一種麴黴菌定量檢測螢光pcr試劑盒的製作方法

2023-07-12 00:53:31

一種麴黴菌定量檢測螢光pcr試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒，包括陽性工作標準品、陰性工作標準品、檢測反應液、紅細胞裂解液、稀釋液及DNA聚合酶，在陽性工作標準品、陰性工作標準品及檢測反應液中均含有特異性引物與特異性探針，所述特異性引物正向序列為SQ1或其互補鏈，反向序列為SQ2或其互補鏈，特異性探針序列為SQ3或其互補鏈。本發明定量準確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，結果直觀，檢測速度快，能直接檢測PCR過程中的變化，與普通PCR相比，其結果可實時觀察，產物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了汙染。
【專利說明】—種麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒

【技術領域】
[0001]本發明屬於體外核酸診斷試劑【技術領域】，特別是一種麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒。

【背景技術】
[0002]麴黴菌是一種典型的絲狀菌，在環境中廣泛存在，主要通過呼吸道吸入黴菌孢子進入人體，首先侵入感染肺部進而引發肺麴黴菌病。在血液系統疾病、肺結核、慢性支氣管炎、支氣管擴張、肺癌等免疫抑制患者中麴黴已成為僅次於白念珠菌的重要致病真菌。麴黴菌感染已成為最常見的、傳播最廣的條件致病菌之一，但早期診斷困難，常常導致治療時機延誤，病死率高達30%~50%。傳統的真菌分離、培養和組織病理鑑定等診斷方法敏感性低、陽性率低。早期、快速、簡便、敏感、特異的診斷方法是目前條件性麴黴菌感染實驗診斷研究領域的熱點。
[0003]螢光PCR技術在1995年由美國PE公司率先研製成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，結果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結果可實時觀察，產物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了汙染。
[0004]麴黴菌感染中最常見的是煙麴黴感染，但目前國內並沒有檢測煙麴黴的螢光PCR產品，更沒有檢測更大範圍的多種麴黴菌螢光PCR檢測產品。


【發明內容】

[0005]本發明的目的是針對現有技術的不足，而提出一種麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒。
[0006]本發明解決其技術問題是採取以下技術方案實現的:
[0007]一種麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒，包括陽性工作標準品、陰性工作標準品、檢測反應液、紅細胞裂解液、稀釋液、DNA聚合酶，其特徵在於:在陽性工作標準品、陰性工作標準品及檢測反應液中均含有特異性引物與特異性探針，所述特異性引物及特異性探針的DNA序列分別為:
[0008]特異性引物正向序列SQl:5』 -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3』或其互補鏈；
[0009]特異性引物反向序列SQ2:5』 -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3』或其互補鏈；
[0010]特異性探針序列SQ3:5』 -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3』 或其互補鏈。
[0011]而且，所述特異性引物與特異性探針根據麴黴菌ITS序列特性設計，針對麴黴菌ITS序列設計的引物和探針用於檢測麴黴菌。
[0012]而且，在所述陽性工作標準品中含有插入煙麴黴特異DNA序列SQ4的pGM_T載體質粒，所插入序列SQ4如下:
[0013]SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc。
[0014]而且，所述陽性工作標準品含有重組質粒的濃度為1.0X 13~1.0X 107。
[0015]本發明的優點和積極效果是:
[0016]1、本發明定量準確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，結果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化，與普通PCR相比，其結果可實時觀察，產物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了汙染。
[0017]2、本發明靈敏度和特異性高，由於採取特異性引物和探針的雙保險設計，靈敏度和特異性均有很大提高，能在臨床症狀出現之前檢測到麴黴的感染。
[0018]3、本發明檢測速度快，加上樣本處理總共僅需2個小時，步驟簡單，可同時進行高通量樣本檢測。
[0019]4、根據多種麴黴菌ITS序列特性設計的引物和探針可以檢出多種麴黴菌。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為麴黴菌陽性反應液的螢光PCR擴增曲線和陰性反應液螢光PCR擴增曲線；
[0021]圖2為麴黴菌臨床樣本的螢光PCR擴增曲線。

【具體實施方式】
[0022]以下結合附圖對本發明實施做進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護範圍。
[0023]一種麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒，包括陽性工作標準品、陰性工作標準品、檢測反應液、紅細胞裂解液、稀釋液、DNA聚合酶，本發明的創新點是，在陽性工作標準品、陰性工作標準品及檢測反應液中均含有特異性引物與特異性探針，所述特異性引物與特異性探針根據麴黴菌ITS序列特性設計，針對麴黴菌ITS序列設計的引物和探針用於檢測麴黴菌。
[0024]其中，所述異性引物及特異性探針的DNA序列分別為:
[0025]特異性引物正向序列SQl:5』 -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3』或其互補鏈；
[0026]特異性引物反向序列SQ2:5』 -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3』或其互補鏈；
[0027]特異性探針序列SQ3:5』 -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3』 或其互補鏈。
[0028]在本發明的具體實施中，在所述陽性工作標準品中含有插入煙麴黴特異DNA序列SQ4的pGM-T載體質粒，所插入序列SQ4如下:
[0029]SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc,
[0030]在本發明的具體實施中，所述陽性工作標準品含有重組質粒的濃度為1.0X 13~1.0XlO7O
[0031]應當理解，下面實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規採用方法:如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照製造廠商所建議的步驟和條件。
[0032]實例:試劑盒的製備
[0033](I)引物和探針設計與合成
[0034]本實施例根據多種麴黴菌ITS序列的特性設計引物和探針，正向引物 5』 -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3』，反向引物 5』 -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3』，探針5』 -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3』，其數據均來源於GenBank中的核糖體ITS序列，引物和探針由Iifetechnologies公司合成。
[0035](2)麴黴陽性模版的製備
[0036]本實例中含有麴黴核酸序列質粒作為陽性模版用於製備陽性工作標準品。
[0037]使用引物:5』 -GAAGGATCATTACCGAGTGAGGG-3 』 和引物:5』 -GGCCTACAGAGCAGGTGACAAAG-3』擴增煙麴黴基因靶序列，將經過純化的PCR產物連接到PGM-T載體上；然後轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，經過篩選構建好的重組質粒作為陽性標準品，將構建的重組質粒經雙向DNA測序鑑定，提取質粒，紫外分光光度計定量，並保存於-20。。。
[0038] (3)陽性工作標準品與陰性工作標準品的製備
[0039]分別將103、104、105、106、107拷貝的陽性標準品加入到陽性反應液中配製成陽性工作標準品，將沒有重組的17拷貝的PGM-T質粒加入到陰性反應液中配製成陰性標準工作品O
[0040](4)螢光PCR反應液組成
[0041]

【權利要求】
1.一種麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒，包括陽性工作標準品、陰性工作標準品、檢測反應液、紅細胞裂解液、稀釋液及DNA聚合酶，其特徵在於:在陽性工作標準品、陰性工作標準品及檢測反應液中均含有特異性引物與特異性探針，所述特異性引物及特異性探針的DNA序列分別為: 特異性引物正向序列SQl:5』 -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3』或其互補鏈； 特異性引物反向序列SQ2:5』 -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3』或其互補鏈； 特異性探針序列SQ3:5』 -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3』或其互補鏈。
2.根據權利要求1所述的麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒，其特徵在於:所述特異性引物與特異性探針根據麴黴菌ITS序列特性設計，針對麴黴菌ITS序列設計的引物和探針用於檢測麴黴菌。
3.根據權利要求1所述的麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒，其特徵在於:在所述陽性工作標準品中含有插入煙麴黴特異DNA序列SQ4的pGM-T載體質粒，所插入序列SQ4如下:
SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc0
4.根據權利要求1或3所述的麴黴菌定量檢測螢光PCR試劑盒，其特徵在於:所述陽性工作標準品含有重組質粒的濃度為1.0X 13~1.0X 107。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164511SQ201410420833
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月25日 優先權日:2014年8月25日
【發明者】何永勝, 楊希寅, 李可可, 藏丹戎, 辛鶴林, 苑慶華 申請人:天津喜諾生物醫藥有限公司