免疫測定載體的製作方法

2023-07-11 23:59:51

專利名稱：免疫測定載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及測定方法以及在這類測定方法中使用的測定板和試劑。具體而言，本發明涉及結合有抗體的微量滴定板或其他測定板，以及所述板在例如ELISPOT測定等的測定方法中的使用和再利用。
背景技術：
過濾免疫斑測定也被稱為酶聯免疫斑點測定(ELISPOT)，最先被開發用於檢測和定量個體抗體分泌B細胞。在這種技術開發出來後，它給常規的空斑形成細胞測定提供了一種快速和多用途的備選手段。最近的改進提高了ELISPOT的靈敏度，使得可以檢測到每秒產生少至100個特定蛋白質分子的細胞。這些測定利用了緊挨蛋白質分泌細胞的環境中的相對高濃度的給定蛋白質性細胞產物(例如細胞因子)。使用高親和力抗體捕獲並檢測這些細胞產物。ELISPOT測定綜述於CurrentProtocols in Immunology，Unit 6.19 pages 6.19.1-8。
ELISPOT測定方法包括六個具體步驟(1)將純化的細胞因子特異性抗體包被於有膜支持物的的微量滴定板上；(2)將板封閉以阻止任何其它蛋白質的非特異性吸附；(3)將分泌細胞因子的細胞與合適的試劑一起培養；(4)移去細胞和試劑；(5)加入被標記的抗細胞因子二抗；和(6)檢測膜上的抗體-細胞因子複合物。
ELISPOT測定方法利用針對同一細胞因子分子不同表位的兩種高親和力細胞因子特異性抗體可用兩種單克隆抗體，或者一種單克隆抗體和一種多價抗血清的組合。ELISPOT基於檢測單個細胞分泌的細胞因子的顯色反應而產生斑點。斑點代表了產生細胞因子的原始細胞的「足跡」。斑點持久，並可通過目測、顯微方法或電子手段定量。使用螢光標記的檢測方法也已在本領域內有實踐。
促進單克隆或多克隆抗體在PVDF膜或其它固相上的包被的技術已十分成熟(Catt and Tregear(1967)；Salmon et al.(1969)和Perlmann(1972))。關鍵參數包括固相的預活化、抗體溶液的濃縮、包被緩衝液的pH和離子強度、包被時間和溫度以及包被後的處理。需要使所有這些參數最優化以得到高濃度的包被抗體均勻分布於固相表面的微量滴定板。用於ELISPOT測定的微量滴定板中固相的預包被使得大量板之間的靈敏度和穩定性保持一致。這對於診斷樣品的常規處理方法十分重要。
ELISPOT測定可用於臨床處置，例如每個試劑盒一次可測定24個患者的樣品(用96孔板，每個樣品用4個孔)。對少量體積的使用者而言，對板和試劑循環使用的方法會有很大的好處。由於例如下述的原因，很多診所或實驗室無法一次獲得24個新鮮的血樣在某一具體診療時間段內患者人數較少；或者一些實驗室出於例如員工和設備等的可用性的後勤原因更願意進行小量樣品的測定。不管在哪種情況下，測定少於24個樣品並且使板和試劑在以後的時間循環使用或再利用都可以大大提高實驗室的效率。

發明內容
本發明中意外地發現抗體預包被的測定板和試劑可以循環使用，也就是說，可以在微量滴定板的一部分(所有孔的一部分)上進行測定，然後將板和試劑儲存起來，以後在同一塊板的另一部分上使用另外的測定試劑進行其它測定。
根據本發明，提供一種免疫測定方法，包括(a)提供具有多個凹孔的測定板，凹孔中含有有抗體結合的固體支持物；(b)在一個或多個但不是所有的有抗體結合的凹孔中進行測定；(c)以後再在步驟(b)未使用的一個或多個凹孔中進行測定。


圖1.基於表1的結果，在乙酸鹽封條封住的ELISPOT板上進行多次測試的效果。圖中表示的是平均值±1標準差。
圖2.基於表2的結果，在乙酸鹽封條封住的ELISPOT板上進行多次測試(長時程)的效果。圖中表示的是平均值±1標準差。
圖3.基於表3的結果，在兩種溫度下儲存的多次使用試劑與對照試劑相比的斑點計數。圖中表示的是平均值±1標準差。由於孔被完全飽和，新鮮陽性的斑點計數顯示出人為處理的較低讀數。
圖4.基於表4的結果，用不同濃度的幹擾素γ強化的多次使用的二抗偶聯劑與ELISPOT板偶聯的效果。圖中表示的是飽和度百分比的平均值±1標準差。使用t檢驗發現在所有點得到的結果之間沒有顯著差異(α＝0.05)。
圖5.對T細胞系D454 E12用肽池2(Peptide pool2)進行短期研究(n＝12)的SFC計數的平均值±標準差。
圖6.對T細胞系D481 B9用肽池2進行長期研究(n＝8)的SFC計數的平均值±標準差。
具體實施例方式
本發明涉及使用具有多個凹孔或反應孔的測定板的測定方法，每個凹孔或反應孔中含有有抗體結合的固體支持物。結合的抗體用於在一個或多個凹孔或反應孔中的測定。所述測定可包括加入細胞和試劑，以及在合適的溫度下培養。在第一次測定中未使用的凹孔或反應孔隨後可以用於在以後的時間進行的測定中。用一塊板就可在不同的時間點進行幾次獨立的測定。
在本發明的一個優選方面中，測定板包括微量滴定板。所述微量滴定板是廣泛使用的。這些板通常具有96個或384個孔。通常孔呈陣列排布，例如96孔板為8×12排列，384孔板為24×16排列。板上具有許多凹孔或反應孔，96孔板的孔被設計為使用約125μl樣品，384孔板的孔被設計為使用約30μl樣品。孔通常呈規則陣列緊密地排布。這類微量滴定板通常由例如聚丙烯的合適的塑料材料製成。
例如微量滴定板的本發明測定板通常可由合適的塑料材料製成。凹孔或反應孔中含有有抗體結合的固體支持物。優選地，固體支持物為固體可滲透支持物。所述固體支持物通常為在凹孔底部的例如硝酸纖維素膜或PVDF膜的膜。或者固體支持物包括凹孔的固體基質，例如固體聚苯乙烯基質或被處理過以接受或增強抗體結合的基質。
固體支持物上有抗體結合。抗體根據要進行的測定選擇。優選地，測定為基於細胞的測定，並可以為例如ELISPOT測定的免疫斑點測定。通常，使用例如針對人類幹擾素γ、IL-2或TNF-α的抗體的抗細胞因子抗體進行例如ELISPOT測定的測定。通過任何合適的手段將抗體結合於固體支持物。通常，提供有相同的抗體結合於每一凹孔或反應孔中的固體支持物的測定板。
抗體為免疫球蛋白分子，這為本領域所熟知(Immunology，IvanRoitt，et al，Gower Medical Publishing，1985)。它們通常包括由硫氫鍵(sulphydryl bond)連接的兩條「重」多肽鏈和兩條「輕」多肽鏈，以高親和力結合特定抗原的抗體種類可以按常規以單克隆或多克隆抗體種類形式產生。可以產生特異性針對細胞因子分子的典型抗細胞因子抗體，例如抗幹擾素γ、IL-2、IL-10和抗TNF-α。也可以產生例如F(ab)2片段的抗體片段。原則上，只要分子保留著其抗原特異性結合位點，使其可以結合其相應半抗原/抗原，那麼這些分子，包括針對例如類固醇和其它蛋白和非蛋白激素的非細胞因子半抗原/抗原的分子，都可以用於結合固相併用於本文所述類型的免疫測定。
通過加入合適的測定試劑可以進行任何合適的測定。測定可包括根據測定方案在合適的溫度下培養該板。通常，這類測定中包括在20至60℃之間、1至48小時的培養步驟。例如培養溫度通常在25至42℃之間，例如約37℃。培養步驟進行2至24小時，例如至少4小時或至少8小時例如8至12小時，或至少12小時或至少16小時例如16至20小時。使用同一塊測定板的每個測定可以相同或不同。通常，測定為基於細胞的測定，包括含有細胞的樣品在測定板上的培養。
在任何特定測定中用不到的凹孔或反應孔可在測定過程中被覆蓋。在本發明的一方面，這類凹孔或反應孔被封住。凹孔可使用背面粘性的膜或箔或通過加熱將這類膜封於板表面而被封住。這類封板物為本領域所熟知並可包括乙酸鹽膜或聚酯(Mylar)封板膜。在第一次測定前可對整個測定板提供這種覆蓋。
在測定將要進行時可將測定所用的凹孔上的覆蓋物移去，而保持其餘凹孔被覆蓋或被封住。可例如用吸量管將覆蓋物穿孔，以便於將試劑加入到要用的反應孔中。也可以將要用的反應孔上的覆蓋物完全移去。可以揭開在第一次測定過程中保持封住的一個或多個凹孔以便使用同一塊板進行下一次測定。可以移去所有凹孔或反應孔上的覆蓋物，再重新使用該覆蓋物只覆蓋或封住未使用過或下次測定不需使用的凹孔。這樣用同一塊板可以進行10次或更多次的獨立的測定。通常同一塊板可用於進行4至5次獨立的測定，每次測定前揭開所需數量的凹孔。每次測定中可使用相同或不同數量的凹孔或反應孔。
具有抗體結合的板可在各次測定之間儲存起來。板在各次測定之間可儲存最長達1年，例如最長達3至6個月、或例如最長達40天、例如最長達10天，通常在每次測定之間儲存1至2天。優選地，板可在1年例如2個月或40天內用於最多達5次獨立的測定中，優選在5至10天內使用。板可儲存於任何合適的溫度，通常在-5至10℃之間，優選地在2至8℃之間。
測定板可具有任何合適數量的凹孔。優選地，測定板為具有96個凹孔或孔的微量滴定板。通常，所有的孔都用抗體預包被。每次將板用於測定時可使用相同或不同數量的凹孔或孔。
優選地，板用於ELISPOT測定，其中經抗體預包被的板被封閉以阻止蛋白質的非特異性吸附，將分泌細胞因子的細胞和合適的試劑與孔一起培養，洗滌除去細胞和試劑，加入標記的抗細胞因子二抗並檢測抗體-細胞因子複合物。因此，在測定中可使用含有針對細胞因子抗體的二抗的偶聯試劑和含有發色試劑的底物試劑。
在這類測定中，微量滴定板的使用和再利用使得抗體包被的板的使用有更好的成本效益。可對少量的樣品進行測定，並不需丟棄部分使用的測定板，沒有使用的孔可以用於測定在以後的時間點採集的樣品。
以下的實施例解釋了本發明實施例1用於酶聯檢測的PVDF或硝酸纖維素微量滴定板孔的預包被。
將抗體預包被至微量滴定板孔的方法已有明確定義而且很常見。可在50-100mM碳酸鹽緩衝液(pH9.0)中配製一抗，並以每孔0.01-15μg的抗體水平加入到微量滴定板(例如Multiscreen HTS，Cat.No.MSIPS45，Millipore Corp.，Bedford，Mass.，USA)的所需孔中(50-100μl/孔)，在4℃培養過夜。用PBS洗滌除去包被液。以上方法描述於Catt and Tragear(1967)、Salmon et al.(1969)和Perlmann(1972)。
實施例2典型的ELISPOT測定CEF肽池的評價受試者為健康的實驗室工作人員。
CEF肽池獲自Mabtech，Stockholm，Sweden。
依照廠商說明書，使用Vacutainer CPT系統(Becton Dickinson，USA)回收外周血單核細胞(PBMC)，離心洗滌並重懸於AIM-VTM培養基(GIBCOTM)中，並加入至已周抗IFNγMab 1-DIK(h-IFN-γELISpotPRO試劑盒，Mabtech，Stockholm，Sweden)預包被的PVDF為支持物的96孔板中，終體積為每孔100μl的AIM-V。加入細胞數通常為每孔2.5×105。加入50μl的2μg CEF肽/ml的溶液。測定通常在37℃、含5％CO2氣氛中培養16-20小時。移去孔中內容物並洗滌以停止培養。在所有孔中加入50μl的1∶200稀釋的偶聯試劑(mAb 7-B6-1，h-IFN-γELISpotPRO試劑盒，Mabtech，Stockholm，Sweden)並在室溫下培養一小時。再次洗滌孔並加入50μl底物試劑(BCIP/NBT，h-IFN-γELISpotPRO試劑盒，Mabtech，Stockholm，Sweden)。再過5-15分鐘後用水洗滌孔以終止顯色反應。在放大鏡下對斑點計數，並計算空斑形成細胞(SFC)的數量。
對照孔含有PBMC但不含CEF肽。
結果參加測試的所有實驗室工作人員都對肽顯示出陽性反應。
實施例3用於ELISPOT測定的預包被的微量滴定板的循環利用1.在5天時間裡循環利用板4次。
使用乙酸鹽封條(ICN Biomedicals，USA)封住預包被的96孔微量滴定板(h-IFN-γ ELISpotPRO試劑盒，Mabtech，Stockholm，Sweden)。在時間點為零時，通過移去乙酸鹽封條以暴露24個孔。在含0.5％牛血清清蛋白(BSA)的AIM-V培養基(GIBCO)中製備五種濃度的人幹擾素γ(Autogen Bioclear)溶液，使它們的終濃度為30、15、7.5、2.5和0.5ng/mL。將各溶液以100μl/孔的量加至微量滴定板，每四個孔加一種濃度的溶液。使用僅有AIM-V培養基的溶液作為陰性對照。
將板在室溫下培養一小時。用PBS(GIBCO)洗滌板，以50μl/孔的量加入工作強度的偶聯試劑。
將板在室溫下培養一小時，然後用PBS洗滌板，在所有孔中加入50μl底物試劑。在室溫培養七分鐘後除去底物，並用去離子水洗滌板以終止反應。
讓板在室溫下乾燥一小時，使用自動板讀數儀(AID，Straβberg，Germany)分析每孔的飽和度百分比。在讀數後，將板置於37℃、5％CO2的加溼培養箱中過夜以模擬ELISPOT測定的培養條件。
在第二天，將板取出並在2-8℃放置2小時。暴露接下來的24個孔並重複上述操作。在乾燥後，將板再次置於37℃、5％CO2的加溼培養箱中過夜以模擬ELISPOT測定的培養條件。
在第三天，重複第二天的操作。在37℃培養後將板置於2-8℃儲存器中直至第五天。
在第五天，重複第二天的操作。將板置於室溫乾燥過夜並在自動讀數儀上讀數。
對照板也按上述方法循環。不將板封住作為對照。
結果表1.在乙酸鹽封條封住的ELISPOT板上進行多次測試的效果。第一欄顯示所用幹擾素γ的濃度(ng/ml)。n＝4。平均值代表測試孔的飽和度百分比。

2.在10天時間裡循環利用板4次。
使用乙酸鹽封條封住預包被的96孔微量滴定板。在時間點為零時，通過移去乙酸鹽封條以暴露24個孔。在含0.5％牛血清清蛋白(BSA)的AIM-V培養基(GIBCO)中配製五種濃度的人幹擾素γ(AutogenBioclear)溶液，使它們的終濃度為30、15、7.5、2.5和0.5ng/mL。將各溶液以100μl/孔的量加至微量滴定板，每四個孔加一種濃度的溶液。使用僅有AIM-V培養基的溶液作為陰性對照。
將板在室溫下培養一小時。用PBS(GIBCO)洗滌板，以50μl/孔的量加入工作強度的偶聯試劑。
將板在室溫下培養一小時，然後用PBS洗滌板，在所有孔中加入50μl底物試劑。在室溫培養七分鐘後除去底物試劑，並用去離子水洗滌板以終止反應。
讓板在室溫下乾燥一小時，使用自動板讀數儀分析每孔的飽和度百分比。在讀數後，將板置於37℃、5％CO2的加溼培養箱中過夜以模擬ELISPOT測定的條件。
在第二天，將板置於2-8℃直至第三天。
在第三天，使用板上接下來的24個孔重複第一天的操作。
在第四天，將板置於2-8℃直至第八天。
在第八天，按第一天所述進行測定。
在第九天，將板置於2-8℃直至第十天，並在第十天使用最後的24個孔進行第一天所述的測定。將板置於室溫乾燥過夜並用自動讀數儀讀數。
結果表2.在乙酸鹽封條封住的ELISPOT板上進行多次測試(長時程)的效果。第一欄顯示所用幹擾素γ的濃度(ng/ml)。n＝4。平均值代表測試孔的飽和度百分比。

使用聚酯封板條重複了相同的實驗。
封板條(乙酸鹽或聚酯)的使用對測定沒有不良的影響。用未封的對照板得到的結果與預先封住的板的結果相近，並且在預先封住的板中沒有觀察到汙染或不良的影響。
封條本身對未使用的孔提供了良好的保護。乙酸鹽和聚酯封條都便於使用，並可出於多次使用的目的對ELISPOT板提供便宜和有效的保護方式。
為做出全面評估，使用細胞和抗原重複了上述步驟。
實施例4用於ELISPOT測定的試劑的循環使用。
1.肽池(1和2)和陽性對照試劑使肽池1和2和陽性對照試劑(PCR)的小瓶經過多次使用步驟，以便模擬在循環使用的板上順序進行的ELISPOT測定。
肽池1和2每個都含有由結核分枝桿菌(M.tuberculosis)基因組的RD1區域編碼的肽的混合物(Ewer，et al.Comparison ofT-cell-based assay with tuberculin skin test for diagnosis ofMycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosisoutbreak.The Lancet2003；3611168-1173)。陽性對照試劑(PCR)為以1μg/ml溶於細胞培養基(AIM-V)的細胞促分裂原PHA的混合物。
將肽池1和2和陽性對照試劑的小瓶打開，每個小瓶中取出50μl溶液棄去。然後將小瓶重新封好並置於2-8℃或37℃過夜。在第二天和第三天從儲存器中取出小瓶，每次再取出50μl溶液。然後將小瓶置於其原保存條件下。
將來自五個人類捐獻者的PBMC集中儲存於液氮，然後解凍並用於在ELISPOT測定中評價循環使用的試劑的表現。
將PBMC解凍並用AIM-V培養基(GIBCO)洗滌。使用如CellProliferation and Apoptosis(D.Hughes and H.Mehmet，2003)中所述的錐蟲藍染料排除法進行存活PBMC的計數。
將循環使用方法得到的試劑加入至預包被的96孔微量滴定板中進行如上所述的典型的ELISPOT步驟。
對照孔含有新鮮(未循環使用)的試劑。陰性對照含有PBMC但不含肽池1或2或PCR。
結果表3.與對照試劑相比，使用在兩種溫度下儲存的多次使用試劑結果產生的斑點計數(SFC)。

2.偶聯試劑將偶聯試劑瓶從儲存器中取出並在PBS中以1∶200稀釋。1小時後將含有稀釋的偶聯試劑的管置於2-8℃。原先的偶聯試劑瓶也再次置於2-8℃。在最多4天內以24小時的時間間隔重複上述過程。通過進行實施例3所述的幹擾素γ測定來測試所有稀釋的偶聯試劑溶液和原先的儲液。
結果表4.多次使用的二抗偶聯劑與含有不同濃度幹擾素γ的ELISPOT板偶聯的效果。使用t檢驗發現在所有點得到的結果之間沒有顯著差異(α＝0.05)。平均值代表測試孔的飽和度百分比。

以上結果顯示用於測定的試劑是穩定的(表3和4，圖3和4)。
在所有條件下發現陰性對照、肽池1和肽池2的結果中的斑點計數都沒有差異。在目視檢查後，在任一小瓶或試劑中均未觀察到汙染或褪色。當孔被完全飽和時「新鮮陽性」樣品顯示出低的斑點計數，因此讀數器不能分辨確定的斑點。從這些結果可以得出結論試劑在循環使用條件下是穩定的。
實施例5用於使用捐獻者PBMC的ELISPOT測定的試劑和板的循環使用。
用乙酸鹽封條封住微量滴定板。然後使每塊板經過循環過程以模擬在多個時刻「順序」進行ELISPOT測定的過程。上述板的培養過程包括在37℃、5％CO2氣氛的加溼培養箱中過夜培養(16-20小時)，然後在2-8℃儲存8小時。上述過程重複最多達6次。
在真正的ELISPOT測定之前使微量滴定板循環3、4和5次。
使用人類捐獻者樣品(n＝3)和ELISPOT測定方法測量經過循環的板的表現。在標準測定中以每肽2μg/ml使用CEF肽池抗原(Mabtech，Stockholm，Sweden)以刺激測量的激活T細胞和釋放的IFN-γ。用如上所述的標準ELISPOT測定，相對未刺激的細胞對照測量了1μg/ml的陽性對照溶液(PHA，MP Biomedicals)。
捐獻者1表5.以測試孔的飽和度百分比和SFC表示的結果平均值

捐獻者2表6.以測試孔的飽和度百分比和SFC表示的結果平均值


捐獻者3表7.以測試孔的飽和度百分比和SFC表示的結果平均值。n/a為在該時間點未獲得結果。

從三個被測捐獻者得到的結果顯示觀察到的對CEF(用於刺激陽性T細胞反應的抗原)的反應產生的斑點計數在0、3、4和5循環時是一致的。這一反應表明ELISPOT板可以重複利用最多達5次，並且乙酸鹽封板條對未使用的孔提供了足夠的保護。
隨著循環次數的增加，由這三個捐獻者所得的陽性對照反應逐漸變弱。觀察到在第5循環時目測該反應有所減弱。這一觀察結果由飽和度百分比水平得到了證實。在三個捐獻者樣本中都清楚出現的飽和度減弱表明板循環過程有一定的影響。可能是重複的循環使得一部分包被的抗體變性。只有當ELISPOT孔的飽和度水平很高時(例如在陽性對照溶液產生的幹擾素γ飽和度的情況下)才可目測到這一現象。在五個循環後斑點強度的下降並不影響斑點計數。
這些數據可支持被封住的ELISPOT板可循環最多達四次的事實。
實施例6-ELISPOT板的擴展應用材料和方法白細胞的製備已知對Mtb抗原有反應的CD4T細胞克隆在本測定中被用作白細胞源，T細胞系D481 F4對肽池1有反應，T細胞系D481 B9、D481 G7和D454 E12對肽池2有反應(得自D.M.Lewinsohn，Oregon HealthScience University，數據未公開)。使用自體淋巴細胞克隆系(LCL)(亦得自D.M.Lewinsohn，Oregon HealthScience University)提供抗原呈遞細胞。將T細胞克隆和自體LCL在37℃快速解凍，並向細胞滴加1ml預熱(37℃)的GIBCOTMAIM-VTM細胞培養基(Invitrogen，產品編號31035-025)。用AIM-V調節體積至10ml，然後600×g離心7分鐘。將細胞沉澱重懸於10ml新鮮的熱培養基中，350×g離心7分鐘。
存活率計數將細胞沉澱重懸於1mlAIM-V中；取出10μl並在0.4％(w/v)錐蟲藍中稀釋5倍；取10μl稀釋的細胞置於血細胞計數器上並用倒置顯微鏡計數存活細胞。將細胞在AIM-V中稀釋至合適的細胞數量(每100μl含10000個TB細胞克隆，每50μl含20000個LCL細胞)。
T SPOT測定根據廠商說明書(目錄號TB.200，Oxford Immunotec)進行TSPOT-TB測定，除了測定中需要在抗IFN-γ抗體預包被的底部有膜的96孔板中按需要每孔加入50μl的LCL(20000個細胞)和100μl的T細胞克隆(10000個細胞)。在短期研究中使用三塊T SPOT-TB板，在長期研究中使用兩塊板，每塊板含有每個細胞系每次循環的四個平行樣(短期研究n＝12，長期研究n＝8)。
孔中適當地含有肽池1或肽池2。將板在37℃、5％CO2條件下培養16-20小時。用PBF洗滌孔，用提供的抗IFN-γ抗體偶聯劑和酶底物顯色以顯示被捕獲的IFN-γ的存在。每個斑點記錄一個特定抗原反應性T細胞的足跡。
板的再利用在十天或兩個月的時間段內用T SPOT板進行四輪T SPOT-TB測定。短期研究中在第1、3、8和10天進行測定，長期研究中在第1、2、7和8周進行測定。在以上兩種研究中均使用Titer-Tops粘性膜(FisherScientific)以避免未使用孔的汙染。在測定之間將T SPOT板儲存於2-8℃。
結果在十天或兩個月的時間段內用板進行四輪T SPOT-TB測定，並比較T細胞系的SFC計數。T細胞系D481 F4對肽池1有反應，T細胞系D481B9、D481 G7和D454 E12對肽池2有反應。
樣品D481 F4、D481 B9、D481 G7和D454 E12的結果顯示出對Mtb抗原的強特異性反應。例如，D454 E12的SFC計數在短期研究的四次測定中保持一致(圖5)，在使用2樣本的假定等方差的t檢驗將第1次測定與第2、3和4次測定的SFC計數比較時，發現四次測定之間沒有顯著差異(p≥0.05)(表8)。對D481 F4、D481 B9和D481 G7也發現了相同的結果(數據未示出)。
表8在對D454 E12的四次測定之間SFC計數的統計學分析(短期研究)。

在長期研究中的所有四次測定之間也觀察到了類似的結果。例如，對於D481 B9的SFC計數，在四次測定之間未顯示出特定的趨勢(圖6)。
上述結果顯示在十天和兩個月的時間段內用T SPOT-TB進行四次測定可以得到一致的結果。這一事實存在於例如對於T細胞克隆D454 E12和D481 B9的測定中。對於在兩種研究中測試過的所有細胞系都能得到同樣的結果。
權利要求
1.一種免疫測定方法，包括(a)提供具有多個凹孔的測定板，凹孔中含有有抗體結合的固體支持物；(b)在一個或多個但不是所有的有抗體結合的凹孔中進行測定；(c)以後再在步驟(b)未使用的一個或多個凹孔中進行測定。
2.根據權利要求1的測定方法，還包括(d)在(b)和(c)的測定中未使用的一個或多個凹孔中一次或多次重複步驟(c)進行測定。
3.根據權利要求1或2的測定方法，其中在步驟(b)之前覆蓋一個或多個凹孔，步驟(b)在未覆蓋的凹孔中進行，揭開一個或多個所述覆蓋的凹孔以便進行步驟(c)和/或(d)的測定。
4.根據權利要求3的測定方法，其中所述覆蓋物封住所述凹孔。
5.根據權利要求4的測定方法，其中所述覆蓋物包括封膜。
6.根據前述權利要求任一項的測定方法，其中步驟(b)、(c)和/或(d)的測定包括將所述板在25℃或更高的溫度下培養1小時或更長時間。
7.根據權利要求6的測定方法，其中步驟(b)、(c)和/或(d)的測定包括將所述板在25℃至60℃的溫度下培養1至24小時。
8.根據前述權利要求任一項的測定方法，其中所述測定板在步驟(b)、(c)和/或(d)的每次測定之間被儲存。
9.根據權利要求8的測定方法，其中所述測定板在步驟(b)、(c)和/或(d)的每次測定之間被儲存最多達7天。
10.根據權利要求9的測定方法，其中所述測定板在步驟(b)、(c)和/或(d)的每次測定之間被儲存最多達2天。
11.根據權利要求8至10任一項的測定方法，其中所述測定板被儲存於-5至10℃。
12.根據權利要求11的測定方法，其中所述測定板被儲存於2至8℃。
13.根據前述權利要求任一項的測定方法，其中所述測定板包括微量滴定板。
14.根據前述權利要求任一項的測定方法，其中所述固體支持物為固體可滲透支持物。
15.根據權利要求14的測定方法，其中所述固體支持物包括PVDF膜或硝酸纖維素膜。
16.根據前述權利要求任一項的測定方法，其中每塊測定板用於進行最多達5次的獨立的測定。
17.根據前述權利要求任一項的測定方法，其中所述測定為基於細胞的測定。
18.根據權利要求17的測定方法，其中所述測定為ELISPOT測定。
全文摘要
提供一種免疫測定方法，包括(a)提供具有多個凹孔的測定板，凹孔中含有有抗體結合的固體支持物；(b)在一個或多個但不是所有的有抗體結合的凹孔中進行測定；(c)以後再在步驟(b)未使用的一個或多個凹孔中進行測定。
文檔編號B01L3/00GK1985173SQ200580023626
公開日2007年6月20日 申請日期2005年7月15日 優先權日2004年7月15日
發明者T·S·德懷爾, S·W·特納, T·戴 申請人:牛津免疫科技有限公司