一種耐鹽鹼基因去除標記重組質粒載體的製作方法

2023-07-12 14:01:01

專利名稱：一種耐鹽鹼基因去除標記重組質粒載體的製作方法
技術領域：
本發明構建了一種安全的植物抗逆表達載體，並實現含有目的基因(SKCl)的該 載體在植物中的耐鹽性表達。本發明屬於植物轉基因技術領域。
背景技術：
自從1983年世界上誕生第一例轉基因植株以來，轉基因作物的安全性曾經在全 球範圍引起很大爭議，一個主要的原因足在轉基因操作過程中的初期，為了篩選轉基因細 胞，用於植物表達的載體往往含有抗生素基因和除草劑基因，而當篩選得到目的細胞後，抗 生素基因就沒有用途了，但它在轉基因材料中的存在會特來環境和食品上的安全隱患。因 此，近些年來植物轉基因研究的熱點之一就是實現安全性標記，其中位點特異性重組系統 研究得最多也最深入，Cre/Loxp系統是這類之一。Cre/loxp位點特異性重組系統是Steinberg等首先在大腸桿菌噬菌體pi中發現 的，由Cre重組酶和Ioxp位點兩部分組成。Cre重組酶是噬菌體pi編碼的分子量為38. 5kD 蛋白質，由1029個核營酸序列編碼，能識別並催化Ioxp位點的分子內(切除、倒位)和分 子間(易位)的特異性重組。在研究Cre重組酶的結構與功能過程中，Guo等發現該酶由摺疊成較小的N —末 端和較大的C 一末端兩個結構域組成，結構域間通過一個較短的分隔區相連。兩個結構域 在結合位點周圍形成「夾子」結構，以和DNA分子的大小溝部位充分接觸。N —末端和序列 的識別有關，由第20-120個胺基酸組成，包含5個a-螺旋(A，B，C，D，E)。其中螺旋C，D，E 形成反平行束，A，B螺旋垂直於3個反向平行束。螺旋B，D與DNA的大溝相連，螺旋A，E與 Cre重組酶四聚體的形成有關。C 一末端和DNA的結合及DNA鏈的切割有關，由第132-341 胺基酸組成，包含9個a-螺旋(F，G，H，I，J，K，L，M，N)，螺旋間有2個小的β —摺疊片結 構。C末端和DNA的接觸面複雜，大部分的螺旋和連接環均與DNA分子的大小溝及主鏈部位 相互作用。M和L形成一個疏水區，是Cre重組酶的主要活性中心。螺旋N遠離其他螺旋， 有助於Cre亞基間相互接觸。在重組反應中，與2個Ioxp位點結合的不同Cre亞基N —端 結構相似，而分子間C 一末端構象有很明顯的差異，這說明不同Cre亞基在重組過程中所起 的作用不同。Ioxp位點是Cre重組酶介導重組反應時的識別位點，長34bp，包括8bp的間隔序 列及兩個13bp的反向重複序列。8bp間隔序列是Ioxp位點中唯一的不對稱部位，其中8bp 的不對稱間隔區是一段重要的核營酸序列，重組過程中DNA鏈中DNA的切割和連接均在此 部位進行。8bp的間隔區從功能上可分為以下3個部分6，7位是第一次鏈的交換和連接所 必需的；2，5位的4個鹼基是第二次鏈的交換所必需的；1，8位的鹼基改變後，如果與野生 型Ioxp位點組合，不會影響重組反應的效率；如果2個Ioxp位點均為突變型，重組效率將 大大降。Cre重組酶與Loxp位點的反應機制已做了非常深入的研究，其作用機制是一個識 別、切割、重組、連接、分離的過程，重組反應是在DNA的兩個Ioxp位點間，過程中沒有DNA
3的合成和丟失，既可以發生在體內、體外的細胞中，也可以在無細胞體系進行。發生反應時 每分子的Cre重組酶結合一個Ioxp位點的反向重複區，即4個Cre重組酶與2個Ioxp位 點結合，形成一個聯會複合體結構，其中2個Cre重組酶分子具有重組活性，另外2個沒有 重組活性。Cre重組酶先和DNA結合，但開始結合力較弱，當遇到Ioxp位點時結合力大大增 強，當有2個Ioxp時結力更強。然後C末端保守的酪氨酸(Tyr-324)與DNA分子的3』_P04 結合形成3』 一磷酸酪氨酸，導致DNA鏈的切割；切割後產生的5' -OH既可與同一斷裂部 位的3』_P04結合恢復為原來的構型，也可與另一切割部位的3』_P04結合發生鏈的交換，形 成一個「Holliday結構」的中間產物；繼而產生結構的異構化，這時第一次切割的2個Cre 酶不再起切割作用，而是由另外2個Cre酶進行第二次鏈的切割和交換，去掉中間產物發生 重組，這樣便完成了基因的插入或刪除。Ioxp位點的8bp非對稱間隔區決定了重組反應的模式，位點特異性重組酶系統根 居識別位點方向和位置的不同，能夠產生3種效應，分別為①當一對反向識別位點位於目的基因的兩端時，在對應重組酶的作用下，識別位 點間的所有基因將發生倒置，即倒位(Inversion)。②當一對同向識別位點位於目的基因的兩端時，其相應的重組酶將刪除識別位點 之間的所有外源基因和一個識別位點，最後在基因組中只留下一個識別位點，這就是重組 (Recombination) 0③如果識別位點分別位於細胞中不同的染色體上，那麼在對應重組酶的作用下， 兩條染色體可以在識別位點的位置發生染色體片段的互換，產生雜合的染色體，這種作用 就叫作位置互換(Translocation)。

發明內容
本發明公開一種安全的植物抗逆表達載體，目的是為培育環境安全、抗逆性優良 的轉基因植物提供一種有效的表達載體。用該載體轉化植物，可以有效剔除選擇標記，篩選 獲得耐鹽鹼轉基因植物。本發明的安全性植物抗逆表達載體，其特徵是用SKCl及35S啟動子替換了基礎載體PX6-GFP的GFP序列而構建成的，這個 基因位於載體T-DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間，它含有的XVE雜合蛋白與誘導物 17- β -雌二醇結合後可啟動重組酶CRE的表達，從而剔除選擇標記，啟動子為人工啟動子 G10-35S，目的基因是耐鹽性基因SKCl。本載體中的啟動子是35S，這個啟動子克隆於ΡΒΙ121。本發明的安全性耐鹽鹼植物表達載體轉化大腸桿菌DH5 α，獲得含有該載體的大 腸桿菌轉化子。本發明的安全性耐鹽鹼植物表達載體轉化農桿菌ΕΗΑ105，獲得含有該載體的農杆 菌轉化子，利用該轉化子，可以獲得環境安全耐鹽鹼的轉基因植物。實驗證明，本發明的載體轉化率較高；並且本發明獲得的轉基因玉米具有較好的 耐鹽鹼特性。
具體實施例方式為了便於理解本發明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發明的闡釋而 非對本發明的任何形式的限制。實施例1 安全性植物抗逆表達載體PX6-35S-SKC1的構建首先將質粒PX6-GFP中的GFP替換成啟動子35S(啟動子片段來源於PBI121 其 構建過程是PCR法擴增出PBI121中的35S的核苷酸序列，連接入PX6-GFP載體得到的。) 用SpeI、XhoI雙酶切除PX6-GFP的GFP啟動子，在切除的GFP位置連接入35S啟動子，獲得 中間載體PX6-35S。用SpeI單酶切載體PSK-SKCl，獲得兩端帶有SpeI酶切位點的SKCl基因。再用SpeI單酶切中間載體PX6-35S。載體構建的最後一步將兩個反應連接。表1. 1、表1. 2和表1. 3是上述實驗涉及到的酶切反應體系，電泳條件和連接反應 體系。表1. 1 HindIII和KpnI雙酶切反應和電泳體系 37°C 反應過夜，然後用 1XTAE(0. 04mol/L Tris-乙酸，0. OOlmol/LEDTA)配製 0. 8%瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖凝膠內加入EB (溴化乙錠)至終濃度為0. 5 μ g/ml，在5V/cm的 電壓下電泳。表1. 2連接反應體系 16°C反應1小時。表1.3 SpeI單酶切反應和電泳體系 37°C 反應過夜，然後用 1XTAE(0. 04mol/L Tris-乙酸，0. OOlmol/LEDTA)配製 0. 8%瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖凝膠內加入EB (溴化乙錠)至終濃度為0. 5 μ g/ml，在5V/cm的 電壓下電泳。實施例2 含PX6-35S-SKC1的大腸桿菌轉化子的獲得
大腸桿菌DH5ci感受態細胞的製備取存於_70°C的菌種在LB(配製方法見表 2. 1)平板上劃線活化，37°C培養12-16小時；挑取單菌落在5ml LB培養基中，37°C 200rpm 振蕩培養過夜；取200 μ 1培養過夜的菌液加入到20ml LB培養基中，37°C 200rpm振蕩培 養3-4小時，至0D_值在0. 3-0. 4之間，將菌液分裝於1. 5ml離心管中，冰浴10分鐘，4°C 4000rpm(約1600g)離心10分鐘；棄上清，用Iml冰預冷的0. IMCaCl2溶液重懸，冰浴30分 鍾，4°C 4000rpm離心10分鐘，重複此步驟一次；棄上清，用100 μ 1冰預冷的0. IM CaCl2和 100 μ 1甘油重懸菌體，即得到感受態細胞。感受態細胞可立即凍存於-70備用。0. IM CaCl2 和甘油使用前均經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘。取實施例1中的連接產物(含有目的基因SKC1) 10 μ 1加入到感受態細胞DH5 α 懸液中，冰浴30分鐘，之後42°C熱激90秒，然後迅速插入冰中，並於2-4分鐘，隨後加入 800 μ 1的LB培養基，37°C 200rpm振蕩培養1. 5-2. 0小時。4000rpm離心5分鐘，倒出上清， 用剩餘的上清重懸菌體，均勻塗布在含50 μ g/ml kanamycin的LB平板上37°C培養過夜。 挑取長出的菌落2-3個，接種於5ml LB培養液中(含50 μ g/mlkanamycin)，37°C 200rpm振 蕩培養過夜，用鹼裂解法小量製備質粒，經PCR和酶切檢測後，挑出陽性克隆，其所對應菌 落即為轉化子，保存於-70°C。表2. ILB液體培養基的成分 溶解後pH值用NaOH調到為7. 0。若為固體培養基，則加入1. 5%的瓊脂粉。實施例3 含載體PX6-35S-SKC1的農桿菌轉化子的獲得農桿菌EHA105感受態細胞的製備取保存於_70°C的EHA105菌種在含50 μ g/ml rifampicin的LB (配製方法見表2. 1)平板上劃線活化，28°C培養36-48小時；挑取單菌落 在5ml含50 μ g/ml的rifampicin的LB培養基中，於28°C在200rpm條件下振蕩培養24小 時。按1 100大比例將菌液轉接到新的培養基中，於28°C在200rpm條件下振蕩培養6-7 小時，至OD6c 值為0.6。收集菌液分裝於1.5mL離心管中，然後13000rpm離心30s，棄上 清。用800 μ 1的250mM的CaCl2重懸菌體沉澱，13000rpm離心30s，棄上清。用100 μ 1的 250m的CaCl2溶液重懸沉澱，冰上放置4小時，即為感受態細胞，保存於_70°C備用。250mM 的CaCl2溶液使用前經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘。取實施例2中含PX6-35S-SKC1的大腸桿菌轉化子提取的質粒 (PX6-35S-SKCl)6y 1於100 μ 1體積的農桿菌ΕΗΑ105感受態細胞懸液中，立即於冰上放置 30min,然後從冰上取出迅速浸入液氮中5min，再37°C水浴5min。最後加入800 μ 1體積的 LB液體培養基，28°C溫育3-5小時後，4000rm離心5分鐘，倒出上清，用剩餘的上清重懸菌 體，均勻塗布在含50 μ g/ml的kanamycin、50 μ g/ml的rifampicin的LB平板上28°C培養 36-48小時。挑取長出的菌落2-3個作PCR檢測，陽性菌落即為轉化子，保存於-70°C。實施例4 利用含PX6-35S-SKC1的農桿菌獲得轉基因玉米
a.外植體準備已經獲得的玉米胚性愈傷組織(自交係為H99和JYQ22)。b.菌液準備。將帶有PX6-35S-SKC1的EHA105農桿菌分別塗在含有50 μ g/ml的 kanamycin、50y g/ml的rifampicin, pH7. 0的YEB (見表4. 2)平板上活化，挑取單菌落，用 YEB液體培養基培養至0D_值在0. 6-1. 0之間，收集菌體，用MSZ液體培養基重懸至0D_ 值為1. 0，溫育4小時左右備用。c.轉化、共培養。將胚性愈傷組織在上述菌液中浸泡30min，吸乾菌液轉入培養基 I中共培養3天。d.抑菌、篩選。共培養後經過含有頭孢黴素(400mg/L)溶液的洗滌、去菌，轉入篩 選培養基II中，連續繼代兩次(約7天一次)。待農桿菌被抑制住之後(約3周)存活的 愈傷組織轉到恢復培養基III中，繼代1-2次後將愈傷組織移到再生培養基IV中，繼代2 次後，待綠苗約2-3cm時將綠苗轉到含有β -雌二醇的生根培養基V中，綠苗在培養基V中 生根且β-雌二醇誘導去除卡那黴素標記基因。e.根系發育完好後移栽到溫室。上述玉米轉化所需的培養基見表4. 1。表4. 1玉米轉化所需的培養基(pH6. 0)
7 表4. 2 YEB培養基的成分 滅菌後加IOOmM MgSO4至終濃度為2mM ； IOOmM MgSO4溶液，高溫滅菌後用。實施例5 轉基因植株的分子檢測用CTAB法提取轉基因植株的基因組DNA，以此DNA作為PCR檢測的模板，設計引物 對SKCl是否轉入玉米進行檢測。PCR引物為上遊引物5『 -ATGAGTTCTCTGGATGCCACT-3 『下遊引物5『 -TTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3 『PCR程序為首先94°C變性2min ；然後30個循環循環步驟為94°C變性30s，56°C 退火45s，72°C延伸90s ；最後72°C補充延伸IOmin0PCR檢測結果表明目的基因已經轉入玉米中。Kan標記基因的PCR檢測引物為5' CTCTGATGCCGCCGTGTT 3'5' CCCTGATGCTCTTCGTCCA 3'PCR反應程序為首先94°C變性5min ；然後30個循環循環步驟為94°C變性lm， 55°C退火lm，72°C延伸lm30s ；最後72°C補充延伸IOmin0 PCR檢測結果表明部分Kan標
記基因已經去除。實施例6 利用PX6-35S-SKC1獲得的轉基因玉米的耐鹽鹼性後代轉基因植株在花盆中經過耐鹽鹼性試驗，表現出比對照較好的耐鹽鹼性。
權利要求
一種耐鹽鹼基因去除標記重組質粒載體，其特徵是用SKC1及35S啟動子替換了基礎載體PX6 GFP的GFP序列而構建成的，這個基因位於載體T DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間，它含有的XVE雜合蛋白與誘導物17 β 雌二醇結合後可啟動重組酶CRE的表達，從而剔除選擇標記，啟動子為人工啟動子G10 35S，目的基因是耐鹽性基因SKC1。
2.根據權利要求1所述的質粒載體，其特徵是載體中的啟動子是35S，這個啟動子克 隆於 ΡΒΙ121。
全文摘要
一種耐鹽鹼基因去除標記重組質粒載體，屬於植物轉基因技術領域，是用SKC1及35S啟動子替換了基礎載體PX6-GFP的GFP序列而構建成的，這個基因位於載體T-DNA左邊界LB和右邊界RB序列之間，它含有的XVE雜合蛋白與誘導物17-β-雌二醇結合後可啟動重組酶CRF的表達，從而剔除選擇標記，啟動子為人工啟動子G10-35S，目的基因是耐鹽性基因SKC1。本發明的載體轉化率較高；並且本發明獲得的轉基因玉米具有較好的耐鹽鹼特性。
文檔編號C12N15/82GK101921803SQ201010132540
公開日2010年12月22日 申請日期2010年3月26日 優先權日2010年3月26日
發明者於志晶, 李淑芳, 林秀峰, 馬瑞 申請人:吉林省農業科學院