攜帶融合蛋白基因的重組腺病毒及其製備方法和應用與流程
2023-07-12 06:51:41
本發明屬生物
技術領域：
：，涉及一種人癌胚抗原576-669(cea576-669)和熱休克蛋白70樣分子1(hsp70l1)融合基因的重組腺病毒及其製備方法和應用。
背景技術：
：：熱休克蛋白(heatshockprotein，hsp)是一類在生物進化中高度保守、廣泛存在於原核及真核生物中的一類蛋白質，在細胞受到應激後表達增加。hsp在細胞內作為伴侶分子，參與抗原的加工和形成mhc-抗原肽複合物。近年來，hsp家族明顯的佐劑樣作用引起了國內外學術界的關注。研究表明，hsp在細胞受到應激後，可以釋放到細胞外，誘導抗原提呈細胞和t細胞成熟活化等重要的生理過程，因此與機體的抗腫瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病等生理及病理機制密切相關，是一類重要的免疫分子(srivastavapk,annurevimmunol.2002；20:395–425)。熱休克蛋白家族按照分子量可以分為四類：hsp90家族、hsp70家族、hsp60家族和小分子hsp家族，其中hsp70家族是hsp中最保守和最主要的一類。許多研究表明，腫瘤細胞或者病毒感染細胞來源的hsp70-肽複合物、hsp70分子聯合多肽抗原、或者與多肽抗原交聯的複合物，能夠明顯誘導產生抗原特異性的cd8+的ctl，單獨使用hsp70或者單獨應用多肽抗原則無此效應，因此hsp在抗原遞呈過程中的佐劑樣作用及小分子肽的免疫原性是hsp介導的免疫治療所不可缺少的兩個重要部分(todryksm等,immunology.2003；110:1-9；manjilimh等,expertopinbiolther.2004；4:363-373；blacherene等,jimmunotheremphasistumorimmunol.1993；14:352-356；liz等,behringinstmitt.1994；94:37-47；moroiy等,procnatlacadsciusa.2000；97:3485–90)。hsp誘導的特異性ctl反應是由於專職抗原遞呈細胞(apc)上存在hsp的受體，可以使apc特異性地通過hsp受體介導抗原肽的內吞(arnold-schildd等,jimmunol.1999；162:3757-3760)；hsp結合的抗原在胞內是通過tap依賴及tap非依賴途徑，被遞呈到mhc-i類分子上，並誘導隨後的ctl反應，這種受體被證明存在於dc、巨噬細胞及b細胞等apc上，而不存在於t細胞上(castellinof,jexpmed.2000；191:1957-1964)；因此可以認為，hsp通過hsp受體與apc相互作用是hsp作為佐劑的一個重要機理。研究表明，這種受體介導的抗原遞呈方式的效率比吞噬高10000倍。hsp70分子在胞外可以行使類似細胞因子樣作用。hsp70可與單核細胞產生高親和力的結合，誘導其產生il-6、il-1等活性細胞因子，並可以誘導dc成熟，上調其mhc-ii和cd86分子表達，分泌il-12和tnf-α，從而增強dc的抗原遞呈能力(svenssonpa等；atherosclerosis.2006；185:32-38)。因此，採用hsp作為免疫佐劑協同腫瘤抗原誘導dc，可以靶向性介導抗原的遞呈，增強抗原的遞呈效率，從而誘導更強的ctl反應。在明確了hsp的獨特佐劑效應的基礎上，利用hsp的佐劑作用誘導抗腫瘤和抗感染免疫因此成為熱點，基於hsp的新一代疫苗紛紛進入臨床試驗研究。基於hsp的疫苗構成概括起來主要有以下幾種方式：1、從腫瘤細胞或病毒感染細胞純化hsp-肽複合物，用純化的hsp-肽複合物體內免疫激發抗腫瘤或抗感染免疫。hsp肽複合物用於腫瘤治療具有明顯的優勢，因為提取的hsp肽複合物可以直接用於免疫治療，不需要鑑定其中所包含的腫瘤特異性抗原表位。不足的是，此方案多採用個體化治療方案，即免疫所用的hsp-肽複合物需要來源於自體腫瘤細胞。2、通過原核和真核表達得到hsp，通過體外交聯使合成的表位肽結合於hsp肽結合袋，再用交聯的hsp-肽複合物誘導抗腫瘤或抗感染免疫。3、hsp抗原的融合蛋白免疫。4、hsp抗原基因融合表達的dna疫苗或腺病毒疫苗。自體腫瘤來源的gp96-肽複合物(hsppc-96)已進入以腎細胞癌為代表的多種惡性腫瘤的臨床試驗，目前已證實病人對多個不同應用劑量均有良好的耐受性(caudillmm和liz.expertopinbiolther.2001；1(3):539-47.)。cohen等用hsppc-96治療36例iv期腎細胞癌的臨床i期和iii-iv期黑色素瘤的ii期臨床結果顯示，治療組生存質量顯著提高(cohenl等；melanomares.200212(5):505-11.)。belli用hsppc-96治療轉移性黑色素瘤，未見明顯毒副作用，28例病人中，2例cr(completeresponse)，3例sd(stabledisease)，cr持續時間分別超過了559和703天；取經治病人的外周血單個核細胞作elispot檢測，23例中11例黑色素瘤特異性t細胞顯著增加(bellif等,jclinoncol.2002；20(20):4169-80.)。stressgen公司用hsp65和hpve7抗原的融合蛋白構成的疫苗hspe7(sgn-00101)對hpv感染和相關腫瘤的治療已被證實安全有效，現正進行臨床iii期試驗。可見，基於hsp的新一代疫苗具有非常好的臨床應用前景(maciagpc,patersony.curropinmolther.2005；7(3):256-263；hunts.curropinmolther.2001；3(4):413-417.)。中國人民解放軍第二軍醫大學免疫學教研室通過對重要的抗原遞呈細胞——樹突狀細胞cdna文庫大規模測序，發現了一種人hsp70家族的新分子，將之命名hsp70l1，並克隆了其全長cdna(genbank登錄號為af143723)，其表達產物已申請國家發明專利(申請號：99124271.8)。由於hsp70l1在胺基酸序列上與小鼠hsp70具有90％以上的序列一致性和相似性，序列中含有經典的hsp70家族的序列標籤，已有的實驗結果已經證實dc-hsp可以通過熱誘導、pma/tnfα刺激及細菌等誘導表達，與經典熱休克蛋白的特性相似。生物學功能實驗提示該蛋白具有一定的免疫佐劑樣作用，可以誘導樹突狀細胞分泌細胞因子，通過fitc標記及已知hsp家族成員的作用，初步證實dc表面存在dc-hsp結合位點，具有與經典hsp70家族非常相似的特點。研究表明，hsp70l1對於模擬腫瘤抗原具有良好的佐劑樣作用(want等,blood，2004；103:1747-1754)；hsp70l1與特異性腫瘤抗原cea576-669的融合原核蛋白也能誘導產生明顯的抗腫瘤免疫反應(中國發明專利申請號：200410053313.x；wuy等,cancerres，2005；65:4947-4954)。本領域中仍然迫切需要開發出可高效介導基因轉移及表達、並可用作有效抗腫瘤的基因轉移載體及其產品。技術實現要素：本發明的目的之一正是提供一種通過同源重組獲得的重組腺病毒，使用該重組腺病毒可實現對hsp70l1與人癌胚抗原融合蛋白基因的有效攜帶、轉移和表達。本發明的另一目的是提供一種由該重組腺病毒轉染的人樹突狀細胞，其可用於動物的腫瘤治療。本發明的又一目的是提供本發明的重組腺病毒或其致敏的人樹突狀細胞在癌症治療中的用途。在本發明的第一方面中，提供了一種通過同源重組獲得的重組腺病毒，其攜帶熱休克蛋白與癌胚抗原的融合蛋白的編碼序列，該腺病毒的基因組缺失e1區和e3區，並且在e1和/或e3區位置插入了所述融合蛋白編碼序列的表達盒，該表達盒依次包括：啟動子序列、所述融合蛋白的編碼序列以及加尾信號序列，其中所述熱休克蛋白選自：hsp70或hsp70l1。在一個優選例中，所述熱休克蛋白為hsp70l1。在本發明的一個實施方式中，所述癌胚抗原選自：人癌胚抗原的全長序列或含人癌胚抗原的第576-669位的片段。在一個優選例中，所述癌胚抗原為人癌胚抗原的第576-669位的片段。在本發明的另一個實施方式中，所述融合蛋白的編碼序列從5'至3'依次具有：癌胚抗原編碼序列、任選的連接肽編碼序列和熱休克蛋白編碼序列。在一個優選例中，所述融合蛋白具有seqidno:2所示的胺基酸序列，或由seqidno:1所示的核苷酸序列編碼。在另一個優選例中，所述連接肽的長度為0-10個胺基酸，優選1-5個胺基酸，更優選2-4個胺基酸，優選所述連接肽的編碼序列為sali酶切位點。在本發明的另一個實施方式中，所述重組腺病毒是通過選自下組的同源重組法獲得的：細胞內同源重組、細菌內同源重組、cos/tpc共轉染同源重組或位置特異性重組，優選細胞內病毒dna同源重組或細菌內質粒dna同源重組。在本發明的另一個實施方式中，所述腺病毒為ad5型腺病毒。在一個優選例中，所述腺病毒基因組dna的兩端結合有末端肽tp。在本發明的另一個實施方式中，所述重組腺病毒是基於選自下組的腺病毒表達載體構建的：padeasy-1、pshuttle-cmv或pshuttle-ires。在一個優選例中，所述融合蛋白編碼序列的表達盒中所含的啟動子序列是巨細胞病毒啟動子。在另一個優選例中，所述加尾信號序列為sv40polya。在本發明的第二方面中，提供了一種用本發明的重組腺病毒致敏的樹突狀細胞。在本發明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，它包括：(a)有效量的本發明所述的重組腺病毒、本發明所述的樹突狀細胞或用本發明的樹突狀細胞誘導的t細胞，以及(b)藥學或免疫學上可接受的載體、賦形劑或佐劑。在本發明的第四方面中，提供了一種製備重組腺病毒的方法，該重組腺病毒攜帶熱休克蛋白與癌胚抗原的融合蛋白的編碼序列，該方法包括如下步驟：(a)提供基因組中缺失e1區和e3區的複製缺陷型腺病毒；(b)提供攜帶熱休克蛋白與癌胚抗原的融合蛋白編碼序列表達盒的載體；(c)使步驟(a)的腺病毒與步驟(b)的載體進行同源重組，以獲得重組腺病毒。在一個優選例中，所述方法還包括如下步驟：(d)用步驟(c)中所得的重組腺病毒轉染宿主細胞，和(e)從被轉染的宿主細胞中獲得重組腺病毒。在另一個優選例中，所述宿主細胞表達e1a基因，優選所述宿主細胞為：hek293人胚胎腎細胞株。在另一個優選例中，所述重組是通過細菌內同源重組的方法進行的。在另一個優選例中，所述複製缺陷型腺病毒選自：padeasy-1、pshuttle-cmv或pshuttle-ires。在另一個優選例中，所述轉染所採用的方法是：磷酸鈣dna共沉澱轉染法或脂質體轉染法，優選脂質體轉染法。在另一個優選例中，步驟(d)是通過裂解細胞、不連續cscl梯度離心、連續cscl梯度離心和透析的四步法純化獲得的。在本發明的第五方面中，提供了一種製備致敏的樹突狀細胞的方法，所述方法包括：用本發明的重組腺病毒或用本發明上述方法製備的重組腺病毒轉染樹突狀細胞。在一個優選例中，所述樹突狀細胞為人單核細胞來源樹突狀細胞。在本發明的第六方面中，提供了本發明1所述的重組腺病毒、本發明所述的樹突狀細胞或用本發明的樹突狀細胞誘導的t細胞在製備用於預防或治療cea陽性腫瘤的藥物組合物中的用途。在一個優選例中，所述藥物組合物是疫苗。在另一個優選例中，所述cea陽性腫瘤選自：直結腸癌、非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、乳腺癌或卵巢癌。在本發明的另一方面中還提供了一種cea陽性腫瘤特異性t細胞的誘導方法，包括以下步驟：採用本發明所述的致敏的樹突狀細胞體外刺激人外周血淋巴細胞。在另一優選例中，該刺激步驟包括：(i)收集致敏的樹突狀細胞，並放射性滅活；(ii)將致敏後且滅活的樹突狀細胞按樹突狀細胞：t細胞為1:1-1000、優選1：20的比例共同孵育，在完全培養基中添加10-200u/ml的il-2，培養7±2天；重複步驟(i)和(ii)3-10次，收集增殖的t細胞，即為cea陽性腫瘤特異性t細胞。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1：本發明所製備adcea576-669hsp70l1病毒液的pcr鑑定結果。圖2：本發明所製備adcea576-669hsp70l1轉染人modc的rt-pcr和實時pcr鑑定結果。圖3：本發明所製備重組腺病毒轉染人單核細胞來源樹突狀細胞(modc)，輕度促進modc的成熟活化。a：經adcea576-669hsp70l1轉染後dc表達共刺激分子——cd40、cd54、cd80、cd86、cd83或hla-dr的水平；b：經過adcea576-669hsp70l1轉染後，dc刺激同種t細胞增殖的水平輕度上調。圖4：本發明所製備重組腺病毒轉染人單核細胞來源樹突狀細胞(modc)，誘導cea抗原特異性ctl產生。a：adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc能夠明顯誘導hla-a2.1限制性cap-1抗原特異性cd8+t細胞的生成；b：adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc組誘導的cd8+t細胞在cea576-669抗原刺激後，出現ifn-γ斑點的數量和斑點大小明顯增加；c：adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc組誘導的cd8+t細胞殺傷cea+的ls174t和sw480腫瘤細胞的能力明顯增加。圖5：重組adcea576-669hsp70l1體內免疫實驗動物誘導cea抗原特異性ctl的產生。a：adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導的cd8+cap-1-mhc四聚體+t細胞比例明顯增加；b：adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導的cd8+t細胞在cea576-669抗原刺激後，出現ifn-γ斑點的數量和斑點大小明顯增加；c：adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導的cd8+t細胞殺傷cea+的ls174t和sw480腫瘤細胞的能力明顯增加。圖6：重組adcea576-669hsp70l1治療cea陽性腫瘤疾病。a：adcea576-669hsp70l1免疫小鼠來源細胞治療組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫小鼠來源細胞治療組的動物腫瘤生長受到明顯抑制；b：adcea576-669hsp70l1免疫小鼠來源細胞治療組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫小鼠來源細胞治療組的動物生存期明顯延長。圖7：用padeno-x體系構建重組腺病毒的xhoi的限制性酶切分析(圖7a)和xbai/kpni雙限制性酶切(圖7b)結果。具體實施方式本發明人經過長期而深入的研究，通過同源重組方法構建了攜帶hsp70l1與特異性腫瘤抗原cea576-669融合基因的腺病毒載體(adcea576-669hsp70l1)，並利用此重組腺病毒載體轉染人樹突狀細胞(adcea576-669hsp70l1-dc)。研究證明：體內外應用adcea576-669hsp70l1或adcea576-669hsp70l1修飾的樹突狀細胞(adcea576-669hsp70l1-dc)可以有效誘導針對cea576-669抗原特異性的殺傷性t細胞生成，殺傷cea+的腫瘤細胞；並且過繼回輸adcea576-669hsp70l1或adcea576-669hsp70l1-dc免疫動物的淋巴細胞可以延長cea+腫瘤荷瘤動物的生存期和抑制腫瘤細胞生長。因此，adcea576-669hsp70l1或adcea576-669hsp70l1-dc可以作為治療性疫苗，應用於cea+腫瘤的治療。在此基礎上，本發明人完成了本發明。在本發明中，術語「融合蛋白表達盒」指含有以下元件的表達盒：熱休克蛋白與癌胚抗原的融合蛋白的編碼序列，以及表達所需的組件包括啟動子和聚腺苷酸化信號序列。此外，該表達盒還可以任選含有其它序列，其中包括但並不限於：增強子、分泌信號肽序列等。可以適用於本發明表達盒中的啟動子可以是任何一種常見的啟動子，它可以是組成型啟動子或誘導型啟動子。較佳地，該啟動子是組成型的強啟動子，如巨細胞病毒啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子等其它適用於真核表達的啟動子。如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性dna序列的某些部分能夠影響同一線性dna序列其他部分的活性。例如，如果信號肽dna作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)dna就是可操作地連於多肽dna；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。熱休克蛋白與癌胚抗原融合蛋白如本文所用，術語「熱休克蛋白」包括熱休克蛋白和熱休克蛋白樣蛋白，代表性的例子包括(但並不限於)：hsp70、hsp70l1(hsp70-likeprotein1)及其它的熱休克蛋白，優選為hsp70、hsp70l1。這些熱休克蛋白的序列可從genbank資料庫上獲得。如本文所用，術語「癌胚抗原和熱休克蛋白的融合蛋白」、「cea-hsp融合蛋白」等可互換使用，都指由癌胚抗原元件的胺基酸序列和熱休克蛋白(如hsp70或hsp70l1)的胺基酸序列融合而成的蛋白，其中在兩者之間可以有或者沒有連接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或沒有起始的甲硫氨酸或信號肽。如本文所用，術語融合蛋白中「癌胚抗原元件」指在所述融合蛋白中的一部分胺基酸序列，該序列與天然的或變異的全長癌胚抗原或其免疫原性片段具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然癌胚抗原基本上相同的生物活性。優選的癌胚抗原元件是人癌胚抗原或其免疫原性片段，更佳地是全長的人癌胚抗原或其免疫原性片段(如含576-669位的cea胺基酸序列的片段)。癌胚抗原和熱休克蛋白的序列可以源自人，也可以源自非人的動物。然而，優選的是人的天然序列。應理解本發明的癌胚抗原和熱休克蛋白的胺基酸序列或核苷酸序列還包括其同源序列(例如同源性高於90％、95％、98％或99％的序列)或由所述序列經保守取代、刪除或添加獲得的具有相同或相似功能的序列。如本文所用，術語「連接肽」或「胺基酸連接臂」可互換使用，指位於癌胚抗原胺基酸序列和熱休克蛋白胺基酸序列之間的、起連接作用的短肽。連接肽可存在或不存在，其長度通常為0-20個胺基酸，較佳地為2-10個胺基酸，最佳地為2-4個胺基酸。技術人員可按照本領域常規方法(如參見pnas1998；95:5929-5934；proteineng，2000；13(5):309-312等文獻)設計連接肽。通常，連接肽不影響或嚴重影響癌胚抗原與熱休克蛋白胺基酸序列形成正確的摺疊和空間構象。優選的連接肽例子包括(但並不限於)：為了有利於蛋白摺疊成相互獨立的結構域，用sggggsgggg等序列作為連接臂是合適的；為了有利於蛋白酶把cea-hsp70l1切割兩個獨立的蛋白分子，可用活性ⅹ因子的酶切位點(iegr)作連接臂。相似的，糜蛋白酶1、木瓜蛋白酶、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白酶、胰蛋白酶等的酶切位點也可設計作為胺基酸連接臂；為了有利於純化，可把6his作為連接臂，以用金屬親和層析純化cea-hsp70l1融合蛋白；上述三種方案的結合也可設計成新的胺基酸連接臂，如nvvvhqahhhhhheftyk連接臂就是融合了蛋白酶切位點(nia蛋白酶)和金屬親和層析位點6his。此外，另一種優選方式是將癌胚抗原元件和熱休克蛋白元件直接連接，而不含任何連接肽。編碼本發明融合蛋白的dna序列，可以全部人工合成。也可用pcr擴增或合成的方法獲得癌胚抗原和或熱休克蛋白的編碼dna序列，然後將其拼接在一起，形成編碼本發明融合蛋白的dna序列。腺病毒載體的構建目前的腺病毒載體大多來源於腺病毒ad2和ad5這兩種血清型。適用於基因治療應用的腺病毒載體屬於複製缺陷型病毒。由於e1編碼的蛋白功能是其它所有腺病毒基因有效表達所必須的，因此最常見的策略就是用外源dna替代病毒e1區序列，通過包裝細胞反式提供e1區序列而產生的複製缺陷腺病毒載體。在本發明中優選採用δe1δe3複製缺陷型腺病毒表達載體，例如padeasy-1(可購自strategen公司)。可用於本發明的宿主包裝細胞是可以表達腺病毒e1區基因的任何宿主細胞，因為該細胞能夠提供複製缺陷型腺病毒複製所需的e1區基因表達產物。一種優選的常用包裝細胞是293細胞，該細胞由人胚腎細胞經ad5腺病毒dna片段轉化而成，載有整合入細胞基因組的腺病毒e1區等病毒基因片段，並持續表達e1區蛋白，能為e1區置換型腺病毒載體提供反式補償。利用e3區缺失不影響病毒感染性，切去e3區可增加載體外源性dna容量。切去e1和e3區，外源基因插入容量可達約8kb。而克隆更大的外源dna片段則需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通過互補細胞系或輔助病毒反式提供。本發明人發現採用本領域中推薦的細胞外病毒直接連接方法(例如採用adeno-x表達系統)難以高效獲得本發明的含融合蛋白的重組腺病毒，線性pad骨架與含有該重組腺病毒的完整表達盒的線性片段在體外連接效率低，轉化細菌後獲得同源重組的重組腺病毒的機率極低。然而，本發明人經過長期和反覆的實驗出乎預料地發現，採用同源重組的方法反而可高效獲得本發明的重組腺病毒，且所得的重組腺病毒對靶細胞具有高感染性和低病源性，極顯著優於採用細胞外病毒直接連接法所獲得的結果。因此，本發明的重組腺病毒宜採用同源重組的方法獲得。可以採用選自下組的同源重組法，例如：(1)細胞內同源重組，如細胞內病毒dna同源性重組；(2)細菌內同源重組，如細菌內質粒dna同源重組；(3)cos/tpc共轉染同源重組；或(4)位置特異性重組。本發明中優選採用細菌內同源重組法，例如採用padeasy-1、pshuttle-cmv或pshuttle-ires，並將含有融合蛋白表達盒的線性片段轉化含有腺病毒骨架的大腸桿菌(例如大腸桿菌bj5183)，使它們在細菌內同源重組。重組腺病毒致敏的樹突狀細胞及由該細胞誘導的cea抗原特異性t細胞樹突狀細胞(dendriticcells，dc)是正常人體內存在的一種具有特殊功能的抗原提呈細胞，被喻為機體的「天然佐劑」，能夠直接攝取、加工、呈遞抗原，刺激體內的初始型t細胞活化，是機體免疫應答的「啟動者」。此外，dc還可以通過直接或間接方式促進b細胞的增殖與活化，調控體液免疫應答；刺激記憶t細胞活化誘發再次免疫應答；與nk相互作用影響非特異性的、天然免疫應答。dc處於腫瘤免疫的關鍵環節，能攝取和加工處理腫瘤抗原並調動機體主動特異性抗腫瘤免疫反應殺傷腫瘤細胞。本發明中提供了一種由本發明重組腺病毒致敏的樹突狀細胞，其可有效用於誘導cea抗原特異性t細胞。可採用本領域中已知的用於致敏樹突狀細胞的常用方法使得本發明的樹突狀細胞致敏，優選用本發明的重組腺病毒對樹突狀細胞進行病毒轉染。可根據本領域中常用的方法，用本發明致敏的樹突狀細胞進一步誘導的cea抗原特異性t細胞。在本發明的一個實施方式中，採用本發明所述的致敏的樹突狀細胞體外刺激人外周血淋巴細胞。所述方法優選包括如下步驟：(i)收集致敏的樹突狀細胞細胞，並對其進行滅活(例如放射性滅活)；(ii)將致敏且滅活的樹突狀細胞按樹突狀細胞：t細胞為1:1-1000、優選1：20的比例共同孵育，優選在完全培養基中添加10-200u/ml的il-2，培養7±2天；(iii)重複步驟(i)和(ii)3-10次，收集增殖的t細胞，即為cea陽性腫瘤特異性t細胞。組合物本發明中還提供了一種藥物組合物，其包括：(a)有效量的本發明的重組腺病毒、樹突狀細胞或用本發明樹突狀細胞誘導的t細胞，以及(b)藥學或免疫學上可接受的載體、賦形劑或佐劑。所述組合物可用於預防或治療cea陽性腫瘤。如本文所用，術語「cea陽性腫瘤」或「cea+腫瘤」包括指在腫瘤細胞膜上高度表達cea抗原的腫瘤，代表性的例子包括(但並不限於)：直結腸癌、非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤。如本文所用，「活性物質」是指本發明的重組腺病毒、該重組腺病毒致敏的樹突狀細胞、cea抗原特異性t細胞或它們的組合。在製得本發明的重組腺病毒、該重組腺病毒致敏的樹突狀細胞或cea抗原特異性t細胞之後，可將所需純度的所述活性物質與任選的生理上、藥學或免疫學上可接受的載體、賦形劑、或穩定劑(remington'spharmaceuticalsciences,16版，osol,a.,ed.,[1980])，以凍幹形式或水溶液形式進行混合，從而製得本發明的組合物。可接受的載體、賦形劑或穩定劑對接受者而言在所用的劑量和濃度下應是無毒的，並且可含有緩衝液如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸緩衝液；抗氧化劑如維生素c；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如edta；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑如tween、pluronics或聚乙二醇(peg)。作為最常見的例子，水和生理鹽水就可作為本發明製劑中的載體。在本發明的另一個實施方式中，本發明的活性物質佔所述組合物總重量的0.001-99.9wt％，優選1-95wt％，更優選5-90wt％，再優選10-80wt％。含本發明活性物質的組合物(或製劑)可以用常規方式施用於需要治療的個體，這些方式包括(但並不限於)：肌內注射、皮下注射、靜脈注射等。施予本發明活性物質的量可由專業人員(如醫師)根據對象的具體情況，如病症、病程、年齡、性別、其它相關治療等確定。通常，給予本發明活性物質的量為：重組腺病毒：107-1011pfu/千克體重，較佳地108-5×1010pfu/千克體重，更佳地優選109-1010pfu/千克體重；本發明重組腺表達致敏的dc細胞：103-107致敏dc細胞/千克體重，較佳地105-5×106致敏dc細胞/千克體重，更佳地105-106致敏dc細胞/千克體重；本發明cea抗原特異性t淋巴細胞：105-109cea抗原特異性t淋巴細胞/千克體重，較佳地106-108cea抗原特異性t淋巴細胞/千克體重,更佳地106-107cea抗原特異性t細胞/千克體重。本發明的組合物中還可包含治療和/或預防cea+腫瘤的其它活性物質或與這些其它物質聯合施用(如同時或先後施用)。在一個優選例中，所述治療和/或預防cea+腫瘤的其它活性物質選自：腫瘤化療藥，如奧沙利鉑；或腫瘤抗原衝擊的樹突狀細胞，腫瘤抗原可以是已知的抗原肽也可以是腫瘤細胞裂解物。本發明的主要優點1.本發明的重組腺病毒通過感染細胞，表達於胞內，克服了「cea-hsp融合蛋白」原核表達的以下不足之處：1)表達技術具有一定的難度，難以獲得大量產品用於將來臨床治療目的；2)該融合蛋白誘導樹突狀細胞成熟的能力過強，採用原核表達法很難控制體內用量，易於出現免疫反應過強的副作用；3)hsp70l1的天然形式為胞內蛋白，或許在胞內發揮主要作用；4)以原核表達形式產生的融合蛋白缺少正確的摺疊和糖基化修飾等真核蛋白(其天然形式)的特點；5)融合蛋白通過在細胞外與受體結合內吞形式進入胞內，根據免疫學原理，胞外蛋白主要通過mhc-ii類途徑遞呈抗原，也就是誘導抗原特異性的cd4+t細胞；而胞內蛋白主要通過mhc-i類途徑遞呈抗原，也就是誘導抗原特異性的cd8+t細胞，本發明主要目的就是實現該mhc-i類途徑的抗原遞呈。2.本發明的重組腺病毒對靶細胞具有高感染性和低病源性，能安全、高效地介導基因表達轉移及表達，具有致癌、至突變機率小等優點，為抗腫瘤基因治療提供了理想的基因轉移載體；3.本發明的重組腺病毒及其致敏的樹突狀細胞可有效誘導cea抗原特異性的殺傷性t細胞生成，而後者具有殺傷cea陽性腫瘤細胞株和抑制cea陽性腫瘤生長，延長荷瘤動物生存期的作用。從而，為cea陽性腫瘤預防和治療提供了的新策略。實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件(例如，基本分子生物學操作均參照《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1992；基本細胞學操作均參照《細胞培養實驗指南》第一版，科學出版社，2001)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1.adcea576-669hsp70l1的設計與製備本實驗中限制性內切酶和taq酶購自neb公司；pqe30和宿主菌m15購自qiagen公司；預轉染adeasy-1的大腸桿菌bj5183、pshuttle-cmv購自strategen公司；ls174t購自atcc。人單核來源樹突狀細胞的誘導：取健康志願者抗凝血200ml，應用ficoll1.077密度梯度離心，獲得人外周血單個核細胞；免疫磁珠法分離人單核細胞，簡言之，將2×108人外周血單個核細胞與200μlcd14免疫磁珠於4℃孵育15分鐘；將結合了免疫磁珠的人外周血單個核細胞置於磁場中，洗去陰性細胞，從柱中衝出陽性細胞，即為人外周血cd14+單核細胞；將新鮮分離的人cd14+單核細胞(mo)按照106個細胞/ml培養在含有10％fbs、人gm-csf(500u/ml)、人il-4(10ng/ml)的rpmi1640培養基中。6天後，收集懸浮細胞，即為人單核來源樹突狀細胞(modc)。從lps(脂多糖)刺激的人單核來源樹突狀細胞(modc)中擴增獲得hsp70l1的全長cdna(按照參考文獻16)。用rt-pcr的方法(上遊引物5』-ctcgtcgacgcggccatcggagttcacctg-3』(seqidno:3)，下遊引物5』-ggggtaccagatgctatctcaatagagattgct-3』(seqidno:4)；反應參數：95℃15秒，53℃30秒，72℃40秒，29循環後72℃延伸10分鐘)複製人hsp70l1cdna，上下遊引物中引入sali和kpni酶切位點。從ls174t細胞中分離總rna，用rt-pcr的方法(上遊引物5』-attgagctcgtgagtgcaaaccgcagtgacc-3』(seqidno:5)，下遊引物為：5』-tatgtcgacgactatggaattattgcggcc-3』(seqidno:6)；反應參數：95℃、15秒，56.5℃、30秒，72℃、45秒，29循環後72℃延伸10分鐘)複製人cea576-669cdna，上下遊引物中引入saci和sali酶切位點。將cea576-669cdna片斷插入到質粒pqe30中，形成pqe30cea576-669；將hsp70l1cdna插入到pqe30cea576-669，形成重組pqe30cea576-669hsp70l1。由此獲得的重組pqe30cea576-669hsp70l1中，cea576-669的cdna位於hsp70l1cdna的5』端，中間由限制性酶切位點sali連接，其基因序列如seqidno:1所示。通過核苷酸序列分析驗證cdna基因。以重組pqe30cea576-669hsp70l1為模板，擴增cea576-669hsp70l1片段(反應參數：95℃、15秒，57℃、30秒，72℃、90秒，29循環後72℃延伸10分鐘)，所用引物序列如下為上遊：5』-ccggtaccatggtgagtgcaaaccgcagtgacc-3』(seqidno:7)；下遊：5』-ccctcgagttaagatgctatctcaatagagattgc-3』(seqidno:8)。擴增的cea576-669hsp70l1片斷經kpni和xhoi酶切後插入到穿梭質粒pshuttle-cmv，構建成重組pshuttlecea576-669hsp70l1；經測序鑑定正確後，經過pmei酶切線性化，轉化預轉染了複製缺陷型padeasy-1的大腸桿菌bj5183(常規cacl2、熱休克方法)；經卡那抗性篩選獲得重組腺病毒質粒padcea576-669hsp70l1，經限制性酶切分析證實後，將獲得的陽性克隆，進一步擴增，大量抽提padcea576-669hsp70l1，經paci酶切線性化後，用於轉染hek293細胞，進行腺病毒的包裝。(1)製備重組腺病毒粗提液本實驗採用的dmem培養液、胎牛血清fbs購自paa公司；轉染試劑購自polyplus-transfection公司。hek293細胞購自中國科學院上海細胞所。將hek293細胞(表達腺病毒e1a、e1b蛋白的人胚腎細胞株293細胞)在10％fbs的dmem培養液、37℃、5％co2環境中培養至50-70％融合。採用脂質體方法將線性化padcea576-669hsp70l1轉染至hek293細胞，操作參照說明書進行。2h後添加等體積的含10％fbs的dmem培養液，24h後更換新鮮的含10％fbs的dmem培養液，繼續培養。培養至10-14天時，出現細胞病變效應，包括細胞黏附性降低、脫落、變圓、呈現串珠樣改變。收集出現病變的細胞，反覆凍融3次，製備成重組腺病毒粗提液，於-70℃保存備用。(2)單個噬斑純化病毒本試驗採用sigma公司的瓊脂糖。將hek293細胞(3×105個細胞/孔)接種於6孔板，至70％融合時，加入重組腺病毒粗提液，37℃感染2h，棄去病毒液，加入1.25％瓊脂糖半固體培養基，室溫培養30分鐘，待凝固後，放置37℃、5％co2環境中培養至出現噬斑。挑取單個噬斑(選取3個克隆)，重新感染hek293細胞，經反覆擴增，製備病毒液，進行pcr鑑定(反應參數：95℃、15秒，62℃、30秒，72℃、90秒，35循環後72℃延伸10分鐘)。結果顯示padcea576-669hsp70l1含有1812bp特徵性條帶(圖1)。所用引物序列如下：上遊：5』-ggaaatgcggccgcatggtgagtgcaaac-3』(seqidno:9)；下遊：5』-aatcggctcgagttaagatgctatctcaat-3』(seqidno:10)。(3)adcea576-669hsp70l1的擴增及純化padcea576-669hsp70l1的大量擴增：將hek293細胞以50-70％的匯合率鋪於60mm培養皿中，以30-50％的體積比加入含病毒上清液。在cpe現象出現後，有1/3到1/2的細胞脫離漂浮時，離心收集細胞。將細胞重懸於2.0mlpbs中。於液氮中凍結細胞，37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進行3次。將獲得的病毒上清進一步感染100mm培養皿的hek293細胞，按前述方法收集病毒，並進而將其感染多個100mm培養皿的hek293細胞，以獲得足夠量的病毒。重組腺病毒的純化：分別進行不連續cscl梯度離心(密度分別為1.4g/ml和1.2g/ml)和連續cscl梯度離心(1.3g/ml)。透析去除cscl，將重組腺病毒保存於緩衝液(10mmtris,4％蔗糖,2mmmgcl2,ph8.0)。並且，多次實驗證明了採用上述(1)～(3)中的方法獲得本發明的重組腺病毒具有很高的重現性。(4)測定adcea576-669hsp70l1滴度按常規噬斑分析法測定padcea576-669hsp70l1滴度為1.2х1012pfu/ml。實施例2.重組adcea576-669hsp70l1體外感染人單核來源樹突狀細胞與表達本實驗中rpmi1640培養基和ficoll1.077購自paa公司；人gm-csf和人il-4購自peprotech公司；cd14免疫磁珠、ms柱和分離架購自miltenylbiotec公司；adlacz購自strategen公司。人單核來源樹突狀細胞(modc)的誘導方法如實施例1中所述。用含有10％fbs的rpmi1640培養基重懸收集的modc，調整濃度為107個細胞/ml。按照moi＝1000：1，用重組adcea576-669hsp70l1(如實施例1中所製備)感染modc。24h後收集細胞，提取總rna，進行rt-pcr(cea576-669：反應參數：94℃、30秒，54℃、30秒，72℃、30秒，35循環後72℃延伸10分鐘；hsp70l1：反應參數：94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，35循環後72℃延伸10分鐘；cea576-669hsp70l1：反應參數：94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，35循環後72℃延伸10分鐘)和實時pcr(各反應參數同rt-pcr)的鑑定。另設置未感染、adlacz(購自strategen公司，自行擴增和純化如實施例1所述方法；moi＝1000：1)感染組對照。結果見圖2。該結果表明：adcea576-669hsp70l1感染的人modc後，表達cea576-669,hsp70l1,以及ceahsp70l1mrna的水平顯著高於未轉染組和adlacz轉染組。rt-pcr引物序列如下：cea576-669(279bp)：上遊：5』-attgagctcgtgagtgcaaaccgcagtgacc-3』(seqidno:11)；下遊：5』-tatgtcgacgactatggaattattgcggcc-3』(seqidno:12)hsp70l1(122bp)：上遊：5』-cagcatgtgaggccgtcta-3』(seqidno:13)；下遊：5』-tgctgccaatccaacaat-3』(seqidno:14)cea576-669hsp70l1(111bp)：上遊：5』-aaatcacgccaaataataacgg-3』(seqidno:15)；下遊：5』-tgcagcccaggtgaactcc-3』(seqidno:16)。實施例3.重組adcea576-669hsp70l1基因修飾促進人modc的成熟活化本實施例中各抗體購自b.d.pharmingen公司；cfse購自calbiochem公司；cd3免疫磁珠購自miltenylbiotech公司；原核蛋白cea576-669hsp70l1由本室採用常規方法純化並保存(挑取轉化有pqe30-cea576-669hsp70l1質粒的m15菌，經過誘導表達後，其表達以包涵體形式存在於胞內；包涵體經過洗滌和溶解，上金屬離子螯合柱和deae柱層析純化cea576-669hsp70l1融合蛋白，透析後溶於pbs，保存於-80℃)。將新鮮分離的人外周血cd14+單核細胞(mo)以106個細胞/ml培養在含有10％fbs、人gm-csf(500u/ml)、人il-4(10ng/ml)的rpmi1640培養基中。6天後，收集懸浮細胞即為人單核來源樹突狀細胞(modc)。用含有10％fbs的rpmi1640培養基重懸收集的modc，調整濃度為107個細胞/ml；按照moi＝1000：1，分別用adlacz或adcea576-669hsp70l1感染modc，2h後洗去游離病毒，繼續培養在上述培養基中；cea576-669hsp70l1蛋白按照100μg/ml與modc孵育。48h後收集modc，進行以下試驗：(1)表型檢測用抗共刺激分子cd40、cd54、cd83、cd86和mhcii分子的抗體標記modc細胞，並進行流式細胞(facscalibur，bd公司)分析。結果顯示，與未感染組和adlacz組比較，重組腺病毒adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc表達共刺激分子cd54、cd86和mhc-ii分子的水平輕度上調；表達cd83和cd40的水平沒有改變(圖3a)。(2)刺激同種t淋巴細胞增殖的能力分離同種cd3+t淋巴細胞(應用免疫磁珠方法，如實施例2)。將modc與同種cd3+t淋巴細胞按照modc：cd3+t淋巴細胞＝1:10的比例混合培養5天，檢測t細胞的增殖情況。t細胞預先用cfse標記，用流式細胞儀檢測cfse低表達的t淋巴細胞％(反映增殖的t細胞)。結果顯示，與未感染組和adlacz組比較，重組腺病毒adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc刺激同種cd3+t淋巴細胞增殖的水平輕度上調(圖3b)。上述試驗結果表明，重組adcea576-669hsp70l1基因修飾促進了人modc的成熟活化。實施例4.重組adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc誘導cea抗原特異性ctl產生本實施例中，cap-1-mhc四聚體購自proimmune公司；cd8免疫磁珠購自miltenylbiotech公司；elispot培養板購自millipore公司；抗人ifn-γ單抗購自b.d.pharmingen公司；7-aad購自sigma公司；重組cea576-669抗原由本室純化(原核表達載體pqe30-cea576-669在m15菌中誘導表達後，重組的cea576-669蛋白主要以包涵體的形式存在於細菌胞內，包涵體經過洗滌和溶解後，過金屬離子螯合柱層析初步純化重組cea576-669蛋白，然後經過常規方法復性、透析、過濾除菌分裝保存於-80℃)。fitc-偶聯的抗人hla-a2.1抗體購自b.d.pharmingen公司。人外周血單個核細胞預先經fitc-偶聯的抗人hla-a2抗體標記，流式細胞儀分析選取hla-a2陽性樣本，進行免疫磁珠法分離cd14+單核細胞，和modc的誘導。按照實施例3感染人hla-a2+modc，48h後收集modc，分裝成4份；一份與自身cd3+t淋巴細胞按照1:20的比例混合培養，其餘3份用含有5％dmso、95％fbs的凍存液凍存於-80℃。培養7天後，復甦一支凍存的重組adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc，將其按照同樣比例加入到混合培養體系中，培養3天後，添加人il-2(100u/ml)，繼續培養。同法進行第3個循環的刺激。在21天後，進行如下試驗：(1)hla-a2.1限制性cea605-613抗原肽(cap-1)特異性t淋巴細胞比例(cd8+cap-1-mhc四聚體+％)收集培養終止的細胞，用抗cd8和cap-1-mhc四聚體進行雙色標記，流式細胞儀分析cd8+cap-1-mhc四聚體+％。結果如圖4a所示，該結果表明：與未感染、adlacz感染組、cea576-669hsp70l1致敏dc組(圖中分別示為ctrl、adlacz和ceahsp70l1)比較，adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc(圖中示為adceahsp70l1)能夠明顯誘導cap-1抗原特異性cd8+t細胞的生成。(2)hla-a2.1限制性cea576-669抗原特異性cd8+t細胞分泌ifn-γ的水平分離共培養體系中的cd8+t淋巴細胞，與復甦的自身modc按照5：1比例培養，體系中添加人cea576-669蛋白(10μg/ml)，培養至包被有抗人ifn-γ的96孔培養板，培養3天後終止，按照elispot說明書進行ifn-γ分泌斑點的檢測。結果如圖4b所示，該結果表明：與未感染、adlacz感染組和cea576-669hsp70l1致敏dc組(圖中分別示為ctrl、adlacz和ceahsp70l1)比較，adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc組(圖中示為adceahsp70l1)誘導的cd8+t細胞在cea576-669抗原刺激後，出現ifn-γ斑點的數量和斑點大小明顯增加，說明該培養體系中含有更多的cea特異性cd8+t細胞。(3)對cea+腫瘤細胞的殺傷作用分離共培養體系中的cd8+t淋巴細胞，與cfse標記的cea+腫瘤細胞株(ls174t和sw480購自atcc)按照10：1的比例共培養，4h後，加入7-aad，立即用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的死亡(cfse+7-aad+％)。結果顯示，與未感染、adlacz感染組和cea576-669hsp70l1致敏dc組比較，adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc組誘導的cd8+t細胞殺傷cea+的ls174t和sw480腫瘤細胞的能力明顯增加(附圖4c)。綜上，重組adcea576-669hsp70l1基因修飾的人modc能夠更強的誘導cea576-669抗原特異性ctl產生。尤其是，adcea576-669hsp70l1修飾的人樹突狀細胞比原核蛋白cea576-669hsp70l1衝擊的人樹突狀細胞能夠更強烈的誘導cea特異性ctl的產生，表現在adcea576-669hsp70l1修飾的人樹突狀細胞誘導的對cap-1(cea蛋白中的一種hla-a2限制性肽)特異性的cd8+t細胞、殺傷cea+腫瘤細胞的能力更強。實施例5.重組adcea576-669hsp70l1體內免疫實驗動物誘導cea576-669抗原特異性ctl的產生取4周齡hla-a2.1/kb轉基因小鼠(購自jacksonlaboratory)骨髓細胞，按照1х107個細胞/ml培養在含有10％fbs，鼠gm-csf(10ng/ml),鼠il-4(1ng/ml)的rpmi1640培養基中，三天後吸棄懸浮細胞，貼壁細胞繼續培養在上述培養基中，在6天後，收集懸浮細胞，即為骨髓來源樹突狀細胞。用含有10％fbs的rpmi1640培養基重懸細胞，調整濃度為1х107個細胞/ml，按照moi＝1000:1加入重組腺病毒adlacz或adcea576-669hsp70l1，2h後，洗去游離病毒，一部份用於免疫，其餘凍存，用於後續免疫。將30隻4周齡hla-a2.1/kb轉基因小鼠(雌雄比例1:1，購自jacksonlaboratory)按照隨機原則分成五組；①未處理組；②adlacz免疫組，腹腔注射，109pfu/只；③adcea576-669hsp70l1免疫組，腹腔注射，109pfu/只；④adlacz基因修飾的小鼠骨髓來源樹突狀細胞免疫組(adlacz-dc)，腹腔注射，106adlacz-dc細胞/只；⑦adcea576-669hsp70l1基因修飾的小鼠骨髓來源樹突狀細胞免疫組(adcea576-669hsp70l1-dc),腹腔注射，106adcea576-669hsp70l1-dc細胞/只；免疫方案為每隔7天免疫一次，共免疫三次。21天後，進行如下試驗：(1)hla-a2.1限制性cap-1抗原肽特異性t淋巴細胞比例(cd8+cap-1-mhc四聚體+％)測定分離各組小鼠脾細胞，用抗cd8抗體和cap-1-mhc四聚體對脾細胞進行雙色標記，流式細胞儀分析cd8+cap-1-mhc四聚體+t淋巴細胞比例。結果顯示，與未免疫組和adlacz或adlacz-dc免疫組比較，adceahsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導的cd8+cap-1-tcr+t細胞比例明顯增加(圖5a)。(2)hla-a2.1限制性cea576-669抗原特異性cd8+t細胞分泌ifn-γ的水平分離各組小鼠脾細胞中的cd8+t淋巴細胞，與自身骨髓來源dc按照5：1比例培養至包被有抗鼠ifn-γ的96孔培養板，體系中添加鼠il-2(100u/ml)，和cea576-669抗原(10μg/ml)；培養3天後終止，然後按照elispot說明書進行ifn-γ分泌斑點的檢測。結果顯示，與未免疫組和adlacz或adlacz-dc免疫組比較，adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導的cd8+t細胞在cea576-669抗原刺激後，出現ifn-γ斑點的數量和斑點大小明顯增加，說明adcea576-669hsp70l1和adcea576-669hsp70l1-dc免疫能夠誘導體內產生更多的cea576-669抗原特異性cd8+t細胞(圖5b)。(3)對cea+腫瘤細胞的殺傷作用分離各組小鼠脾細胞中的cd8+t淋巴細胞，與cfse標記的cea+腫瘤細胞株(ls174t和sw480)按照10：1的比例共培養，4h後，加入7-aad，立即用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的死亡(cfse+7-aad+％)。結果顯示，與未免疫組和adlacz或adlacz-dc免疫組比較，adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組誘導的cd8+t細胞殺傷cea+的ls174t和sw480腫瘤細胞的能力明顯增加，表明adcea576-669hsp70l1或adcea576-669hsp70l1-dc免疫能夠誘導體內產生更多的cea抗原特異性cd8+ctl(圖5c)。綜上，adcea576-669hsp70l1免疫組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫組能夠明顯誘導cea抗原特異性ctl的產生。實施例6.重組adcea576-669hsp70l1治療cea陽性腫瘤疾病將50隻4周齡hla-a2.1/kb轉基因小鼠(雌雄比例1:1，購自jacksonlaboratory)按照隨機原則分成五組；①未處理組；②adlacz免疫組，腹腔途徑，109pfu/只；③adcea576-669hsp70l1免疫組，腹腔途徑，109pfu/只；④adlacz基因修飾的小鼠骨髓來源樹突狀細胞免疫組(adlacz-dc)；腹腔途徑，106adlacz-dc/只；⑤adcea576-669hsp70l1基因修飾的小鼠骨髓來源樹突狀細胞免疫組腹腔途徑，106adcea576-669hsp70l-dc/只；免疫方案為每隔7天免疫一次，共免疫三次。21天後，分離小鼠脾細胞、腋窩、腹骨溝腸繫膜淋巴結細胞，去除紅細胞後，用pbs重懸，按照5х107/只，靜脈注射給cea+腫瘤荷瘤動物模型。建立cea+腫瘤荷瘤動物模型：將1х106的ls174t細胞，於皮下接種於4周齡的裸鼠；共接種50隻裸鼠，三天後按照隨機原則分為4組，接受細胞治療：①未治療組；②未免疫小鼠來源細胞治療組；③adlacz免疫小鼠來源細胞治療組；或adlacz-dc免疫小鼠來源細胞治療組；④adcea576-669hsp70l1免疫小鼠來源細胞治療組；或adcea576-669hsp70-dc免疫小鼠來源細胞治療組。治療方案：接種腫瘤後3天開始接受細胞治療；隔7天後重複一次。待出現可測腫瘤後，每隔一天進行腫瘤大小的測量和生存期的觀察，共觀察3個月。結果顯示，與未治療組、未免疫小鼠來源細胞治療組、和adlacz或adlacz-dc免疫小鼠來源細胞治療組比較，adcea576-669hsp70l1免疫小鼠來源細胞治療組和adcea576-669hsp70l1-dc免疫小鼠來源細胞治療組的動物腫瘤生長受到明顯抑制(圖6a)；生存期明顯延長(圖6b)。實施例7.應用padeno-x體系構建重組腺病毒adcea576-669hsp70l1如實施例1，以重組pqe30cea576-669hsp70l1為模板，擴增cea576-669hsp70l1片段(反應參數：95℃、15秒，57℃、30秒，72℃、90秒，29循環後72℃延伸10分鐘)，所用引物序列如下為上遊：上遊引物：5』-ttcctctagaatggtgagtgcaaaccgcagtgac-3』(seqidno:17)；下遊引物：5』-aagtggtaccagatgctatctcaatagagat-3』(seqidno:18)擴增的cea576-669hsp70l1片斷經kpni和xbai酶切後插入到穿梭質粒pshuttle2，引入cmv啟動子和polya尾，構建成重組pshuttlecea576-669hsp70l1；經測序鑑定正確後，經過pi-scei和i-ceui雙酶切，得到含有cmv啟動子、目的片段和polya尾的完整表達盒的線性片段，然後與padeno-x的線性骨架在體外用連接酶連接；轉化大腸桿菌(常規cacl2、熱休克方法)；經氨苄抗性篩選可獲得1-2個抗性株，抽提質粒，進行經xhoi的限制性酶切分析(圖7a)和xbai/kpni雙限制性酶切(圖7b)發現抗性株中的質粒沒有出現應有的限制性酶切片段分布和目的片段。上述結果表明：線性pad骨架與含有該重組腺病毒的完整表達盒的線性片段在體外連接效率非常低，轉化細菌後獲得同源重組的重組腺病毒的機率非常低。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。參考文獻1.srivastavapk.interactionofheatshockproteinswithpeptidesandantigenpresentingcells:chaperoningoftheinnateandadaptiveimmuneresponses.annurevimmunol2002；20:395–425.2.todryksm,goughmj,pockleyag.facetsofheatshockprotein70showimmunotherapeuticpotential.immunology.2003；110:1-9.3.manjilimh,wangxy,macdonaldij,arnoukh,yanggy,pritchardmt,subjeckjr.cancerimmunotherapyandheat-shockproteins:promisesandchallenges.expertopinbiolther.2004；4(3):363-734.blacherene,udonoh,janetzkis,liz,heikem,srivastavapk.heatshockproteinvaccinesagainstcancer.jimmunotheremphasistumorimmunol.1993；14:352-356.5.liz,srivastavapk.acriticalcontemplationontheroleofheatshockproteinsintransferofantigenicpeptidesduringantigenpresentation.behringinstmitt.1994；94:37-47.6.moroiy,mayhewm,trckaj,etal.inductionofcellularimmunitybyimmunizationwithnovelhybridpeptidescomplexedtoheatshockprotein70.procnatlacadsciusa2000；97:3485–907.arnold-schildd,hanaud,spehnerd,schmidc,rammenseehg,delasalleh,schildh.cuttingedge:receptor-mediatedendocytosisofheatshockproteinsbyprofessionalantigen-presentingcells.jimmunol.1999；162(7):3757-60.8.castellinof,boucherpe,eichelbergk,mayhewm,rothmanje,houghtonan,germainrn。receptor-mediateduptakeofantigen/heatshockproteincomplexesresultsinmajorhistocompatibilitycomplexclassiantigenpresentationviatwodistinctprocessingpathways..jexpmed.2000；191(11):1957-64.9.svenssonpa,aseaa,englundmc,bauseroma,m,wiklundo,ohlssonbg,carlssonlm,carlssonb.majorroleofhsp70asaparacrineinducerofcytokineproductioninhumanoxidizedldltreatedmacrophages.atherosclerosis.2006mar；185(1):32-8.epub2005jul1.10.caudillmm,liz.hsppc-96:apersonalisedcancervaccine.expertopinbiolther.2001may；1(3):539-47.11.cohenl,demoorc,parkerpa,amatorj.qualityoflifeinpatientswithmetastaticrenalcellcarcinomaparticipatinginaphaseitrialofanautologoustumor-derivedvaccine.uroloncol.2002；7(3):119-24.12.cohenl,parkerpa,sternerj,demoorc.qualityoflifeinpatientswithmalignantmelanomaparticipatinginaphaseitrialofanautologoustumour-derivedvaccine.melanomares.200212(5):505-11.13.bellif,testoria,rivoltinil,maiom,andreolag,sertolimr,gallinog,pirisa,cattelana,lazzarii,carrabbam,scitag,santantonioc,pillal,tragnig,lombardoc,arientif,marchianòa,queirolop,bertolinif,covaa,lamaje,ascanil,camerinir,corsim,cascinellin,lewisjj,srivastavap,parmianig.vaccinationofmetastaticmelanomapatientswithautologoustumor-derivedheatshockproteingp96-peptidecomplexes:clinicalandimmunologicfindings.jclinoncol.2002；20(20):4169-80.14.maciagpc,patersony.technologyevaluation:hspe7(stressgen).curropinmolther.2005；7(3):256-63.15.hunts.technologyevaluation:hspe7,stressgenbiotechnologiescorp.curropinmolther.2001；3(4):413-7.16.want,zhoux,cheng,anh,chent,zhangw,lius,jiangy,yangf,wuy,caox.novelheatshockproteinhsp70l1activatesdendriticcellsandactsasath1polarizingadjuvant.blood.2004；103(5):1747-54.17.wuy,want,zhoux,wangb,yangf,lin,cheng,dais,lius,zhangm,caox.hsp70-likeprotein1fusionproteinenhancesinductionofcarcinoembryonicantigen-specificcd8+ctlresponsebydendriticcellvaccine.cancerres.2005；65(11):4947-4954.序列表中國人民解放軍第二軍醫大學攜帶融合蛋白基因的重組腺病毒及其製備方法和應用09576718patentinversion3.311812dna人工序列cds(1)..(1812)1gtgagtgcaaaccgcagtgacccagtcaccctggatgtcctctatggg48valseralaasnargseraspprovalthrleuaspvalleutyrgly151015ccggacacccccatcatttcccccccagactcgtcttacctttcggga96proaspthrproileileserproproaspsersertyrleusergly202530gcgaacctcaacctctcctgccactcggcctctaacccatccccgcag144alaasnleuasnleusercyshisseralaserasnproserprogln354045tattcttggcgtatcaatgggataccgcagcaacacacacaagttctc192tyrsertrpargileasnglyileproglnglnhisthrglnvalleu505560tttatcgccaaaatcacgccaaataataacgggacctatgcctgtttt240pheilealalysilethrproasnasnasnglythrtyralacysphe65707580gtctctaacttggctactggccgcaataattccatagtcgtcgacgcg288valserasnleualathrglyargasnasnserilevalvalaspala859095gccatcggagttcacctgggctgcacctcagcatgtgaggccgtctat336alaileglyvalhisleuglycysthrseralacysglualavaltyr100105110aaggatggccgggctggtgtggttgcaaatgatgccggtgaccgagtt384lysaspglyargalaglyvalvalalaasnaspalaglyaspargval115120125actccagctgttgttgcttactcagaaaatgaagagattgttggattg432thrproalavalvalalatyrsergluasnglugluilevalglyleu130135140gcagcaaaacaaagtagaataagaaatatttcaaatacagtaatgaaa480alaalalysglnserargileargasnileserasnthrvalmetlys145150155160gtaaagcagatcctgggcagaagctccagtgatccacaagctcagaaa528vallysglnileleuglyargserserseraspproglnalaglnlys165170175tacatcgcggaaagtaaatgtttagtcattgaaaaaaatgggaaatta576tyrilealagluserlyscysleuvalileglulysasnglylysleu180185190cgatatgaaatagatactggagaagaaacaaaatttgttaacccagaa624argtyrgluileaspthrglyglugluthrlysphevalasnproglu195200205gatgttgccagactgatatttagtaaaatgaaagaaacggcacattct672aspvalalaargleuilepheserlysmetlysgluthralahisser210215220gtattgggctcagatgcaaatgatgtagttattactgtcccgtttgat720valleuglyseraspalaasnaspvalvalilethrvalpropheasp225230235240tttggagaaaagcaaaaaaatgctcttggagaagcagctagagctgct768pheglyglulysglnlysasnalaleuglyglualaalaargalaala245250255ggatttaatgttttgcgattaattcacgaaccgtctgcagctcttctt816glypheasnvalleuargleuilehisgluproseralaalaleuleu260265270gcttatggaattggacaagactcccctactggaaaaagcaatattttg864alatyrglyileglyglnaspserprothrglylysserasnileleu275280285gtgtttaagcttggaggaacatccttatctctcagcgtcatggaagtt912valphelysleuglyglythrserleuserleuservalmetgluval290295300aacagtggaatatatcgggttctttcaacaaacactgatgataacatc960asnserglyiletyrargvalleuserthrasnthraspaspasnile305310315320ggtggtgcacatttcacagaaaccttagcacagtatctagcttctgag1008glyglyalahisphethrgluthrleualaglntyrleualaserglu325330335ttccaaagatccttcaaacatgatgtgagaggaaatgcgcgagccatg1056pheglnargserphelyshisaspvalargglyasnalaargalamet340345350atgaaattaacgaacagtgctgaagtagcgaaacattctttgtcaacc1104metlysleuthrasnseralagluvalalalyshisserleuserthr355360365ttgggaagtgccaactgttttcttgactcattatatgaaggtcaagat1152leuglyseralaasncyspheleuaspserleutyrgluglyglnasp370375380tttgattgcaatgtgtccagagcaagatttgaacttctttgttctcca1200pheaspcysasnvalserargalaargphegluleuleucysserpro385390395400ctttttaataagtgtatagaagcaatcagaggactcttagatcaaaat1248leupheasnlyscysileglualaileargglyleuleuaspglnasn405410415ggatttacagcagatgatatcaacaaggttgtcctttgtggagggtct1296glyphethralaaspaspileasnlysvalvalleucysglyglyser420425430tctcgaatcccaaagctacagcaactgattaaagatcttttcccagct1344serargileprolysleuglnglnleuilelysaspleupheproala435440445gttgagcttctcaattctatccctcctgatgaagtgatccctattggt1392valgluleuleuasnserileproproaspgluvalileproilegly450455460gcagctatagaagcaggaattcttattgggaaagaaaacctgttggtg1440alaalaileglualaglyileleuileglylysgluasnleuleuval465470475480gaagactctcttatgatagagtgttcagccagagatattttagttaag1488gluaspserleumetileglucysseralaargaspileleuvallys485490495ggtgtggacgaatcaggagccagtagattcacagtgctgtttccatca1536glyvalaspgluserglyalaserargphethrvalleupheproser500505510gggactcctttgccagctcgaagacaacacacattgcaagcccctgga1584glythrproleuproalaargargglnhisthrleuglnalaprogly515520525agcatatcttcagtgtgccttgaactctatgagtctgatgggaagaac1632serileserservalcysleugluleutyrgluseraspglylysasn530535540tctgccaaagaggaaaccaagtttgcacaggttgtactccaggattta1680seralalysglugluthrlysphealaglnvalvalleuglnaspleu545550555560gataaaaaagaaaatggattacgtgatatattagctgttcttactatg1728asplyslysgluasnglyleuargaspileleualavalleuthrmet565570575aaaagggatggatctttacatgtgacatgcacagatcaagaaactgga1776lysargaspglyserleuhisvalthrcysthraspglngluthrgly580585590aaatgtgaagcaatctctattgagatagcatcttaa1812lyscysglualaileserilegluilealaser5956002603prt人工序列2valseralaasnargseraspprovalthrleuaspvalleutyrgly151015proaspthrproileileserproproaspsersertyrleusergly202530alaasnleuasnleusercyshisseralaserasnproserprogln354045tyrsertrpargileasnglyileproglnglnhisthrglnvalleu505560pheilealalysilethrproasnasnasnglythrtyralacysphe65707580valserasnleualathrglyargasnasnserilevalvalaspala859095alaileglyvalhisleuglycysthrseralacysglualavaltyr100105110lysaspglyargalaglyvalvalalaasnaspalaglyaspargval115120125thrproalavalvalalatyrsergluasnglugluilevalglyleu130135140alaalalysglnserargileargasnileserasnthrvalmetlys145150155160vallysglnileleuglyargserserseraspproglnalaglnlys165170175tyrilealagluserlyscysleuvalileglulysasnglylysleu180185190argtyrgluileaspthrglyglugluthrlysphevalasnproglu195200205aspvalalaargleuilepheserlysmetlysgluthralahisser210215220valleuglyseraspalaasnaspvalvalilethrvalpropheasp225230235240pheglyglulysglnlysasnalaleuglyglualaalaargalaala2452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