家族3纖維素結合域在真核生物中作為重組蛋白質表達和純化的親和標籤的應用的製作方法

2023-07-11 23:56:41 2

專利名稱：家族3纖維素結合域在真核生物中作為重組蛋白質表達和純化的親和標籤的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組蛋白質表達中進行蛋白質純化的方法，特別是採用親和標籤進行快速純化的方法。更具體的說，本發明涉及利用無定形纖維素及其他纖維素為層析材料進行蛋白質純化的方法。本發明還涉及用於蛋白質純化的親和標籤的構建。本發明還涉及採用纖維素結合域在真核細胞中與重組蛋白融合表達以及快速純化融合重組蛋白的方法。更具體地，本發明還涉及在真核生物中利用家族3纖維素結合域CBM3和內蛋白子(intein) 將融合表達的重組蛋白無外額外胺基酸的切出及純化的方法。
背景技術：
隨著在製藥和酶工業不斷上升的重組蛋白質和酶的需求，快速而經濟的重組蛋白質純化方法在生物技術領域一直是一個挑戰。通過標準的層析方法獲得相對純的蛋白質常要求幾個連續的層析步驟。這使得採用這一方法需要消耗大量時間而且產率不高。這個複雜的過程常常會延遲實驗室中對新蛋白質的研究。在大規模製備工業和藥用重組蛋白質時，下遊的純化過程費用很高，可高達總成本的80% [1]。在目前生物學研究中有許多重組蛋白質的純化方法。通過各種親和標記與樹脂結合的親和層析是最常用的蛋白純化方法[2-4]。採用親和層析純化蛋白質的方法可以減少 90%的費用，同時還可以減少純化步驟，節約時間。引入親和標記有時對目標蛋白質的生化特性還有促進作用。現有文獻的報導表明親和標記有下列優點1)提高蛋白質產率[5， 6]，2)避免被蛋白酶水解[7] ；3)協助蛋白摺疊[8,9] ；4)保護重組蛋白的抗原性[10] ；5) 提高重組蛋白的可溶性。現在有許多親和標記用於重組蛋白質的純化。依據結合的樹脂/ 層析柱的方式，它們可以分為幾類1)結合金屬(例如，poly-His) ；2)抗體(例如，FLAG, Protein A,HA, c-myc, T7-tag, GST等):3)與樹脂直接結合(例如，麥芽糖結合蛋白，幾丁質結合域，纖維素結合域等)；4)其它的還有S-tag，streptag II等。親和層析純化中採用的樹脂通常非常昂貴，價格也從幾美元一毫升到幾百美元一毫升[11，12]。如果說對於高附加值的蛋白質比如藥用蛋白質還可以忍受的話，對一些低售價的非藥物蛋白質比如工業用酶來說，這個代價是難以接受的[13]。即使對於高附加值的蛋白，人們也在致力於降低成本。發展簡單，低成本和對環境友好的大規模重組蛋白質純化體系還是一個挑戰[2，14]。纖維素由於其具有下述優點，使其非常適合作為大規模親和層析的樹脂填料 (matrix) 1).便宜，比如目前常用的微晶纖維素市場價約70元/kg ;2).很好的物理特性，能夠耐受高速離心、高柱壓。3).惰性，不與蛋白質以及其他緩衝液中的常見物質反應； 4).對於不帶纖維素結合域(CBM)的蛋白質吸附能力很弱，吸附量非常低；5).有許多商業化的種類棉花，布，濾膜，纖維素粉，纖維素纖維，纖維素小珠等；6).安全，在藥物食品等領域作為填料、輔料已廣泛使用[15]。與纖維素對應的親和標記是纖維素結合域(CBM)。CBM是一個很有吸引力的蛋白質純化親和標記，因為其具有下述優點1). CBM對纖維素的高特異性結合能力，吸附速度很快；2).能夠耐受純化中的變性和酶水解[16，17] ；3).非特異性吸附很低；4).通過CBM 吸附的蛋白質能在非失活條件下解離下來；5). CBM還能促進蛋白質摺疊和分泌[18，19]； 6).提高重組蛋白表達量[20] ；7).提高融合蛋白穩定性[21]。採用CBM為親和標記來純化重組蛋白已經有了一些研究，詳細的進展可以參考近期的綜述[22，23]。使用的是一些結合能力/容量不高的商業化纖維素(Avicel，SigmaCell 和無定形纖維素)[18，20，24-27]。不過大多數以CBM為基礎的純化系統是在大腸桿菌中構建的[28-30]，本發明人已在大腸桿菌中採用熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)的家族3纖維素結合域(CBM3)構建了重組蛋白質的表達純化體系[15，31]。許多時候，純化的蛋白質用於進一步的應用時，尤其是用於醫藥目的的應用時， 親和標記需要被除去。有許多方法可以除去親和標記，它們中的大多數採用蛋白酶切開目標蛋白和親和標記之間的位點來切除親和標記。這個方法，通常需要添加昂貴的蛋白酶，而且需要增加除去添加的蛋白酶的步驟[32]。內蛋白子(Intein)是一種「蛋白質內含子」 [33]，能夠將它們自己切出來同時將其兩端的蛋白質片度連接起來[34，35]。在將 C-或N-末端的胺基酸替換後，內蛋白子可以通過特定PH或巰基試劑誘導自我拼切，將目標蛋白從親和標記和內蛋白子上切下來。這個方法避免了蛋白酶的昂貴費用，簡化純化過程 [34-36]。但是內蛋白子的缺點是在表達的過程中易發生自發的拼切導致最終表達產物中有許多在純化前就丟失親和標記而無法通過親和柱純化[15，31，37，38]。所以有效的控制內蛋白子的拼切在內蛋白子的應用中至關重要。在將融合蛋白結合到樹脂上，洗去雜蛋白質前要儘量抑制內蛋白子的自發拼切，而在此之後又需要儘快使拼切發生，從而使目標蛋白切下來。目前的方法多為改變PH或添加巰基化合物。這些方法在大腸桿菌表達體系中， 由於表達時間短(幾小時)，表達中的自我拼切的損失還可以接受。而酵母中的表達，時間長(幾十小時到幾天)，如果不能控制內蛋白子的自發拼切，將極大影響下遊純化的得率。 目前有許多內蛋白子抑制劑的研究和溫度等條件型突變體也許可以解決這個問題。在酵母中的利用CBM為親和標記還很少見，也不成系統。酵母與大腸桿菌相比有很多優點酵母是低等真核生物，具有細胞生長快，易於培養，遺傳操作簡單等原核生物的特點，又具有真核生物對表達的蛋白質進行正確加工，修飾，合理的空間摺疊等功能，非常有利於真核基因的表達，能有效克服大腸桿菌系統缺乏蛋白翻譯後加工、修飾等不足，因此酵母表達系統受到越來越多的重視和利用。但是只有幾例CBM在酵母體系的報導。Ahn研究組和Rotticci-Mulder研究組都採用採用來源於絲狀真菌的屬於家族I的CBM(CBMl) 與酯酶融合表達，大大促進了酯酶的分泌，但他們沒有採用CBMl作為純化的親和標記[19， 39]。家族I的CBM與纖維素的結合通常被認為可逆的，與纖維素結合的解離很快，不適宜用於作為蛋白質純化的親和標記。源於細菌的CBM，包括家族2和3的CBM2，CBM3，被認為在普通的緩衝液環境下與纖維素的結合是不可逆的，可作為親和標記用於重組蛋白的表達純化[28]。在酵母中CBM2的應用已進行了初步的研究，Kilburn研究組對將糞肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)的CBM2a在畢氏甲醇酵母(Pichia pastoris)中表達後，重組的 CBM2a以及融合蛋白對纖維素的結合特性進行了研究，認為沒有糖基化的CBMh適合作為重組蛋白表達的親和標記。對於家族III的CBM3還沒有在酵母中應用的系統研究。本發明以CBM3為親和標記，以再生無定形纖維素為純化樹脂建立了一個快速高效，低成本的重組蛋白表達純化系統，並通過對EGFP的表達純化進行了驗證採用CBM與內蛋白子這兩項技術結合的重組蛋白的體系，目前只有本發明人在大腸桿菌中構建的系統[31]，NEB公司在細菌中建立了一個幾丁質結合域、內蛋白子與重組蛋白融合表達的體系，雖然方便簡單，與本發明人建立的方法相似，但是幾丁質珠價格昂貴，每15ml售價255元(NEB中國網頁)。而纖維素中與幾丁質珠蛋白質結合容量相似的 RAC(3.6mg/ml)，15ml的成本可以低於1元人民幣(按大批量製備計算)。說明纖維素的 CBM-內蛋白子的體系比NEB的幾丁質體系要便宜得多。在許多時候，人們期望能夠在真核生物(例如，酵母)中進行蛋白質表達，還有些蛋白質在細菌中難以表達，所有這些都希望能夠在酵母中建立CBM-內蛋白子體系。但是酵母中的翻譯後修飾問題對CBM纖維素親和能力的影響，酵母表達過程中的內蛋白子的自發拼切問題都是酵母中CBM-內蛋白子系統實用化之前必須解決的問題。本發明將採用CBM3 為親和標籤，酵母的內蛋白子^^ VMA(其核苷酸序列為SEQ ID NO 4)為基礎，在酵母中構建了一個實用的重組蛋白純化體系。

發明內容
本發明涉及重組蛋白質表達中進行蛋白質純化的方法，特別是採用親和標籤進行快速純化的方法。更具體的說，本發明涉及利用無定形纖維素及其他纖維素為層析材料進行蛋白質純化的方法。本發明還涉及用於蛋白質純化的親和標籤的構建。本發明還涉及採用纖維素結合域在真核細胞中與重組蛋白融合表達以及快速純化融合重組蛋白的方法。更具體地，本發明還涉及在真核生物中利用家族3纖維素結合域CBM3和內蛋白子(intein) 將融合表達的重組蛋白無額外胺基酸的切出及純化的方法。本發明提供下述1.利用家族3纖維素結合域CBM3作為重組蛋白質表達的親和標籤在真核生物中表達和純化重組蛋白的方法，所述方法包括下列步驟(1)構建所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列；(2)構建步驟(1)中的所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列的重組構建體；(3)將步驟O)中構建的所述重組構建體克隆到適於在所述真核生物中表達的表達載體中；(4)將步驟(3)中獲得的重組表達載體在所述真核生物中進行表達；和(5)以CBM3作為親和標籤，利用纖維素純化所表達的重組蛋白。2.利用家族3纖維素結合域CBM3作為重組蛋白質表達的親和標籤結合內蛋白子在真核生物中表達和純化重組蛋白的方法，所述方法包括下列步驟(1)構建所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列；(2)構建步驟(1)中的所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列的重組構建體，並在編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列之間插入內蛋白子核苷酸序列，構建目標蛋白-內蛋白子-CBM3重組構建體；(3)將步驟⑵中構建的所述目標蛋白-內蛋白子-CBM3重組構建體克隆到適於在所述真核生物中表達的表達載體中；(4)將步驟(3)中獲得的重組表達載體在所述真核生物中進行表達；(5)以CBM3作為親和標籤，利用纖維素純化所表達的重組蛋白；和(6)誘導步驟(5)中純化的重組蛋白中的內蛋白子進行自我剪切，得到不含CBM3 的目標蛋白。3.根據第1或2項所述的方法，其中所述家族3纖維素結合域CBM3包括來源於熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)的CBM3，其胺基酸序列為SEQ ID N0:1，還包括 JfeiJIT-Clostridium phytofermentans> 1^^^11 ' (Acetivibrio cellulolyticus)
熱梭狀芽孢桿菌(Clostridium stercorarium)的CBM3，其胺基酸序列分別為SEQ ID N0: 28-30。4.根據第1或2項所述的方法，其中所述真核生物包括酵母，例如釀酒酵母 (Sachromyces cerevisiae)、畢氏甲醇酵母(Pichia pastoris)和馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus)等。5.根據第1或2項所述的方法，其中還包括構建在真核生物中不受翻譯後修飾影響的CBM3突變體。6.根據第5項所述的方法，所述CBM3突變體包括消除一個或多個N-糖基化位點的CBM3突變體。7.根據第6項所述的方法，所述消除一個或多個N-糖基化位點的CBM3突變體包括下列突變中的一種、兩種或三種N14Q，N68Q，和mMQ。8.根據第2項所述的方法，其中所述內蛋白子包括酵母的ke-VMA、Pst VMA, Zbi VMA, Kex VMA 和 Sba VMA，其中 Sce-VMA 的核苷酸序列為 SEQ ID NO :4，Pst VMA, Zbi VMA, Kex VMA和Sba VMA的胺基酸序列分別為SEQ ID NO :31_34。9.根據第2項所述的方法，其中步驟(6)通過改變溫度、加入半胱氨酸、DTT或 β-巰基乙醇誘導內蛋白子的自我剪切。10.根據第1或2項所述的方法，其中步驟(5)中所用的纖維素包括無定形纖維素、微晶纖維素、脫脂棉和濾紙。本發明主要以酵母為例，詳細闡述本發明的方法。但本領域技術人員應該明白，本發明所述的方法並不限於用於酵母，還可以適用於其它本領域常用的用於表達和純化重組蛋白的真核生物體系，例如，但不限於，CH0、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等哺乳動物細胞、蠶及果蠅等昆蟲細胞等。在本發明的第一方面中，在酵母中構建一個以纖維素結合域(cellulose binding module, CBM)為親和標籤表達重組蛋白，以纖維素為層析分離材料對重組蛋白進行分離純化的方法。同時在酵母中建立了以CBM為親和標籤，通過內蛋白子除去親和標籤的重組蛋白表達純化體系(圖1)，其中所述纖維素結合域(CBM)為來源於熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)的CBM3 (其胺基酸序列為SEQ ID NO :1，核苷酸序列為SEQ ID NO :2)。所述方法主要包括構建酵母密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)；在酵母中實現纖維素結合域CBM3與目標蛋白的融合表達；構建在酵母中不受翻譯後修飾影響的 CBM3突變體(表1)；並且在重組蛋白表達過程中和重組蛋白質從纖維素上洗脫前避免緩衝液含有巰基化合物來抑制內蛋白子自我剪切。本發明人在構建這個系統前，由於擔心會發生表達過程中的自發剪切，所以計劃構建溫度敏感性的內蛋白子和添加剪切抑制物，但是在實際實驗中發現，無需進行特別處理，只要在表達過程中和蛋白純化過程中避免含有巰基化合物就可以得到不錯的結果。原因是在表達過程中和剪切誘導之前由於細胞中及緩衝液中不含巰基化合物或濃度很低，所以剪切不發生或很弱，在加入半胱氨酸或DTT之後，巰基化合物濃度較高，剪切就比較快速的發生了。因此，在本發明的具體實施方案中，提供利用家族3纖維素結合域CBM3作為重組蛋白質表達的親和標籤在酵母中表達和純化重組蛋白的方法，所述方法包括下列步驟(1)構建所述酵母密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列；(2)構建步驟(1)中的所述酵母密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列的重組構建體；(3)將步驟O)中構建的所述重組構建體克隆到適於在所述酵母中表達的表達載體中；(4)將步驟(3)中獲得的重組表達載體在所述酵母中進行表達；和(5)以CBM3作為親和標籤，利用纖維素純化所表達的重組蛋白。在本發明的另一個具體實施方案中，提供利用家族3纖維素結合域CBM3作為重組蛋白質表達的親和標籤結合內蛋白子在酵母中表達和純化重組蛋白的方法，所述方法包括下列步驟(1)構建所述酵母密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列；(2)構建步驟(1)中的所述酵母密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列的重組構建體，並在編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列之間插入內蛋白子核苷酸序列，構建目標蛋白-內蛋白子-CBM3重組構建體；(3)將步驟⑵中構建的所述目標蛋白-內蛋白子-CBM3重組構建體克隆到適於在所述酵母中表達的表達載體中；(4)將步驟(3)中獲得的重組表達載體在所述酵母中進行表達；(5)以CBM3作為親和標籤，利用纖維素純化所表達的重組蛋白；和(6)誘導步驟(5)中純化的重組蛋白中的內蛋白子進行自我剪切，得到不含CBM3 的目標蛋白。在上述方法中，所用的酵母包括但不限於本領域中常用的酵母種類，例如，釀酒酵母(Sachromyces cerevisiae)、畢氏甲醇酵母(Pichia pastoris)或馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus)。在上述方法中，其中還包括構建在酵母中不受翻譯後修飾影響的CBM3突變體，所述CBM3突變體包括消除一個或多個N-糖基化位點的CBM3突變體。更具體地，所述消除一個或多個N-糖基化位點的CBM3突變體包括下列突變中的一種、兩種或三種N14Q，N68Q，和 N124Q0在具體的實施方案中，本發明以EGFP為例，通過對EGFP與CBM3或與CBM3和內蛋白子重組融合蛋白的純化展示已建立完整的重組蛋白質純化方法。纖維素結合域(CBM)已在大腸桿菌的表達系統中作為親和標記得到了應用，源於熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)的CBM3 (胺基酸序列為SEQ ID NO 1)同樣已經在大腸桿菌中重組蛋白的親和層析中作為親和標記進行了應用。這個蛋白對纖維素的結合能力是確定的。但是CBM3在酵母中表達，能否作為重組蛋白的親和標籤的應用還沒有系統的研究。而內蛋白子雖然在大腸桿菌中廣泛應用，但是來自酵母的內蛋白子在酵母中功能是否受影響，在酵母中與目標蛋白融合表達後，能否正常進行剪切及其應用也研究的不是很多。本發明在酵母中構建一個以CBM3為親和標記，且不依賴昂貴的蛋白酶除去親和標記蛋白表達純化系統。本領域技術人員應該理解，其他菌來源的家族3的纖維素結合域(CBiO)也可用於本發明，例如來源於Clostridium phytofermentans,解纖維醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)，耐熱梭狀芽孢桿菌(Clostridium stercorarium)等的 CBM3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO 28-30所表示。以下是本發明的具體描述1)首先要對熱纖維梭菌來源的CBM3進行酵母密碼子優化。熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)來源的CBM3密碼子不是酵母中基因編碼的最優密碼子，直接採用原始CBM3基因可能會導致在酵母中表達效率低下，所以要對 CBM3密碼子進行酵母密碼子優化。方法在計算機中採用TmPrime對CBM3密碼子優化以後，通過設計寡聚核苷酸， PCR等方法合成所需的CBM3基因(即，酵母密碼子優化後的核苷酸序列，SEQ ID NO :3)。2)將酵母密碼子優化後的CBM3與目標蛋白質基因融合起來，構建表達CBM3-目標蛋白質的重組融合蛋白的構建體方法可通過分子克隆領域的常規重疊POUoverlapping PCR)、或利用限制酶切位點進行連接。3)採用合適的表達質粒(例如，畢赤甲醇酵母的表達質粒PPICZaA等)來表達 CBM3-目標蛋白質。4)在重組表達CBM3-目標蛋白以後，重組蛋白與纖維素的結合能力通過測量吸附蛋白質的活性來確定。也就是測定不同濃度的CBM-目標蛋白與纖維素結合的量，然後依據 Iangmuir方程計算出最大吸附(Amax)。具體細節方法可以參考本發明人在測定纖維素結合CBM能力方面的工作成果WO]。5)在得到與纖維素高度親和的CBM3-目標蛋白後，可在CBM3與目標蛋白之間插入內蛋白子基因。所採用的內蛋白子為酵母的ke_VMA(核苷酸序列為SEQ ID NO :4)。由於VMA在體內(In Vivo)的自發剪切很少，比較適合需要長時間進行表達的酵母表達體系。本領域技術人員應該理解，適用於本發明方法的內蛋白子不限於酵母Wke-VMA， 其他真核內蛋白子也可適用於本發明的方法，例如，Pst VMA,Zbi VMA,Kex VMA, Sba VMA等酵母內蛋白子(其胺基酸序列分別參見SEQ ID NO :31-34)，採用巰基化合物誘導進行拼接都可適用於本發明的方法。6)可以採用有很大的吸附容量(約5ymol/g)的再生無定形纖維素(RAC)為填料。但也可採用本領域常用的脫脂棉、微晶纖維素、濾紙等材料進行嘗試，為在沒有RAC時提供替代方法。


從下面結合附圖的詳細描述中，本發明的上述特徵和優點將更明顯，其中圖1.酵母中構建的以CBM為親和標記的重組蛋白表達純化體系。圖2.纖維素結合域(CBM)與目標蛋白的融合方式。圖3.採用無定形纖維素(RAC)進行CBM-GFP的純化。1.裝RAC柱子；2.開始上樣；3.上樣基本結束；4.採用Tris-Cl緩衝液(lOOmM，pH 8. 0)，洗去雜蛋白；5. —倍體積的乙二醇混勻；6.採用離心洗脫；7.純化的CBM-GFP及洗脫後的柱子。圖4. CBM3中潛在的N-糖基化位點(下劃線的胺基酸殘基)。圖5. SDS-PAGE分析純化的蛋白。M 標準蛋白分子量；1. CBMmt-EGFP ； 2. CBMwl3m2-EGFP ；3. CBMwt-EGFP ；4.大腸桿菌表達的 CBMwt-EGFP0圖6.對CBM3進行突變的過程。A 構建CBM3所有突變體的過程，B 構建突變的具體策略。圖7.不同濃度的半胱氨酸對EGFP-intein-CBM3(GIC)自我剪切的影響㈧以及不同溫度對GIC自我剪切的影響(50mM半胱氨酸)。圖8.不同濃度的DTT對GIC自我剪切的影響(A)以及不同溫度對GIC自我剪切的影響(50mM DTT)。圖9. SDS-PAGE檢測通過GIC對EGFP的純化。1.細胞裂解上清；2. GIC被RAC結合後上清；3.結合在RAC上沒有剪切後的GIC ；4剪切後仍結合在RAC上的htiein-CBM ； 5.純化的EGFP ；6.標準分子量。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，並不意欲限制本發明的範圍和精神。實施例1纖維素結合域與EGFP的融合表達和純化。EGFP是一種綠色螢光蛋白質，其常常用於分子標記和蛋白定位，是一種常見的蛋白，在本實施例中以此蛋白為例，通過在酵母中與纖維素結合域CBM3融合表達，進行純化來展示CBM3在親和層析中表達純化的能力和優點試劑和菌株本發明中的所有試劑均是市場購買的試劑級以上試劑。微晶纖維素Avicel PH105 (20 μ m)購自 FMC Co (Philadelphia，PA)。大腸桿菌Escherichia coli XLlO gold (購自Stratagene)作為DNA操作時使用的宿主菌，包含100 μ g/mL氨苄青黴素(購自Bio. Basic. Inu)的Luria-Bertani (LB)培養基用作培養E. coli。畢氏甲醇酵母(Pichia pastoris)KM71H( 1 g Invitrogen) ^0^"! Μ， YPD (yeast extract, peptone dextrose)培養基用於培養酵母。YPG(yeast extract, peptone, glycerol)用於表達重組蛋白的前培養，BYPM(Buffered yeast extract, peptone, methanol)培養基用於重組蛋白的表達。表達重組蛋白的菌株通過電穿孔法將重組表達質粒轉化到畢氏甲醇酵母 (P.paSt0riS)KM71H中獲得。實驗中所用的所有引物均由上海生工合成。再生無定形纖維素(RAC)的製備
0. 2g 微晶纖維素(購自 FMC Co (Philadelphia, PA))和 0. 6mL 水在 50mL 離心管中充分混合製備成纖維素漿，再加入IOmL冰冷的濃磷酸(>85%，購自國藥集團)。加入時速度要慢，同時劇烈混合。纖維素混合物會很快變透明。在冰上放置1小時，並不時攪動。 然後分四次加入40mL冰冷的水。加入時要劇烈攪動，避免成塊的纖維素出現。沉澱的纖維素在4°C，5000Xg條件下離心20min.棄去上清，將沉澱重懸於冰水之中，再次離心，並棄上清，重複4次，以除去磷酸.加入ImL 2M Na2CO3和40mL冰冷的水到纖維素中以中和殘餘的磷酸，離心除去上清後，再用水清洗兩遍。如果纖維素PH為5-7，那麼無定形纖維素的製備完成。(如果纖維素PH不為5-7，則需要添加適量的酸或鹼調整pH至5-7。)無定形纖維素的製備的定量採用Phenol-H2SO4法，其他纖維素如Sigmacell、脫脂棉等也可以用於製備無定形纖維素。製備好的無定形纖維素添加0.2% (W/V)疊氮化鈉(購自國藥集團)後在 4°C可保存一年以上。表達載體的構建為了在酵母中表達CBM3(來源於熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum))的融合蛋白質，對CBM3的密碼子進行了優化，優化後的編碼核苷酸序列見SEQ ID N0:3。優化後的cbm3基因通過基因合成進行了人工合成，合成的cbm基因插入到克隆載體pUCm-T (購自上海生工)中。然後將egfp基因從PCG(pCG是一種質粒，見參考文獻Wl])通過PCR擴增出來，所用的引物序列為SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。採用DNA聚合酶為I^rimerMar (購自大連寶生物)。egfp基因PCR擴增反應混合物5X PrimerStar 反應緩衝液 10 μ 1dNTP (IOmM)5μ 1正向引物(10μ Μ)1μ 1反向引物(10μ Μ)1μ 1pCG 模板0. 1 μ 1DNA 聚合酶 PrimerStar0. 5 μ 1H2O32.4 μ 1總反應體積50 μ 1PCR循環條件為1. 95°C 4min2. 95°C 30sec3. 55°C 15sen4. 72 °C Imin5.從2到4循環25次6. 72 °C 7min最後將擴增得到的egfp基因經瓊脂糖凝膠純化並在使用前於4°C保存。將上述擴增產物採用Mil (NEB)和HinDIII (NEB)酶切以後插入到已克隆了 cbm3 的pUCm-T中，構建cbm3和egfp融合的基因。然後通過PCR將cbm3-egfp擴增出來，所用的引物序列為SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8。擴增的cbm3_egfp序列在被EcoRI和XbaI 酶切後克隆到同樣被 EcoRI 和 XbaI 的質粒 pPICZ B(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中，的胺基酸序列在N-端與α -因子的編碼序列融合， 在C-端與His-tag融合。CBM-EGFP融合蛋白可以在AOX啟動子的控制下表達。pCG通過電穿孔轉化於 Pichia pastoris KM71H(購自 Invitrogen)中。纖維素酶結合域CBM3突變體的構建由於CBM3如果在酵母中分泌表達，其可能被糖基化。有3個潛在的糖基化位點 (參見圖4，下劃線表示糖基化位點)。為了構建不同程度的消除N-糖基化位點的CBM3，構建了 7種突變(參見表1)。表1. CBM3突變體和野生型
權利要求
1.利用家族3纖維素結合域CBM3作為重組蛋白質表達的親和標籤在真核生物中表達和純化重組蛋白的方法，所述方法包括下列步驟(1)構建所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列；(2)構建步驟(1)中的所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列的重組構建體；(3)將步驟O)中構建的所述重組構建體克隆到適於在所述真核生物中表達的表達載體中；(4)將步驟(3)中獲得的重組表達載體在所述真核生物中進行表達；和(5)以CBM3作為親和標籤，利用纖維素純化所表達的重組蛋白。
2.利用家族3纖維素結合域CBM3作為重組蛋白質表達的親和標籤結合內蛋白子在真核生物中表達和純化重組蛋白的方法，所述方法包括下列步驟(1)構建所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列；(2)構建步驟(1)中的所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列的重組構建體，並在編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列之間插入內蛋白子核苷酸序列，構建目標蛋白-內蛋白子-CBM3重組構建體；(3)將步驟(2)中構建的所述目標蛋白-內蛋白子-CBM3重組構建體克隆到適於在所述真核生物中表達的表達載體中；(4)將步驟(3)中獲得的重組表達載體在所述真核生物中進行表達；(5)以CBM3作為親和標籤，利用纖維素純化所表達的重組蛋白；和(6)誘導步驟(5)中純化的重組蛋白中的內蛋白子進行自我剪切，得到不含CBM3的目標蛋白。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述家族3纖維素結合域CBM3包括來源於熱纖維梭菌(Clostridium thermocellum)的CBM3，其胺基酸序列為SEQ ID N0:1，還包括 JfeiJIT-Clostridium phytofermentans> 1^^^11 ' (Acetivibrio cellulolyticus)熱梭狀芽孢桿菌(Clostridium stercorarium)的CBM3，其胺基酸序列分別為SEQ ID NO: 28-30。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述真核生物包括酵母，例如釀酒酵母 (Sachromyces cerevisiae)、畢氏甲醇酵母(Pichia pastoris)和馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus)。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中還包括構建在真核生物中不受翻譯後修飾影響的CBM3突變體。
6.根據權利要求5所述的方法，所述CBM3突變體包括消除一個或多個N-糖基化位點的CBM3突變體。
7.根據權利要求6所述的方法，所述消除一個或多個N-糖基化位點的CBM3突變體包括下列突變中的一種、兩種或三種N14Q，N68Q，和mMQ。
8.根據權利要求2所述的方法，其中所述內蛋白子包括酵母的ke-VMA、PstVMA, Zbi VMA, Kex VMA 和 Sba VMA，其中 Sce-VMA 的核苷酸序列為 SEQ ID NO :4，Pst VMA, Zbi VMA, Kex VMA和Sba VMA的胺基酸序列分別為SEQ ID NO :31_34。
9.根據權利要求2所述的方法，其中步驟(6)通過改變溫度、加入半胱氨酸、DTT或β-巰基乙醇誘導內蛋白子的自我剪切。
10.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟(5)中所用的纖維素包括無定形纖維素、微晶纖維素、脫脂棉和濾紙。
全文摘要
本發明屬於重組蛋白表達純化領域。本發明提供利用家族3纖維素結合域CBM3作為重組蛋白質表達的親和標籤在真核生物中表達和純化重組蛋白的方法，所述方法包括下列步驟(1)構建所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列；(2)構建步驟(1)中的所述真核生物密碼子優化的編碼CBM3的核苷酸序列與編碼目標蛋白的核苷酸序列的重組構建體；(3)將步驟(2)中構建的所述重組構建體克隆到適於在所述真核生物中表達的表達載體中；(4)將步驟(3)中獲得的重組表達載體在所述真核生物中進行表達；和(5)以CBM3作為親和標籤，利用纖維素純化所表達的重組蛋白。本發明還提供利用CBM3作為重組蛋白質表達的親和標籤結合內蛋白子在真核生物中表達和純化重組蛋白的方法，所述方法包括構建目標蛋白-內蛋白子-CBM3重組構建體，從而將融合表達的重組蛋白無外額外胺基酸的切出及純化。
文檔編號C12N15/79GK102174532SQ20111003501
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月19日 優先權日2011年1月19日
發明者宛雯, 洪泂, 高曉連 申請人:中國科學技術大學