右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測定方法
2023-07-11 23:31:26 1
右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測定方法
【專利摘要】本發明涉及「右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測定方法」，包括固相萃取及液相檢測兩個步驟，在液相分析前對注射液進行了預處理，採用Waters?Oasis?HLB固相萃取小柱對糠醛進行富集吸附，並將右旋糖酐40去除，收集到液相樣品；同時液相檢測中採用梯度洗脫的方式，流動相A：甲醇，流動相B：0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液，用磷酸調節pH為3.0，延長了色譜柱的使用壽命。本發明方法靈敏度高，能同時檢測出右旋糖酐40注射液中的5-羥甲基糠醛和2-糠醛，注射液中2-糠醛的最低檢出濃度為0.00015μg/mL；重複性好，一批6份注射液測定結果，其含量平均值為0.0889μg/mL，RSD為0.6%；精密度RSD為0.4%，加樣回收率平均為93.1%，RSD為0.9%。
【專利說明】右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種藥物微量雜質成分的HPLC的檢測方法，特別是涉及右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測定方法。
【背景技術】
[0002]右旋糖酐系蔗糖經腸膜狀明串珠菌L.M-1226號菌(Leuconostocmesenteroides)發酵後生成的高分子葡萄糖聚合物，經處理精製而得，其分子式為(C6H1(l05)n。右旋糖酐按照分子量不同分為聞分子(10?20萬)、中分子量(6萬?8萬)、低分子量(2?4萬)和小分子量(I?2萬)右旋糖酐。右旋糖酐40的重均分子量(Mw)為32000?42000，屬於低分子右旋糖酐。國內於1952年研製成功，1957年開始應用於臨床。右旋糖酐40主要用於增加血漿容量，維持血壓，以抗休克為主。廣泛應用於各種休克、血栓性疾病、肢體再植和血管外科手術等。右旋糖酐能提高血漿膠體滲透壓，吸收血管外的水分而補充血容量，維持血壓；使已經聚集的紅細胞和血小板解聚，降低血液黏滯性，從而改善微循環，防止休克後期的血管內凝血；抑制凝血因子II的激活，使凝血因子I和VDI活性降低以及其抗血小板作用均可阻止血栓形成。此外，還具滲透性利尿作用(黃勳，陳槐卿，王玲等.右旋糖酐40，70對紅細胞與內皮細胞粘附的影響[J].生物醫學工程學雜誌，1998，15(3):240 ?242.)。
[0003]可能是由於蔗糖經腸膜狀明串珠菌L.-M-1226號菌發酵後生成的右旋糖酐分子量較大，大分子右旋糖酐作為血漿代用品安全性較差，須用稀酸水解以獲得較低分子量的藥用右旋糖酐，但是水解的同時，也會使部分右旋糖酐分解成低聚糖，經異麥芽三糖、異麥芽二糖，生成葡萄糖(李豔，陳學武，牟德華.右旋糖酐的生產及應用.山西食品工業[J]，1998.3:36-37.)。己糖(葡萄糖、果糖等單糖)與胺基酸在高溫、酸性條件或微生物的作用下脫水發生美拉德(Maillard)反應生成5-羥甲基糠醛及糠醛(楊朝霞，李梅，董建軍等.高效液相色譜同時測定啤酒中的5-羥甲基糠醛和糠醛[J].釀酒科技，2006，9:88-89.)。《中國藥典》2010年版二部中只採用紫外法對右旋糖酐40葡萄糖注射液中的5-羥甲基糠醛(以下簡稱5-HMT)進行了限度檢查，而對右旋糖酐40氯化鈉注射液未做控制。「HPLC法檢查右旋糖酐40氯化鈉注射液中5-羥甲基糠醛的限量」，建立了用HPLC法測定右旋糖酐40氯化鈉注射液中5-HMT含量的方法，其結果在各批右旋糖酐40氯化鈉注射液中均檢測出了 5-HMT，因此有必要對其進行質量控制。但是在現有的文獻中均沒有報導右旋糖酐40氯化鈉注射液或葡萄糖注射液中有過檢測出糠醛的報導。
[0004]糠醛為有機化合物，是呋喃2位上的氫原子被醛基取代的衍生物，分子式C5H402，又稱2-呋喃甲醛。糠醛屬中等毒性類物質，其蒸氣具有強烈的刺激性，並有麻醉作用。動物吸入、攝入或經皮膚吸收均可引起急性中毒，表現有呼吸道刺激、肺水腫、肝損害、中樞神經系統損害、呼吸中樞麻痺，以致死亡。其急性毒性=LD5tl為65mg/kg(大鼠經口)，最小致死劑量500mg/kg (人經口)，亞急性和慢性毒性:人吸入7.4?52.7mg/m3X3個月，發生黏膜刺激、結膜炎、流淚、頭痛。此外糠醛是染色體斷裂劑，具有誘發鹼基對置換的突變作用，具有誘發精子畸形和精母細胞姊妹染色單體交換的遺傳毒性作用，具有誘發腦室擴張的致畸作用等較大的潛在遺傳及生殖毒性(牛鳳雲，王金山，王建剛，魏豔萍.糠醛對大鼠致畸效應的研究，1992，6 (4):290;陳衛平，王金山，宋霖.糠醛誘發小鼠精子畸形的實驗研究.衛生毒理學雜誌，1994,8(2): 129)。因此，美國政府工業衛生專家學會(ACGIH)在1981年即通過了 2ppm的閾限值(TLV-TWA)的規定。
[0005]從現有文獻報導來看，對於右旋糖酐40氯化鈉注射液或葡萄糖注射液中糠醛的存在是有可能的，即使其含量非常的低，為保證用藥安全，對於糠醛檢測及限量是必須的。
[0006]按照「HPLC法檢查右旋糖酐40氯化鈉注射液中5_羥甲基糠醛的限量」建立的HPLC法測定右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛，由於2-糠醛與5-羥甲基糠醛的結構有差異，而且2-糠醛的含量很低，上述檢測方法要同時檢測出兩種雜質難度較大。前期研究結果表明，採用液相色譜進行測定時，液相色譜對糠醛的最低檢出限為0.003μ g/mL，即注射液中2-糠醛可檢出的最低濃度為0.003 μ g/mL，糠醛在其氯化鈉注射液中含量較低，約為0.008?0.17μ g/mL，最低含量接近於最低檢出濃度，不便於準確檢測。此外，由於該樣品中右旋糖酐40的濃度較高，採用文獻中流動相等度洗脫方式進行洗脫，將會使右旋糖酐40殘留在色譜柱柱頭，影響色譜柱的壽命。因此採用檢測5-羥甲基糠醛的條件及方法，還不能檢測出右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的存在。
【發明內容】
[0007]針對上述領域中的不足，本發明提供一種右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測定方法，通過優化的液相檢測條件，檢測出右旋糖酐40氯化鈉注射液中確有2-糠醛存在，該HPLC檢測方法重複性好，且採用梯度洗脫方法，右旋糖酐40的殘留少，對色譜柱的使用壽命影響較小。
[0008]一種右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測定方法，包括固相萃取及液相檢測兩個步驟，其特徵在於:所述固相萃取為採用經活化後的固相萃取小柱，量取右旋糖酐40氯化鈉注射液上柱，用水洗滌，去除右旋糖酐及氯化鈉，再加甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，真空離心揮幹，用甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液(用磷酸調節pH為3.0) (50:50)溶解，0.45 μ m微孔濾膜濾過，作為液相檢測的供試品溶液；所述液相檢測中的洗脫程序採用梯度洗脫，所述流動相A:甲醇，流動相B:0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液(用磷酸調節pH為3.0)，O?3.0Omin採用100%的水相，迅速去除樣品中殘留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin採用A-B體積比為30:70的混合流動相，18.10?21.0Omin採用A-B體積比為50:50的混合流動相，21.10?28.0Omin採用100%的水相平衡色譜柱。
[0009]所述固相萃取小柱為Waters Oasis HLB固相萃取小柱。
[0010]所述固相萃取中，用水洗滌至少三次。
[0011 ] 所述液相檢測中的色譜柱為MACHEREY-NAGEL C18 (250 X 4.6mm, 5 μ m)，檢測波長:275nm。
[0012]所述洗脫過程中，柱溫為40°C，流動相流速:1.0mL/min。
[0013]由於右旋糖酐40氯化鈉注射液中糠醛濃度太低，不便於檢測，因此本發明在進行液相檢測前，進行了預處理，使用固相萃取法將注射液中氯化鈉和右旋糖酐去除，同時將糠醛富集吸附，提高其檢測濃度。右旋糖酐40氯化鈉注射液中右旋糖酐濃度為6%，氯化鈉濃度為0.9%，使用固相萃取小柱萃取過程中，需用水洗脫3次，每次3mL，用以去除右旋糖酐及氯化鈉，然後用甲醇洗脫糠醛，收集甲醇洗脫液，揮幹甲醇，加流動相甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液(用磷酸調節PH為3.0) (50:50)溶解，用於液相分析。由於右旋糖酐40易於在色譜柱的柱頭殘留，從而影響色譜柱的使用壽命，本發明採用了梯度洗脫的方式，O?3.0Omin採用100%的水相，柱溫40°C，迅速去除樣品中殘留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin採用甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液(用磷酸調節pH為3.0) (30:70)對樣品中的糠醛進行分析測定；18.10?21.0Omin採用甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液(用磷酸調節pH為3.0) (50:50)，增加流動相中有機相的比例，洗脫樣品中的極性較弱的雜質；21.10?28.0Omin採用100%的水相平衡色譜柱。
[0014]本發明方法在採用液相分析前對樣品溶液進行了預處理,採用Waters Oasis HLB固相萃取小柱對糠醛進行富集吸附，並將右旋糖酐40去除，收集到液相樣品溶液；同時液相檢測中採用梯度洗脫的方式，去除殘留，延長了色譜柱的使用壽命。採用本發明的方法，能同時檢測出右旋糖酐40注射液中的5-羥甲基糠醛和2-糠醛，對於該注射劑安全性評價有重要依據。本發明方法靈敏度高，注射液中2-糠醛的最低檢出量為0.00015μ g/mL，特別適用於注射液中2-糠醛含量較低樣品的檢測，測定結果更準確；重複性好，一批6份注射液測定結果，其含量平均值為0.0889 μ g/mL, RSD為0.6% ;精密度RSD為0.4%，加樣回收率平均為 93.1%，RSD 為 0.9%ο
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1空白色譜圖，
[0016]圖22-糠醛對照品色譜圖，
[0017]其中峰I為2-糠醛，
[0018]圖3右旋糖酐40氯化鈉注射液色譜圖，
[0019]其中峰I為5-羥甲基糠醛，峰2為2-糠醛
[0020]圖4右旋糖酐40氯化鈉注射液色譜圖，
[0021]其中峰I為5-羥甲基糠醛，峰2為2-糠醛。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明。
[0023]實施例1
[0024]1.儀器與試藥
[0025]儀器:Waters Alliance HT系統；檢測器:Waters2487紫外檢測器。
[0026]固相萃取柱:0asis HLB, 60mg, 3cc,使用時依次加入3mL水、3mL甲醇和3mL水活化。
[0027]試藥:糠醛為分析純，甲醇為色譜純，水為高純水。
[0028]2.方法與結果
[0029]2.1色譜條件:Waters Alliance HT系統；檢測器:Waters2487紫外檢測器；色譜柱:MACHEREY-NAGEL C18 (250 X 4.6mm, 5 μ m);洗脫程序採用梯度洗脫，流動相A:甲醇，流動相B:0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液(用磷酸調節pH為3.0);梯度洗脫程序見表I。柱溫:40 0C ;流速:1.0mL/min ;檢測波長:275nm ;進樣量 20 μ L。
[0030]表1注射液梯度洗脫程序
[0031]
【權利要求】
1.一種右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測定方法，包括固相萃取及液相檢測兩個步驟，其特徵在於:所述固相萃取為採用經活化後的固相萃取小柱，量取右旋糖酐40氯化鈉注射液上柱，用水洗滌，去除右旋糖酐及氯化鈉，再加甲醇洗脫，收集洗脫液，揮幹甲醇，用混合溶劑溶解，0.45 μ m微孔濾膜濾過，作為液相檢測的製劑供試品溶液；所述液相檢測中的洗脫程序採用梯度洗脫，所述流動相A:甲醇，流動相B:0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液，用磷酸調節pH為3.0，0?3.0Omin採用100%的水相，迅速去除樣品中殘留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin採用A-B體積比為30:70的混合流動相，18.10?21.0Omin採用A-B體積比為50:50的混合流動相，21.10?28.0Omin採用100%的水相平衡色譜柱，所述混合溶劑為甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液，用磷酸調節pH為3.0，甲醇與0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝液的體積比為50:50。
2.根據權利要求1所述測定方法，所述固相萃取小柱為WatersOasis HLB固相萃取小柱。
3.根據權利要求1所述的測定方法，所述固相萃取中，用水洗滌至少三次。
4.根據權利要求1所述的測定方法，所述液相檢測中的色譜柱為MACHEREY-NAGELC18色譜柱，檢測波長:275nm。
5.根據權利要求1所述的測定方法，所述洗脫過程中，柱溫為40°C，流動相流速:.1.0mT,/mi n.
【文檔編號】G01N30/34GK103575835SQ201310545294
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】劉海靜, 王嫦鶴, 王發, 張秉華, 耿慶光, 劉雪峰, 由亞寧, 馬鵬飛 申請人:陝西省食品藥品檢驗所