一種重組腺病毒的製作方法
2023-07-12 07:08:42 1
本發明涉及一種生物醫藥，特別是一種重組腺病毒。
背景技術：
骨肉瘤是骨惡性腫瘤中最多見的一種，是從間質細胞系發展而來，腫瘤迅速生長是由於腫瘤經軟骨階段直接或間接形成腫瘤骨樣組織和骨組織。目前常見的治療方法有手術和放射，但手術治療無法徹底根除腫瘤細胞，放射治療對自身的健康細胞也會造成不可逆轉的損傷；由於成骨肉瘤對化學藥物的敏感性不高，目前沒有有效的化學藥物。p53基因是與人類腫瘤高度相關的抑癌基因之一，其中成骨肉瘤患者即存在著p53基因突變，失去了有功能的p53蛋白。野生型p53基因突變後產生的突變型p53蛋白石一種腫瘤促進因子，該蛋白可導致細胞失去DNA修復和控制分裂的能力，還可以抑制正常p53蛋白的功能，但是直接向腫瘤細胞內轉導野生型p53基因的抑癌效果有限，無法達到抑制p53蛋白降解，基因治療癌症的目的。
技術實現要素：
本發明的發明目的在於：針對上述存在的問題，提供一種構建編碼融合基因嵌合肽的重組腺病毒，並對其進行修飾，通過載體搭載重組腺病毒，對成骨肉瘤腫瘤細胞的增殖具有抑制作用，進一步能夠促使成骨肉瘤腫瘤細胞凋亡的重組腺病毒。
本發明採用的技術方案如下：
本發明的一種重組腺病毒，下述方法構建，
步驟一，設計正向引物為F5』-GGGCCGGCGTGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAGAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAGAAGCTTAAGAAG，並向正引物的5』端加入保護鹼基和Nae I酶位點；設計負向引物為R5』-GGGATCCTCATCCGCGCTGTACCTTTACCCAGAACTGATTCCGGCGCATCTTCCACTTCTTAAG，並向負向引物的3』端加入保護鹼基、終止子和MamH I酶切位點；
步驟二，經PCR反應體系擴增目的基因，連接於pGEM-T-easy質粒，轉化入大腸桿菌E.Coli DH5α，經過克隆篩選、酶切鑑定、測序正確後，製備p53(C22)Ant片段，得到重組質粒pGEM-T/p53(C22)Ant；
步驟三，通過Nae I和Bam H I先後消化重組質粒pGEM-T/p53(C22)Ant，用DNA連接酶連入帶有相同末端的已線性化的pBV220-NT4質粒，連接產物轉化入大腸桿菌E.Coli DH5α，接種在含氨苄青黴素的LB培養液中，在37℃條件下培養過夜後挑選已轉化的菌落，提取質粒、篩選並鑑定陽性克隆，得到pBV220/NT4p53(C22)Ant；
步驟四，通過EcoR I和BamH I雙酶切腺病毒穿梭質粒pSSHG-CMV和pBV220/NT4p53(C22)Ant，凝膠回收354b NT4p(C22)Ant的基因片段和pSSHG-CMV，用DNA連接酶連接，轉入大腸桿菌E.Coli DH5α，挑選轉化的菌落，提取質粒篩選並鑑定陽性克隆。
由於採用了上述技術方案，p53羧基端肽的盤繞結構能夠穿過細胞膜，捆綁在細胞內的靶點上，導致細胞凋亡，為選擇性地誘導腫瘤細胞死亡，對正常或非腫瘤細胞無作用，並對p53變異型的腫瘤細胞作用更強，尤其是當p53羧基端肽和膜滲透肽嵌合後可以有效增強抗腫瘤作用。在表達盒中設計Ant穿膜肽可以不需任何膜蛋白shou體的協助而穿過活細胞質膜，進入細胞質設置細胞核，而細胞膜缺完好無缺，可有效的將多肽、蛋白質分子及DNA片段導入多種哺乳動物細胞，與細胞膜親和性高，穿膜速度快，並能改善體內外病毒介導的基因轉移和蛋白質的分泌表達。同時加入神經營養因子（NT4）信號肽，能夠提高重組腺病毒的轉導效率，引導肽與目的短肽相連接，保證正確切割和保持肽的生物活性，以獲得最大的旁觀殺傷效應。
本發明的一種重組腺病毒，所述重組腺病毒經過葉酸修飾後與載體化學偶聯。
由於採用了上述技術方案，採用宿主細胞中磷脂「自然嵌合」的方法，在細胞培養的同時實現葉酸修飾磷脂對細胞膜的修飾，再用腺病毒對該葉酸修飾宿主細胞的侵染及在其中複製的過程，實現對重組腺病毒包膜的葉酸修飾，葉酸作為體內生化反應中一碳單位的載體，參與嘌呤和胸腺嘧啶的合成，並且通過從頭合成途徑進一步合成DNA和RNA，因此也算是可對細胞膜產生靶向作用的理想體，通過與葉酸受體作用使得納米粒被細胞胞吞，從而提高轉染率，有利於產生特異性的細胞靶向作用，也不會因為共價結合小分子後而改變。
本發明的一種重組腺病毒，所述葉酸修飾包括以下幾個步驟，
步驟一，配置含有濃度為0.03mg/mL葉酸功能化二硬脂醯磷脂醯乙醇胺的細胞培養液，將宿主細胞懸浮在細胞培養液中懸浮5d；
步驟二，調整細胞密度為5×106/mL，以MOI=0.5將重組腺病毒加入細胞懸浮液中，充分搖勻，鋪於培養瓶中，在37℃、7.5%CO2濃度培養箱中培養48d；
步驟三，收集懸浮細胞，將未懸浮細胞用細胞刮刀颳起，混勻兩種細胞後，加入含1000U/mL GMCSF、1000U/mL IL-4和100ng/mL TNF-α的X-VIVO 15培養基重新懸浮細胞，再按照MOI=0.3將重組腺病毒加入細胞懸浮液中，充分搖勻，鋪於培養瓶中，在37℃、7.5%CO2濃度培養箱中培養48d；
步驟四，收集上層清液，將上層清液置於50mL離心管中，在6500r/min轉速下離心15min，經0.45μm過濾器過濾後超速離心，得到初步處理的病毒清液；
步驟五，在離心管底部加入6mL25%蔗糖/PBS緩衝溶液作為緩衝墊，緩慢加入初步處理的病毒清液，在22300r/min轉速下離心3h，棄去上層清液，沉澱用PBS（pH=7.2）溶解，再次超速離心進行脫糖。
由於採用了上述技術方案，採用宿主細胞中磷脂「自然嵌合」的方法，可實現重組腺病毒的葉酸修飾，二者共定位效率為（94.2±0.7）%，經過葉酸修飾的重組腺病毒保持了很好的完整性，修飾後的重組腺病毒保持了對宿主細胞的感染能力；經過上述步驟，操作簡便且最大程度保持了病毒的包膜完整性及感染能力，能夠快速高效地獲得葉酸修飾的重組腺病毒。
本發明的一種重組腺病毒，所述重組腺病毒與載體化學偶聯。
由於採用了上述技術方案，與載體化學偶聯後，能夠保護重組腺病毒，具有較高的親水性，保持細胞外穩定性，安全進入目標組織或細胞附近，而不被巨噬細胞識別、載體間無聚集，能夠逃離溶酶體，在目標組織或細胞附近將基因載體，即重組腺病毒釋放。
本發明的一種重組腺病毒，其特徵在於：所述載體為葡聚糖-醯腙凝膠納米膠束，所述葡聚糖-醯腙凝膠納米膠束的分子量為24300，膠束呈球形，膠束直徑為為57.4±3.5nm，所述醯腙凝膠的分子式為，所述n：m=8：17。
由於採用了上述技術方案，上述醯腙凝膠在一定的pH範圍內具有可逆觸變性能，在pH為7.2~7.8的範圍內，能夠形成水凝膠，在容器中可承受自身重力而不流動，但當pH小於7達到6.8及其以下時，醯腙鍵斷裂，變為溶膠，當pH回升到7.2~7.8的範圍時，又可形成凝膠；由於人體內正常的pH環境為7.0~7.8，當載體進入正常環境中，為凝膠狀態，能夠對重組腺病毒起到良好的保護作用；而腫瘤細胞周圍的pH略偏酸性，約為6.85~6.95，因此當凝膠接近腫瘤細胞後，發成觸變形成溶膠，將重組腺病毒釋放，重組腺病毒靶向作用於腫瘤細胞，避免基因載體在作用於目標宿主前被巨噬細胞吞噬等，同時能夠減小病毒對人體的毒性。葡聚糖可以在肝、脾、腎和消化道被葡聚糖酶降解，毒性極小，用葡聚糖修飾的高分子膠束能夠減小肝臟對載體的清除，具有好的生物相容性。
本發明的一種重組腺病毒，所述醯腙凝膠的質量分數為葡聚糖的27%，所述重組腺病毒的質量分數為納米膠束的0.49%，所述重組腺病毒包裹於載體內部。
本發明的一種重組腺病毒，所述重組腺病毒用於抑制成骨肉瘤細胞增殖。
本發明的一種重組腺病毒，所述重組腺病毒用於促使成骨肉瘤細胞凋亡。
由於採用了上述技術方案，對成骨肉瘤細胞凋亡測定，正常細胞比例明顯下降，從（85.71±0.19）%下降至（70.17±0.58）%（t=44.15，P<0.05），總凋亡細胞比例從（11.01±0.22）%上升至（27.28±0.50）%（t=51.82，P<0.05）；對成骨肉瘤增殖抑制測定，從第3天開始，細胞增殖速度明顯下降，第7天達到峰值，細胞增殖率自（395.14±2.24）%下降至（256.50±3.23）%（t=39.50，P<0.01），細胞生長抑制率達到（35.09±1.05）%，具有明顯的抑制成骨肉瘤細胞增殖和成骨肉瘤細胞凋亡的作用。
綜上所述，由於採用了上述技術方案，本發明的有益效果是：
1、構建編碼融合基因嵌合肽的重組腺病毒，並對其進行修飾，通過載體搭載重組腺病毒，對成骨肉瘤腫瘤細胞的增殖具有抑制作用，進一步能夠促使成骨肉瘤腫瘤細胞凋亡。
2、實現對重組腺病毒包膜的葉酸修飾，可對細胞膜產生靶向作用的理想體，通過與葉酸受體作用使得納米粒被細胞胞吞，從而提高轉染率，有利於產生特異性的細胞靶向作用，也不會因為共價結合小分子後而改變。
3、與載體化學偶聯，保護重組腺病毒，具有較高的親水性，保持細胞外穩定性，安全進入目標組織或細胞附近，而不被巨噬細胞識別、載體間無聚集，能夠逃離溶酶體，在目標組織或細胞附近將基因載體釋放，提高作用效率。
附圖說明
圖1是p53(C22)Ant PCR產物的酶切鑑定；
圖2是重組質粒pGEM-T/p53(C22)Ant的酶切鑑定；
圖3是pSSHG-CMV- NT4p53(C22)Ant重組質粒的酶切鑑定；
圖4是重組腺病毒經葉酸修飾CLMS顯微鏡照片；
圖5是醯腙凝膠1H-NMR圖譜；
圖6是對細胞生長抑制情況對比曲線；
圖7是對細胞凋亡情況對比柱形圖。
具體實施方式
下面結合附圖，對本發明作詳細的說明。
為了使發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
實施例1
1、一種重組腺病毒構建
步驟一，設計正向引物為F5』-GGGCCGGCGTGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAGAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAGAAGCTTAAGAAG，並向正引物的5』端加入保護鹼基和Nae I酶位點；設計負向引物為R5』-GGGATCCTCATCCGCGCTGTACCTTTACCCAGAACTGATTCCGGCGCATCTTCCACTTCTTAAG，並向負向引物的3』端加入保護鹼基、終止子和MamH I酶切位點；
步驟二，經PCR反應體系擴增目的基因，連接於pGEM-T-easy質粒，轉化入大腸桿菌E.Coli DH5α，經過克隆篩選、酶切鑑定、測序正確後，製備p53(C22)Ant片段，得到重組質粒pGEM-T/p53(C22)Ant；
步驟三，通過Nae I和Bam H I先後消化重組質粒pGEM-T/p53(C22)Ant，用DNA連接酶連入帶有相同末端的已線性化的pBV220-NT4質粒，連接產物轉化入大腸桿菌E.Coli DH5α，接種在含氨苄青黴素的LB培養液中，在37℃條件下培養過夜後挑選已轉化的菌落，提取質粒、篩選並鑑定陽性克隆，得到pBV220/NT4p53(C22)Ant；
步驟四，通過EcoR I和BamH I雙酶切腺病毒穿梭質粒pSSHG-CMV和pBV220/NT4p53(C22)Ant，凝膠回收354b NT4p(C22)Ant的基因片段和pSSHG-CMV，用DNA連接酶連接，轉入大腸桿菌E.Coli DH5α，挑選轉化的菌落，提取質粒篩選並鑑定陽性克隆。
利用PCR 反應體系擴增目的基因p53(C22)Ant，在瓊脂糖凝膠電泳上獲得全長117 bp 的基因片段，該值與理論值相符(加上1個終止密碼子3 bp、2 個限制性內切酶識別序列12 bp和2個引物內互補序列12 bp)，如圖1所示。重組質粒pGEM-T/p53(C22)Ant經Nae I和BamHⅠ先後消化後，瓊脂糖凝膠電泳結果可見117bp的目的基因片段，並與理論值相符，顯示陽性重組質粒被完全切開，如圖2所示。應用DNASIS軟體，從DNA測序結果找出p53(C22)Ant嵌合肽cDNA 片段序列，與根據GenBank所提供的序列而設計的嵌合基因序列比較，所克隆的p53(C22)Ant 嵌合肽cDNA片段從Nae I切點起到終止密碼子TAG，序列完全一致，如圖3所示。
2、重組腺病毒葉酸修飾
步驟一，配置含有濃度為0.03mg/mL葉酸功能化二硬脂醯磷脂醯乙醇胺的細胞培養液，將宿主細胞懸浮在細胞培養液中懸浮5d；
步驟二，調整細胞密度為5×106/mL，以MOI=0.5將重組腺病毒加入細胞懸浮液中，充分搖勻，鋪於培養瓶中，在37℃、7.5%CO2濃度培養箱中培養48d；
步驟三，收集懸浮細胞，將未懸浮細胞用細胞刮刀颳起，混勻兩種細胞後，加入含1000U/mL GMCSF、1000U/mL IL-4和100ng/mL TNF-α的X-VIVO 15培養基重新懸浮細胞，再按照MOI=0.3將重組腺病毒加入細胞懸浮液中，充分搖勻，鋪於培養瓶中，在37℃、7.5%CO2濃度培養箱中培養48d；
步驟四，收集上層清液，將上層清液置於50mL離心管中，在6500r/min轉速下離心15min，經0.45μm過濾器過濾後超速離心，得到初步處理的病毒清液；
步驟五，在離心管底部加入6mL25%蔗糖/PBS緩衝溶液作為緩衝墊，緩慢加入初步處理的病毒清液，在22300r/min轉速下離心3h，棄去上層清液，沉澱用PBS（pH=7.2）溶解，再次超速離心進行脫糖。
如圖4所示，CLMS顯微鏡照片可見，宿主細胞中磷脂自然嵌合修飾的病毒保持了很好的完整性。
3、葡聚糖-醯腙凝膠納米膠束載體合成
在三口瓶中加入丙烯醯胺1.207g（0.017mol），雙丙酮丙烯醯胺1.352g（0.008mol），15mL DMSO，攪拌並通入氮氣30min，在氮氣的保護下，加入偶氮二異丁氰2.7mg（0.016mmol）後，70℃溫度下反應24h，反應完畢後，將反應物逐滴加入到不斷攪拌的大量丙酮中，沉澱過濾，再用乙醚多次洗滌，室溫下真空乾燥24h，得到醯腙凝膠，1H-NMR圖譜如圖5所示，合成反應式如下所示：
將葡聚糖與丁兒酸酐反應，製備羧基化葡聚糖，將80mg羧基化葡聚糖和21.6mg醯腙凝膠溶解在10mL DMF中，在計入8mg N，N』-二環乙基碳二亞胺和5mg DMAP，室溫下攪拌反應24h，過濾後用乙醇沉澱，得到葡萄糖-醯腙凝膠鍵合物，將20mg鍵合物溶液5mL DMF中，然後加入10mL二次蒸餾水，攪拌2h後透析24h，取出有機溶劑，得到葡聚糖-醯腙凝膠納米膠束，葡聚糖-醯腙凝膠納米膠束的分子量為24300，膠束呈球形，膠束直徑為為57.4±3.5nm。
4、經葉酸修飾的重組腺病毒與載體化學偶聯
在50mg葡聚糖-醯腙凝膠納米膠束溶液（10mL）中加入23mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，和26mg N-羥基硫代琥珀醯亞胺，室溫下攪拌4h後，加入重組腺病毒，繼續攪拌24h，透析出去未反應的腺病毒，得到與載體化學偶聯的重組腺病毒，標記為1號；同樣的方法製備與載體化學偶聯的經過葉酸修飾的重組腺病毒，標記為2號，重組腺病毒（經過葉酸修飾的重組腺病毒）的質量分數為納米膠束的0.49%，重組腺病毒（經過葉酸修飾的重組腺病毒）包裹於載體內部。
5、細胞培養
人成骨肉瘤細胞MG63購於中科院上海細胞庫（目錄好TCHu124），培養條件：37℃、體積分數為5%二氧化碳條件下，含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。
6、測定對MG63細胞的抑制增殖作用和凋亡作用
MG63傳代培養，去對數生長期的細胞，用2.5g/L胰酶溶液銷戶離心後，製備成單細胞懸液，以1×104/孔細胞數接種於24孔板中，共分為3組：空白對照組，1號感染組（與載體化學偶聯的重組腺病毒，1×1010 pfu/mL）和2號感染組（與載體化學偶聯的經過葉酸修飾的重組腺病毒，1×1010 pfu/mL），每組平行設置8個復孔，24h細胞鐵壁後分別進行相應的處理，分別繼續培養、2、3、4、5、6、7天後收集細胞，MTS法檢測細胞增殖：流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
其中，圖7中每一組柱形圖從左至右依次為陰性對照組，1號感染組和2號感染組。
細胞凋亡的影響與陰性對照組比較，1號感染組組MG63正常細胞比例明顯下降，從（85.71±0.19）％下降至（70.17±0.58）％(t=44.15，P<0.05)，總凋亡細胞比例則從（11.01±0.22）％上升至（27.28±0.50）％(t=51.82，P<0.05)，其中晚期凋亡細胞數量增加最為突出。2號感染組與1號感染組比較，總細胞凋亡比例有所減少，但與陰性對照組比較，自（11.01±0.22）％上升至（24.28±0.50）％(t=30.06，P<0.01)。
細胞生長抑制與陰性對照組比較，從第3天開始，1號感染組細胞增殖速度明顯下降，第7天達到峰值，細胞增殖率自（395.14±2．24）％下降至（256.50±3.23）％(t=39.50，P<0.01)，細胞生長抑制率達（35.09±1.05）％。2號感染組細胞增殖率較1號感染組有所恢復，但與陰性對照組比較，增殖率自（395．14±2．24）％下降至（310．0±2．83）％(t=25.86，P<0.01)，細胞生長抑制率達（21.50±1.74）％。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。