一種以牛大力花葯為外植體的再生方法與流程
2023-07-12 09:43:11
本發明屬植物組培
技術領域：
，涉及一種以牛大力花葯為材料的再生方法，具體是一種利用牛大力花葯誘導分化胚性愈傷組織後，再誘導胚狀體萌發，萌發的胚狀體發育為植株的組織培養方法。
背景技術：
：牛大力(Calleryaspeciosa)，學名美麗雞血藤，又名豬腳笠、金鐘根、山蓮藕、倒吊金鐘、大力薯，為豆科(Leguminosae)雞血藤屬(Callerya)植物。牛大力是一種藥食兩用植物，我國野生分布在廣東、廣西、雲南、福建和海南等地，《本草綱目》記載，牛大力具有健脾潤肺、養腎補虛、舒筋活絡之功效，適用於腎虛，血氣不旺，風溼骨痛，經常咳嗽患有急慢性支氣管炎及吸菸人士。國內南方各省，包括香港，民間有時常用牛大力泡酒、煲湯的飲食習慣，能強身健體，增強體質，提高抗病力。隨著市場需求量的不斷增加，野生資源已經接近枯竭，人工種植已成為牛大力產業化發展的有效途徑,如何獲取牛大力優良新品種已成為亟待解決的問題。長期以來牛大力一直處於野生狀態，優良新品種稀缺，從雜合度很高的牛大力野生資源中獲得純化株系，需要很長時間的自交過程，嚴重影響了產業的發展。因此，通過組織培養技術培育牛大力優良無性系是獲得牛大力新品(系)種的有效途徑。經檢索尚未見以牛大力花葯為外植體進行再生的報導。技術實現要素：本發明的目的是提供一種以牛大力花葯為外植體的再生方法，利用牛大力花葯進行培養並再生，可以在短時間內純化牛大力種質，為不同種質間雜交育種提供材料。本發明所採用的技術方案：一種以牛大力花葯為外植體的再生方法，包括牛大力花葯獲取、愈傷組織誘導、胚性愈傷組織誘導及增殖、胚狀體誘導及發育和萌發成苗的過程，其具體步驟如下：1、外植體獲取在牛大力盛花期，選取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾，用0.1％HgCl2消毒10min後，無菌水衝洗4次，吸乾水分後取花葯；或75％酒精噴霧，於超淨工作檯吹乾後取花葯；或直接依次剝掉花萼和部分花瓣，用尖頭鑷子小心的取花葯。汙染率低於5％，存活率(不變黑或不變白者)90％以上。2、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導將獲取的牛大力花葯接種在愈傷組織培養基上，培養溫度24～26℃，暗培養。培養25天時，肉眼可見花葯分化出少量愈傷組織；繼續培養，60天後，部分愈傷組織形成胚性愈傷組織。所述愈傷組織培養基是以改良的MS為基本培養基，並添加2,4-D3.5mg/L以下、6-BA0.2～2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8。3、胚性愈傷組織增殖誘導將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚；將子葉型胚切成2×2～5mm的小塊，接入增殖培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養40天後，可二次分化出胚性愈傷組織，從而實現胚性愈傷組織增殖。所述子葉胚誘導培養基是以改良的MS為基本培養基，並添加6-BA2mg/L以下、NAA0.5mg/L以下、水解乳蛋白(CH)1.0mg/L、穀氨醯胺(Glu)0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L、10％椰子水(CW)，pH5.8。所述增殖培養基是以改良的MS為基本培養基，並添加2,4-D2.0mg/L、BA0.5mg/L、CH1.0mg/L、Glu0.5mg/L、10％椰子水、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH5.8。4、胚狀體的誘導將增殖後的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育胚狀體。所述胚誘導培養基以改良的MS為基本培養基，添加6-BA1.0mg/L以下、NAA0.5mg/L以下、CH1.0mg/L、Glu0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8。5、胚狀體發育誘導及壯苗培養將誘導出的胚狀體單個轉接到胚發育培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養90天後，形成具有芽和根的完整小植株。將發育成的小植株轉接到壯苗培養基上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60天後，小植株莖伸長至5cm以上，葉片數2-3，部分展開，根系發育良好，形成壯苗。所述胚發育培養基是以改良的MS為基本培養基，並添加6-BA0.1～0.5mg/L、NAA0.01～0.15mg/L、10％CW、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH5.8。所述壯苗培養基是以改良MS為基本培養基，並添加NAA0.1～0.5mg/L、IBA0.1～1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉膠6.5g/L，pH5.8。上述改良的MS培養基是在MS培養基的基礎上，在其它成分和含量不變的條件下將肌醇濃度提高到原來的2倍，即肌醇的濃度為200mg/L。本發明以牛大力花葯為外植體，通過愈傷組織誘導、胚性愈傷組織誘導、胚發育和胚萌發成苗的過程，建立了一種牛大力的組織培養體系，並創建了子葉型胚的二次胚性愈傷組織誘導體系，能長期提供胚性愈傷組織，可為牛大力誘變育種、轉基因育種以及牛大力的產業發展提供技術支持。具體實施方式下面結合實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,或按照製造廠商所建議的條件。一、牛大力花葯培養及植株再生本發明實施例中所採用的改良的MS培養基是在MS培養基的基礎上，將其中的肌醇濃度提高到原來的2倍，即肌醇的濃度為200mg/L，其它成分和含量不變。實施例一1、外植體獲取在牛大力盛花期，取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾，用0.1％HgCl2消毒10min後，無菌水衝洗4次，吸乾水分後，依次剝掉花萼和部分花瓣，用尖頭鑷子小心的取花葯。2、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導將花葯接種在愈傷組織培養基(改良MS+1.5mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上，培養溫度24～26℃，暗培養。培養25天時，肉眼可見花葯分化出少量愈傷組織；在不更換培養基、不繼代的條件下繼續培養，60天後，部分愈傷組織形成胚性愈傷組織。3、胚性愈傷組織增殖誘導將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基(改良MS+0.8mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚。將子葉型胚切成2×2～5mm的小塊，接入增殖培養基(改良MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LBA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+10％CW+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養40天後，多數外植體可分化出胚性愈傷組織，部分外植體可分化出次生子葉型胚。4、胚狀體的誘導將增殖後的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基(改良MS+0.3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育成胚狀體。5、胚狀體發育誘導及壯苗培養將誘導出的胚狀體單個剝離並轉接到胚發育培養基(改良MS+0.15mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養90天後，形成具有芽和根的完整小植株。將發育成的小植株轉接到壯苗培養基(改良MS+0.15mg/LNAA+0.5mg/LIBA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60天後，小植株莖伸長至5cm以上，葉片數2-3，部分展開，根系發育良好，形成壯苗。實施例二1、外植體獲取在牛大力盛花期，取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾，用75％酒精噴霧，於超淨工作檯吹乾後取花葯，依次剝掉花萼和部分花瓣，用尖頭鑷子小心的取花葯。2、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導將花葯接種在愈傷組織培養基(改良MS+2.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上，培養溫度24～26℃，暗培養。培養25天時，肉眼可見花葯分化出少量愈傷組織；在不更換培養基、不繼代的條件下繼續培養，60天後，部分愈傷組織形成胚性愈傷組織。3、胚性愈傷組織增殖誘導將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基(改良MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚。將子葉型胚切成2×2～5mm的小塊，接入增殖培養基(改良MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LBA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+10％CW+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養40天後，多數外植體可分化出胚性愈傷組織，部分外植體可分化出次生子葉型胚。4、胚狀體的誘導將增殖後的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基(改良MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育成胚狀體。5、胚狀體發育誘導及壯苗培養將誘導出的胚狀體單個剝離並轉接到胚發育培養基(改良MS+0.2mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養90天後，形成具有芽和根的完整小植株。將發育成的小植株轉接到壯苗培養基(改良MS+0.2mg/LNAA+0.8mg/LIBA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60天後，小植株莖伸長至5cm以上，葉片數2-3，部分展開，根系發育良好，形成壯苗。實施例三1、外植體獲取在牛大力盛花期，取花瓣即將露出花萼或露出花萼1mm以內的花蕾，直接在超淨工作檯上剝取花葯：依次剝掉花萼和部分花瓣，用尖頭鑷子小心的取花葯。2、愈傷組織及胚性愈傷組織誘導將花葯接種在愈傷組織培養基(改良MS+3.0mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上，培養溫度24～26℃，暗培養。培養25天時，肉眼可見花葯分化出少量愈傷組織；在不更換培養基、不繼代的條件下繼續培養，60天後，部分愈傷組織形成胚性愈傷組織。3、胚性愈傷組織增殖誘導將胚性愈傷組織轉接子葉胚誘導培養基(改良MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育為子葉型胚。將子葉型胚切成2×2～5mm的小塊，接入增殖培養基(改良MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LBA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+10％CW+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養40天後，多數外植體可分化出胚性愈傷組織，部分外植體可分化出次生子葉型胚。4、胚狀體的誘導將增殖後的胚性愈傷組織轉接到胚誘導培養基(改良MS+0.8mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH值為5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60～90天，部分胚性愈傷組織發育成胚狀體。5、胚狀體發育誘導及壯苗培養將誘導出的胚狀體單個剝離並轉接到胚發育培養基(改良MS+0.4mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉膠，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養90天後，形成具有芽和根的完整小植株。將發育成的小植株轉接到壯苗培養基(改良MS+0.3mg/LNAA+0.8mg/LIBA+蔗糖30g/L+卡拉膠6.5g/L，pH5.8)上，培養條件：溫度24～26℃，光照時間10～12h/d，光照強度20～30μmol·m-2·s-1。培養60天後，小植株莖伸長至5cm以上，葉片數2-3，部分展開，根系發育良好，形成壯苗。二、牛大力花葯培養效果鑑定1、愈傷組織誘導效果鑑定為鑑定牛大力花葯誘導形成愈傷組織、胚性愈傷組織的效果，對上述實施例的誘導分化情況進行觀察，統計花葯誘導愈傷組織誘導數、胚性愈傷組織數，計算誘導率，結果見表1。表1牛大力花葯誘導情況上述結果表明，本發明採用牛大力花葯作為外植體誘導形成愈傷組織，繼續培養後，愈傷組織形成胚性愈傷組織，具有較高的誘導率。2.子葉胚誘導及增殖效果鑑定為鑑定胚性愈傷組織誘的增殖效果，對上述實施例的胚性愈傷組織誘導子葉胚及子葉胚切塊誘導增殖情況進行觀察，統計誘導數，計算誘導率、增殖係數，結果見表2、表3。表2子葉胚的誘導情況項目胚性愈傷組織塊數形成子葉胚的塊數誘導率實施例一10220％實施例二10440％實施例三10330％表3子葉胚的增殖情況項目子葉胚切塊數形成胚性愈傷組織的塊數誘導率增殖係數實施例一1005050％120倍實施例二1009090％150倍實施例三1007638％140倍上述結果表明，本發明利用胚性愈傷組織誘導形成子葉胚後，誘導子葉胚二次分化胚性愈傷組織的方式進行增殖，效果明顯。3、胚性愈傷組織的發育效果鑑定為考察增殖後的胚性愈傷組織的發育情況，對上述實施例中胚性愈傷組織誘導成胚狀體情況進行觀察，統計胚狀體數，計算誘導率。結果見表4。表4胚性愈傷組織的發育情況項目胚性愈傷組織塊數形成胚狀體的塊數誘導率實施例一2005628％實施例二2008040％實施例三2006432％上述結果表明，本發明以增殖後的胚性愈傷組織為材料，誘導形成胚狀體的效果較為明顯，誘導率最高可達40％。4、胚狀體發育及壯苗培養效果鑑定為鑑定所胚狀體的發育情況，對上述實施例中的胚狀體進行誘導培養，並對萌發的胚狀體進行壯苗培養，統計萌發數和壯苗數，計算萌發率及壯苗形成率，結果見表5。表5胚狀體萌發及壯苗培養情況上述結果表明，本發明利用胚狀體誘導形成小植株並進行壯苗培養，具有較高的胚狀體萌發率和壯苗形成率。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3