的血清中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的濃度進行測定的結果。圖中、橫軸的MM表示間皮瘤患者、PP表示胸膜斑塊患者、Ex表示有石棉接觸經歷者、As表示石棉沉積症患者、BAP表示良性石棉胸膜炎患者、LC表示肺癌患者、Others表示其它識別疾病患者、Volunteers表示健康正常人。此外，圖中縱軸表示檢出的Erc/MPF/間皮素的量[ng/mL]。發明的具體實施例方式在本說明書中，對於「3IkDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽(以下稱為「N片段沒有特殊限制，只要是具有SEQIDN0:1所述的胺基酸序列的、31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽即可。在SEQIDNO:I中，第I位的甲硫氨酸第33位的脯氨酸為信號序列，作為N片段，優選除去了信號序列胺基酸的肽。對於N片段中缺失的C末端的胺基酸的數目，沒有特殊限制，只要是I個以上即可，可以列舉出例如5個以上、10個以上、15個以上、20個以上、25個以上、30個以上、35個以上、40個以上等。作為N片段中缺失的C末端的胺基酸的數目，對其上限沒有特殊限制，可以列舉出例如155個、150個、100個、90個、80個、70個、65個、60個等。此外，作為N片段，可以列舉出例如將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在體液中室溫下放置而產生的片段的N端側片段。作為所使用的體液，對其沒有特殊限制，可以列舉出例如血液、血清、血漿、胸腔積液、尿或腹水，優選血液或血清。此外，對於放置的時間沒有特殊限制，優選為I小時以上，更優選為2小時以上，最優選為3小時以上。作為本說明書中的N片段，其為例如將具有SEQIDNO:1所述的胺基酸序列(該序列相當於登錄號.AAV87530所述的人Erc/MPF/間皮素胺基酸序列的第I295位)的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中於室溫放置3小時以上而生成的片段中的、N端側片段，其包括長度不同的多個片段。此外，本說明書中的N片段優選下述抗體不能識別的片段，所述抗體是以通常的抗體製作中使用的包含C末端胺基酸的多肽為抗原、按常規方法製作的抗體。作為本說明書中的N片段，更優選下述片段，所述片段是31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素分解產生的片段，並且其具有3IkDa分泌型Erc/MPF/間皮素胺基酸序列(SEQIDNO1)中的第34229位(優選第34139位、特別優選第68139位)的胺基酸序列。在本說明書中，「間皮瘤」是指間皮細胞來源的惡性腫瘤，更具體地說，可以列舉出例如上皮型間皮瘤、肉瘤型間皮瘤、二相性間皮瘤等。對於本發明的抗體沒有特殊限制，只要是識別N片段的抗體即可。作為N片段，可能存在多個片段，本發明的抗體只要能夠作為間皮瘤的診斷劑應用即可，並非必須要識別所有的片段，識別這些片段中的一部分也是可以的。作為本發明的抗體，優選識別2種以上N片段的抗體。作為本發明的抗體，可以列舉出例如識別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中室溫下放置3小時以上而產生的片段的N端側片段的抗體。作為本發明的抗體，更優選識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素、及N片段這兩者的抗體。作為這樣的抗體，可以列舉出例如識別在31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段中保守的胺基酸序列的抗體。作為這樣的識別部位，可以列舉出例如以下(a)⑷的胺基酸序列(SEQIDNO25),這其中優選(a)(C),更優選(b)或(C)。(a)SRTLAGETGQEAAPLDGV(SEQIDNO:1的胺基酸序列的第3451位SEQIDNO2)(b)GFPCAE(SEQIDNO1的胺基酸序列的第6873位SEQIDNO3)(c)PQACTH(SEQIDNO1的胺基酸序列的第134139位SEQIDNO4)(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG(SEQIDNO1的胺基酸序列的第211229位SEQIDNO5)對於本發明抗體的來源沒有特殊限制，也可以不是人來源的抗體。此外，本發明的抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，但優選單克隆抗體，因其識別部位明確。本發明的抗體可以這樣製備以完整的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或其一部分作為抗原，按照本領域技術人員公知的方法例如《生物化學實驗講座續編(続生化學実験講座)、免疫生物化學研究方法(免疫生化學研究法)》(日本生化學會編)等所述的方法獲得抗體，利用與N片段中保守的胺基酸序列的一部分一致的多肽等對這些抗體進行篩選，從而進行選擇。在本發明抗體的製造中，作為抗原使用的完整31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或其一部分可以列舉出用合成儀合成的與SEQIDNO:1的胺基酸序列的第I295位、優選第35295位的全部或者一部分一致的多肽；或者，將編碼上述胺基酸序列的cDNA(SEQIDNO6)的全長或者一部分按常規方法導入載體、使用該載體轉化大腸桿菌等宿主微生物或培養細胞、培養轉化的大腸桿菌等宿主微生物或培養細胞來進行生產，從而得到重組體蛋白或多肽，再用親和柱、鎳柱等進行純化而得到的多肽等。此外，與編碼上述胺基酸序列的cDNA的全長或者一部分一致的多核苷酸可以這樣獲得以大鼠Erc/MPF/間皮素cDNA等哺乳動物來源的Erc/MPF/間皮素cDNA作為探針，從人腫瘤細胞系等cDNA文庫進行克隆。具體而言，製備本發明抗體的規程如下。即，為了以多克隆抗體的形式製備本發明的抗體，首先，採用PCR法製作編碼人31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的cDNA序列(SEQIDN06)的多核苷酸。然後，將其插入pGEX等載體，將該載體導入大腸桿菌等宿主微生物，用LB培養基等進行培養來生產多肽的重組體蛋白。然後，以所得重組體蛋白為抗原，將其溶解在磷酸鈉緩衝液(PBS)中，再使它們與弗氏完全佐劑或不完全佐劑或者明礬等輔劑(補助剤)結合，然後以此為免疫原對哺乳動物等進行免疫。作為免疫的動物，可以使用本領域常用的動物，例如小鼠、大鼠、兔、羊、馬或雞等。此外，作為免疫時免疫原的施用方法，可以是皮下注射、腹腔內注射、靜脈內注射、皮下注射或肌肉內注射，優選皮下注射或腹腔內注射。免疫可以進行I次，或者可以以合適的間隔、優選以I周5周的間隔，進行多次。最後，按照常規方法，從免疫後的動物採集血液，從該血液分離出血清，從血清中採用下述方法獲得作為多克隆抗體的本發明的抗體使用固定有用作抗原的重組體蛋白的柱子來進行親和柱層析，這樣來進行抗原特異純化，從而獲得作為多克隆抗體的本發明的抗體。此外，為了以單克隆抗體的形式製備本發明的抗體，按照單克隆抗體製備的常規方法例如《抗肽抗體實驗規程(抗7fF'抗體実験/口卜-一>)》(大海忍、過村邦夫、稻垣昌樹著，秀潤社，1994年)、《單克隆抗體實驗指南(単々口一>抗體實験7二二TA)》(富山朔二·安東民衛/編著、講談社、1987年)等所述的方法，用上述重組體蛋白免疫動物獲得免疫細胞，將該免疫細胞與骨髓瘤細胞融合從而得到雜交瘤，從該雜交瘤的培養物中採集抗體。對於這樣採集的抗體，通過使用96孔微型滴定板的EIA方法進行篩選，可以獲得作為單克隆抗體的本發明的抗體，其中，所述96孔微型滴定板上固定有用作抗原的、重組體蛋白或具有上述胺基酸序列的合成肽等。更具體而言，作為包含在本發明診斷劑中作為有效成分的本發明的抗體所特別優選的識別下述胺基酸序列(b)或(C)的單克隆抗體，可以這樣獲得通過使用微型滴定板的EIA法，對上述從雜交瘤的培養物採集的抗體，進行進一步篩選，其中，所述微型滴定板上固定了以下的胺基酸序列(a)或(b)作為抗原。(b)GFPCAE(SEQIDNO1的胺基酸序列的第6873位SEQIDNO3)(c)PQACTH(SEQIDNO1的胺基酸序列的第134139位SEQIDNO4)如此獲得的本發明的抗體，可以根據需要進行標記或固定化，來製備成適於本發明的本發明診斷劑的形式。這其中，標記可以通過結合辣根過氧化物酶(以下稱為「HRP」)、鹼性磷酸酶等酶，異硫氰酸螢光素、羅丹明等螢光物質，32P、125I等放射性物質，化學發光物質等標記物質來進行。此外，固定化可以通過將本發明的抗體結合在合適的固相上來進行。作為固相，可以使用免疫化學測定法中常用的任何固相，可以列舉出例如聚苯乙烯制的96孔微型滴定板、氨基結合型微型滴定板等板，各種珠子。為了將本發明的抗體固定化，例如可以將包含抗體的緩衝液加在載體上，並進行溫育。此外，本發明的間皮瘤診斷試劑盒(以下稱為「本發明試劑盒」)可以這樣製作使用視需要進行了標記或固定化的本發明的抗體，此外再組合稀釋用緩衝液、標準物質、底物用緩衝液、終止液、清洗液等，按照常規方法來製備。本發明的間皮瘤診斷試劑盒優選具備識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的2種抗體，更優選具備識別部位各不相同的、識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的2種抗體。具體而言，在使用2種本發明的抗體來製作本發明試劑盒時，可以組合使用含有識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的第I種抗體的第I試劑(例如固定化抗體)，以及含有作為識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的抗體的、與上述第I種抗體識別部位不同的第2種抗體的第2試劑(例如標記抗體)。作為用於本發明試劑盒的第I種抗體和第2種抗體的組合，沒有特殊限制，可以列舉出例如識別部位包含於31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的全長胺基酸序列(SEQIDNOI)的第34229位、優選第34139位、特別優選第68139位的胺基酸序列中的抗體的組合。作為第I種抗體和第2種抗體的具體例子，可以列舉出識別以下(a)(d)中任一項所述的胺基酸序列(SEQIDN0:25)的抗體的組合；這些組合中，優選識別(a)或(b)所述的胺基酸序列的抗體、與識別(c)或(d)所述的胺基酸序列的抗體的組合，更優選識別(a)或(b)所述的胺基酸序列的抗體、與識別(C)所述的胺基酸序列的抗體的組合，特別優選(b)與(C)的組合。(a)SRTLAGETGQEAAPLDGV(SEQIDNO:1的胺基酸序列的第3451位SEQIDNO2)(b)GFPCAE(SEQIDNO1的胺基酸序列的第6873位SEQIDNO3)(c)PQACTH(SEQIDNO1的胺基酸序列的第134139位SEQIDNO4)(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG(SEQIDNO:1的胺基酸序列的第211229位SEQIDNO5)如上述地製作的本發明診斷劑和本發明試劑盒，通過其中包含的本發明的抗體，不僅可以測定間皮瘤患者的各種體液中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素，還可以測定因各種原因而產生的片段。作為使用本發明診斷劑和本發明試劑盒的具體的、31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素與其片段這兩者的存在或量的測定方法，可以列舉出放射性同位素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvalletal.,(1980)MethodsinEnzymol.,70,419-439)、突光抗體法、斑塊法(^—々法)、斑點法(卞7卜法)、凝集法、奧克特洛尼(Ouchterlony)法、免疫色譜法等、通常在免疫化學測定法中使用的各種方法(《雜交瘤法與單克隆抗體》，株式會社R&DPlanning發行，第30頁第53頁，昭和57年3月5日)。這些測定方法可以從各個角度出發進行適當地選擇，但從靈敏度、簡便性等觀點來看，優選ELISA法。更具體地，關於31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素及其片段的測定，以ELISA法中的一種即夾心法為例，將其規程說明如下。首先，作為步驟(A)，將識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽的第一種抗體(以下稱為「第一抗體」)固定在載體上。然後，作為步驟(B)，將未固定抗體的載體表面用與第一抗體無關的例如蛋白等封閉起來。而且，作為步驟(C)，向其上加入包含各種濃度的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段的試樣，生成31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段、與第一抗體的複合體。其後，作為步驟(D)，加入標記的第二種抗體(以下稱為「第二抗體」)，使其與上述複合體結合，其中，所述第二種抗體識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的胺基酸而得到的肽，且其識別的部位與固定化的第一抗體的識別部位不同。最後，作為步驟(E)，通過測定上述複合體的標記量，可以從預先製作好的校正曲線確定試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的總量。具體地，在步驟(A)中，對於用於固定第一抗體的載體，沒有特殊限制，可以使用免疫化學測定法中常用的任何載體。具體地可以列舉出聚苯乙烯制的96孔微型滴定板、或者氨基結合型微型滴定板。此外，為了固定第一抗體，例如可以將包含上述抗體的緩衝液加在載體上，並進行溫育。作為緩衝液，可以使用公知緩衝液，可以列舉出例如IOmM的PBS。緩衝液中的上述抗體的濃度可以從一個寬範圍中選擇，通常為O.01100μg/ml左右，優選為O.I20μg/ml。此外，在使用96孔微型滴定板作為載體時，希望為300μI/孔以下、20150μI/孔左右。而且，對於溫育條件沒有特殊限制，通常4°C左右溫育一夜是合適的。此外，在步驟(A)中的固定了第一抗體的載體上，有些情況下會存在與抗原抗體反應無關地吸附此後添加的試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段的部分，出於防止這種情況的目的，進行步驟⑶的封閉。作為封閉劑，可以使用例如BSA、脫脂乳溶液、Block-Ace(大日本製藥生產(編號.UK-25B))等市售的封閉劑。對於具體的封閉沒有限定，例如可以這樣進行向固定了抗原的部分上添加適量的Block-Ace，約4°C溫育一夜，然後用緩衝液進行清洗。而且，在步驟(C)中，使包含31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段的試樣與固定化的第一抗體接觸，用該固定化的第一抗體捕捉試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段，從而生成複合體。對於用來生成該複合體的條件沒有限定，可以在4°C37°C左右反應約I小時I夜。反應結束後，優選用緩衝液清洗載體，來除去未反應的蛋白等。作為用於該反應的緩衝液，優選具有IOmM的PBS(pH7.2)和O.05%(v/v)的Tween20的組成的緩衝液。此外,進一步在步驟(D)中，向固定化的第一抗體與31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段的複合體加入與固定化的第一抗體識別部位不同的標記的第二抗體，從而生成由固定化第一抗體_31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段-標記的第二抗體構成的複合體。該反應結束後，優選用緩衝液清洗載體，來除去未反應的蛋白等。作為用於該反應的緩衝液，可以使用上述的緩衝液。該步驟(D)中使用的標記的第二抗體的量為稀釋成固定化第一抗體的約5，00010，000倍的量，優選稀釋為最終吸光度為I.52.O的量。稀釋可以使用緩衝液，對於反應條件沒有特殊限制，可以優選在4°C37°C左右進行約I小時，反應後用緩衝液進行清洗。通過以上反應，能夠生成由固定化的第一抗體_31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段-標記的第二抗體構成的複合體。最後在步驟(E)中，向固定化的第一抗體_31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段-標記的第二抗體的複合體加入與標記物質反應的生色底物溶液，測定吸光度。當上述反應中使用過氧化物酶作為標記物質時，例如可以使用包含過氧化氫和3，3',5,5'-四甲基聯苯胺(以下稱為「TMB」)的生色底物溶液。此外，吸光度可以這樣測定向由固定化的第一抗體_31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素或N片段-標記的第二抗體構成的複合體加入生色底物溶液，約25°C反應約30分鐘，然後加入I2N的硫酸來終止酶反應，在450nm的波長下進行測定。另一方面，當使用鹼性磷酸酶作為標記物質時，採取下述方法是合適的以磷酸對硝基苯酯作為底物來生色，加入2N的氫氧化鈉來終止酶反應，測定415nm處的吸光度。而且，將已知濃度的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素用於上述夾心法等，預先作成校正曲線，使用該校正曲線能夠計算出試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量。通過上述測定方法等，能夠計算出試樣中的3IkDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量、即生物體內本來存在的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的量，據此，可以從健康正常者中診斷出間皮瘤患者、區分間皮瘤患者的外科手術是否成功、預見間皮瘤的復發等。對於用於間皮瘤診斷等的試樣沒有特殊限制，只要是存在31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和/或N片段的試樣即可，可以列舉出例如全血、血清、血漿、尿、淋巴液、胸腔積液(胸水)、腹水等體液。在這些試樣中，優選血清、血漿、胸腔積液或腹水。具體地，間皮瘤的診斷可以以試樣中的3IkDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量為指標，當判定該量與健康正常者的平均值相比顯著地高時，診斷為間皮瘤。作為判定試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量與健康正常者的平均值相比顯著地高的指標的例子，可以列舉出例如採用從健康正常人血清組獲得的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量的平均值+2x標準偏差的值、優選從健康正常人血清組獲得的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量的平均值+5x標準偏差的值，作為統計學上的截留值，但不限於此。而且，上述間皮瘤的診斷中，還可以用試樣中3IkDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的濃度來代替試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量作為指標。此外，間皮瘤的外科手術是否成功，或復發的預測，可以基於間皮瘤患者試樣中的31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量因有無間皮瘤細胞的存在而變化來進行。即，在間皮瘤外科手術前後測定試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量，比較手術前後的該量，如果手術後的量顯著低於手術前的量，則可以確認通過該外科手術除去了間皮瘤細胞。此外，如果在間皮瘤外科手術後也對試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量進行監測，則在該量增加時，可以預測存在間皮瘤細胞即出現復發。通過使用本發明診斷劑和本發明試劑盒測定試樣中31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素和N片段的量，不僅可以如上述地從健康正常者中診斷出間皮瘤患者、區分間皮瘤患者的外科手術是否成功、預見間皮瘤的復發等，還可以用來從有石棉接觸經歷者中鑑別間皮瘤患者、識別皮瘤患者與肺癌等其它疾病的患者。即，有石棉接觸經歷者中胸膜胼胝(pleuralcallosity)、良性胸膜炎、肺纖維症、肺癌等的發病率被認為高於健康正常者。但是，這些疾病中，31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的測定值顯著低於間皮瘤患者，可以與間皮瘤患者區分開來。這對治療方法的最優化是非常有用的。即，如果能夠識別間皮瘤患者與例如肺癌患者，那麼就可以採取完全不同的治療策略。這樣可以避免枉然施用無效抗癌劑而給患者造成痛苦，可以成為面向近年受到關注的定製醫療的策略。實施例以下，通過實施例更具體地對本發明進行說明，但本發明不受這些實施例的限制。實施例I單克隆抗體的製作⑴(I)免疫用抗原的製作以完整人Erc/MPF/間皮素cDNA(登錄號.AY743922)為模板，使用以下所示的引物No.5』-3和No.3』-3，對與SEQIDNO:1所表示的3IkDa分泌型Erc/MPF/間13皮素的胺基酸序列的第35位295位區域對應的核苷酸(SEQIDNO6的核苷酸序列的103885位)進行了聚合酶鏈反應(PCR法)擴增。然後，在上述得到的寡核苷酸上附加編碼GST(GlutathioneS-transferase)標籤的序列，並在其C末端側區域附加編碼組氨酸(Histidine)標籤的序列，將該GST-31kDa分泌型間皮素-His區域插入pGEX-6P-l(Amershambiosciences公司製造)，以此作為表達載體，將其導入大腸桿菌，以融合蛋白的形式進行了表達。引物No.5』-3(SEQIDNO7)5，-ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA-3』引物No.3，-3(SEQIDNO8)5，-AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA-3，將該大腸桿菌在5mL添加氨苄西林的LB培養基中37°C振蕩培養一夜。再將其加入到1，OOOmL的LB培養基中，37°C振蕩培養4小時，添加500mM的異丙基-I-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)lmL，再振蕩培養3小時。將這樣獲得的培養液於4°C、6，OOOrpm離心分離15分鐘，將沉澱用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗2次。其後，加入添加有ImM的EDTA、I%的TritonX-100的20mMTris_HCl緩衝液(pH7.4)20ml，對該液進行30秒X4次的超聲波處理來破碎菌體，提取目的蛋白後，於4°C、10，OOOrpm、離心分離30分鐘，獲得了上清。從該上清中使用穀胱甘月太-sepharose珠子Glutathion-sepharosebeadsAmershambiosciences公司製造)純化出GST-3IkDa分泌型Erc/MPF/間皮素-His蛋白後,通過PreScission蛋白酶(PreScissionProteaseAmershambiosciences公司製造)處理切除GST部分,得到了3IkDa分泌型Erc/MPF/間皮素-His。(2)單克隆抗體的製作使用上述⑴獲得的蛋白作為免疫用抗原，每隔I周或2周施用50μI(50μg)來免疫小鼠。抗原僅在初次免疫中與弗氏完全佐劑混和，而在第二次以後與弗氏不完全佐劑混和。將免疫化小鼠的脾單核細胞和融合配偶體(partner)X63-Ag8-653用於聚乙二醇介導的細胞融合，按文獻(J.Immunol.146:3721-3728)所述方法選擇出雜交瘤。該選擇通過選擇與固定化31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素反應的細胞來進行。使上述選擇的細胞在作為無血清培養基的GIT培養基(和光純藥)中產生抗體，直至80%的細胞死亡。然後，對該培養基進行離心(1，OOOrpm、15分鐘)來除去細胞，再添加硫酸銨至50%飽和狀態，於4°C靜置一夜，通過離心回收了沉澱(I，000rpm、30分鐘)。進一步，將該沉澱溶解在2倍稀釋的結合緩衝液(bindingbufferProteinAMAPSIIkit製造)中，然後在蛋白A柱(Pharmacia-Amersham製造)上吸附IgG。其後,進行一夜的PBS透析來純化抗體，得到了多種識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的抗體。並且，將這些抗體中的兩個命名為7E7和16K16。(3)利用western印跡確認單克隆抗體7E7和16K16的特異性使用在C0S-1細胞或者CHO細胞中強制表達的Erc/MPF/間皮素蛋白等樣品，通過western印跡確認了上述(2)中所得單克隆抗體7E7和16K16識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素。在進行western印跡之前，向每種樣品中添加2-巰基乙醇(2Me)來使之處於還原狀態。western印跡按常規方法(例如《分子生物學基本實驗方法(分子生物學基礎実験法)》，南江堂)進行。western印跡的結果示於圖I和圖2。根據圖I和圖2,使用單克隆抗體7E7和16K16中的任何一個，對於強制表達的Erc/MPF/間皮素樣品，在71kDa完整型Erc/MPF/間皮素和31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的表達部位上均有條帶，可以確認這些抗體對Erc/MPF/間皮素具有反應性。實施例2單克隆抗體7E7和16K16的抗原識別部位的探索製作了六個六個胺基酸地缺損(即逐次地缺損六個胺基酸)31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素的C末端區域的一系列融合蛋白，使它們與單克隆抗體7E7和16K16反應，來探索抗原識別部位。首先，以實施例I中製作的GST_31kDa分泌型間皮素-His區域為模板，製作能夠六個六個地缺失胺基酸的反義引物，利用PCR反應進行了擴增。接下來，將其插入pGEX_6P_I(Amershambiosciences公司製造)，以此作為表達載體，再將其導入大腸桿菌。將該大腸桿菌在5mL添加氨苄西林的LB培養基中37°C振蕩培養一夜。再將其加入到I,OOOmL的LB培養基中，37°C振蕩培養4小時，添加500mM的異丙基-I-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)lmL，再振蕩培養3小時。將這樣獲得的培養液於4°C、6，OOOrpm離心分離15分鐘，將沉澱用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗2次。其後，加入添加有ImM的EDTA、I%的Tritonx-100的20mMTris-HCl緩衝液(pH7.4)20ml，對該液進行30秒X4次的超聲波處理來破碎菌體，提取目的蛋白後，於4°C、10，OOOrpm、離心分離30分鐘，獲得了上清。從該上清中使用谷月光甘妝-sepharose珠子Glutathion-sepharosebeadsAmershambiosciences公司製造)純化出31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素逐次缺損六個胺基酸而得到的GST_31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素-His缺損蛋白。接下來，對於這些缺損蛋白，利用單克隆抗體7E7和16K16按常規方法(例如《分子生物學基本實驗方法(分子生物學基礎実験法)》，南江堂)進行western印跡和斑點印跡，確定了其識別部位。western印跡和斑點印跡的結果如圖3和圖4所示。對應於圖3和圖4中的I6和AH的蛋白的胺基酸序列如表I所示。表中的數字表示從31kDa分泌型間皮素的N末端起向其C末端方向的連續的胺基酸的個數。根據該圖可以判明單克隆抗體7E7抗體識別134位139位的區域，而單克隆抗體16K16識別N末端起第68位73位的區域。表I權利要求1.一種抗體，其識別SEQIDNO:3的胺基酸序列。2.權利要求I的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。3.一種間皮瘤診斷劑，其包含權利要求I或2的抗體。4.一種間皮瘤診斷試劑盒,其包含權利要求I或2的抗體。5.一種間皮瘤診斷試劑盒，其包含第I試劑和第2試劑的組合，所述第I試劑含有如權利要求I或2所述的第I種抗體，所述第2試劑含有識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的15155個胺基酸而得到的肽的第2種抗體，其中所述第2種抗體識別部位與所述第I種抗體的識別部位不同。6.一種間皮瘤診斷試劑盒，其包含第I試劑和第2試劑的組合，所述第I試劑含有如權利要求I或2所述的第I種抗體，所述第2試劑含有識別31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素缺失其C末端的155個胺基酸而得到的肽的第2種抗體，其中所述第2種抗體識別部位與所述第I種抗體的識別部位不同。7.一種間皮瘤診斷試劑盒，其包含第I試劑和第2試劑的組合，所述第I試劑含有如權利要求I或2所述的第I種抗體，第2試劑含有識別選自SEQIDNO:2、SEQIDNO4和SEQIDNO5的胺基酸序列的第2種抗體。全文摘要本發明涉及間皮瘤診斷劑、間皮瘤診斷試劑盒和間皮瘤診斷方法，具體的課題是提供間皮瘤診斷劑等，與目前為止報導的間皮瘤診斷試劑盒等相比，其能夠有效地識別健康正常人與間皮瘤患者，從有接觸石棉經歷的人中鑑別出間皮瘤患者，識別肺癌等其它疾病的患者與間皮瘤患者，等等。本發明的間皮瘤診斷劑以下述抗體為有效成分，所述抗體識別將31kDa分泌型Erc/MPF/間皮素在血液中或血清中室溫下放置3小時以上而產生的片段的N端側片段。文檔編號G01N33/574GK102584996SQ20121005011公開日2012年7月18日申請日期2007年12月7日優先權日2006年12月8日發明者樋野興夫,清藤勉申請人:株式會社免疫生物研究所