一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器的製備方法及應用與流程

2023-07-12 04:13:01 1

本發明屬於新型功能材料與生物傳感檢測技術領域，具體涉及一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器的製備方法及應用。

背景技術：

白細胞介素6（IL-6），簡稱白介素6，參與了大量的生物活性過程，如雜交瘤細胞的生長和免疫系統的調節等。此外，IL-6是診斷疾病，包括糖尿病、動脈粥樣硬化、抑鬱症，阿爾茨海默病、癌症等的潛在因素。各種分析方法已經應用於各種疾病中IL-6的檢測分析，包括酶聯免疫吸附測定，表面等離子體共振，螢光晶片，化學發光免疫分析法，電化學免疫和電化學發光免疫分析。儘管這些分析方法具有許多優點，尋找一種新的方法提高準確性、選擇性和IL-6的檢測靈敏度，仍然是一個挑戰。因此在臨床研究上，發展一種快速、簡便、靈敏和低成本的IL-6的檢測方法有著巨大的需求及重要的意義。

電化學發光免疫傳感器，利用抗原與抗體之間的特異性結合的一類生物傳感器，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、易於小型化、可連續快速、自動化檢測分析等優點，具有良好的應用前景。本發明製備了一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器，並實現對白介素6的高靈敏檢測。銳鈦礦型TiO2 介籠材料（AMCs）和離子液體（CTIL），分別用於固定Ru(bpy)32+和IL-6抗體（Ab1），作為信號探針和分子識別探針；八面體銳鈦礦型TiO2介晶（OAMs）材料用於固定辣根過氧化物酶（HRP）標記的IL-6二抗（Ab2）和酸性磷酸酶（ACP），其將通過典型的夾心型免疫反應自組裝到電極表面，製得IL-6夾心型免疫傳感器。1-萘酚，傳感界面原位上催化水解1-萘磷酸（NPP）的產物，可被HRP及H2O2氧化，產生EC信號，EC信號與IL-6濃度在一定範圍內顯示很寬的動態線性範圍；另一方面，1-萘酚氧化產物可以猝滅Ru(bpy)32+的ECL，導致發光強度的下降，ECL強度與IL-6濃度在一定範圍內顯示了一個寬的動態線性範圍。基於TiO2介晶納米材料優異的生物相容性及離子液體的良好的電子傳導性，所製得的免疫傳感器具有特異性強、靈敏度高、穩定性好、檢測限低等優點。

技術實現要素：

本發明的目的之一是TiO2介晶納米材料，構建一種穩定性好，靈敏度高的雙響應夾心型免疫傳感器的製備。

本發明的目的之二是將該雙響應夾心型免疫傳感器應用於白介素6的高靈敏檢測。

為實現發明目的，本發明採用如下技術方案：

1.一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器的製備方法：

（1） 玻碳電極（GCE）首先在鋪有氧化鋁粉末的麂皮上機械打磨拋光，用二次水洗去表面殘留粉末，再移入超聲水浴中清洗，直至清洗乾淨，最後依序用乙醇，稀酸和水徹底洗滌；

（2） 滴加4μL銳鈦礦型TiO2 介籠（AMCs）/Ru(bpy)32+溶液於乾淨的玻碳電極表面， 60°C下乾燥20min，製得AMCs/Ru(bpy)32+/GCE電極；

（3） 滴加4μL 羧基化離子液體（CTIL）溶液於AMCs/Ru(bpy)32+/GCE修飾電極表面， 60°C下乾燥20min，製得CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE電極；

（4） 將CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE修飾電極浸入濃度比為1:2的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）混合液中50min，再浸入5 μL濃度為2 mg/mL白介素6抗體（Ab1)溶液中並在4°C冰箱中孵育45min，用去離子水洗去物理吸附的Ab1，製得Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE電極；

（5） 將Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE修飾電極浸入0.5 wt.%的BSA溶液中並在4°C冰箱中孵育1 h，以封閉電極表面上非特異性活性位點，用去離子水衝洗電極表面洗去物理吸附，並保存在4°C冰箱中；

（6） 將步驟（5）得到的電極浸入不同濃度的白介素6（IL-6）標準溶液中並在4°C冰箱中孵育30 min，用pH7.5的 PBS緩衝溶液衝洗電極表面，製得IL-6/Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/ GCE電極；

（7） 將電IL-6/Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/ GCE極浸入辣根過氧化物酶（HRP）標記的IL-6二抗（Ab2）和酸性磷酸酶（ACP）及八面體銳鈦礦型TiO2介晶（OAMs）（Ab2-HRP/ACP/OAMs）複合物溶液並在4°C冰箱中孵育40 min，用pH7.5的 PBS緩衝溶液衝洗電極表面，製得Ab2-HRP/ACP/OAMs/IL-6/Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE電極，並保存在4°C冰箱中。

2.上述銳鈦礦型TiO2 介籠（AMCs）/Ru(bpy)32+溶液由下述方法製備：500 μL 濃度為10mg/mL 的AMCs溶液 與 500 μL 濃度為 0.01mol/L的 Ru(bpy)32+ 溶液混合2 h，在10000 rpm轉速下離心 10 min，收集AMCs/Ru(bpy)32+沉澱物，在去離子水中重新分散以備使用。

3.上述銳鈦礦型TiO2 介籠（AMCs）材料由下述方法製備的：4.5g的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解在150ml濃度為2 mol/L的鹽酸溶液中，攪拌5分鐘；加入4.5ml異丙醇（TIP）鈦（IV），在80°C下攪拌48 h，離心收集沉澱物並用蒸餾水徹底清洗；在60°C下烘乾12 h，然後在空氣中400°C下煅燒30min，，以除去殘餘的有機物，製得AMCs。

4.上述辣根過氧化物酶（HRP）標記的IL-6二抗（Ab2）和酸性磷酸酶（ACP）及八面體銳鈦礦型TiO2介晶（OAMs）（Ab2-HRP/ACP/OAMs）複合物溶液由下述方法製備：1 mL OAMs 懸浮液 與40μL（3-氨基丙基）三乙氧基矽烷（APTES）試劑在室溫下攪拌12 h，離心收集氨基化的OAMs沉澱物並用蒸餾水徹底清洗去掉多餘的APTES；將20ul濃度為10mg/ml HRP標記的Ab2溶液及濃度為1mg/ml ACP與10 μL 濃度為10 mM的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及10 μL濃度為20 mM的 N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）混合50 min，加入氨基功能化的 OAMs 溶液4℃放置12 h，在 10000 rpm 轉速下離心 10 min 獲得Ab2-HRP/ACP/OAMs複合物並分散在pH 7.4 PBS溶液中保存。

5.上述八面體銳鈦礦型TiO2介晶（OAMs）材料由下述方法製備的：1.2克的銳鈦礦型TiO2粉末溶解於60mL濃度為18mol/ml的 KOH溶液中，攪拌20分鐘後，將懸浮液移入一個100ml聚四氟乙烯內襯不鏽鋼高壓釜內；密封反應器， 170ºC 下反應72小時，冷卻到室溫；然後，用稀醋酸溶液洗滌沉澱至沉澱pH值為3.5，沉澱離心後在65ºC下乾燥12 小時得到產物鈦酸納米線.；取400mg前驅體鈦酸納米線分散在70ml稀醋酸中，於100聚四氟乙烯高壓反應釜中200ºC條件下反應 48h，所得到的產物用蒸餾水和無水乙醇離心洗滌，60ºC條件下烘乾12 h並400ºC下煅燒 30分鐘，以除去殘餘的有機物，製得OAMs。

6.白介素6(IL-6)的檢測步驟如下：

（1）使用電化學工作站採用三電極體系進行測定，以上述一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，在含有濃度為5×10-3 mol/ml 1-萘磷酸（NPP） 和濃度為15×10-3mol/ml H2O2的Ph7.5的 PBS緩衝溶液中進行測試，採用差示脈衝伏安法（DPV），掃描電壓範圍為0.2V–0.6 V，掃描速率為100 mV/s，通過所得的氧化峰電流信號與IL-6標準溶液濃度之間的關係，繪製電化學工作曲線；

（2）使用電化學工作站採用三電極體系進行測定，以上述一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，在含有濃度為5×10-3 mol/ml 1-萘磷酸（NPP）和濃度為15×10-3mol/ml H2O2的Ph7.5的 PBS緩衝溶液中進行測試，採用循環伏安電壓，掃描電壓範圍為0V–1.3 V，掃描速率為100 mV/s，通過電致化學發光設備採集電致化學發光信號，光電倍增管電壓為900V，通過所得的電致化學發光強度與IL-6標準溶液濃度之間的關係，繪製電化學發光工作曲線；

（3）待測樣品溶液代替IL-6標準溶液進行檢測，檢測的結果通過工作曲線查得。

本發明的顯著優點為：

(1)所製備的銳鈦礦型TiO2 介籠材料（AMCs）和八面體銳鈦礦型TiO2介晶（OAMs）具有大比表面積及良好的生物兼容性有利於發光試劑、酶和抗體本在電極表面的固定，可提高傳感器的靈敏度及穩定性；

(2)通過酶催化反應在傳感器界面原位生成電活性物質，所製備的免疫傳感器具有較高的靈敏度；

(3)所製備的雙響應夾心型免疫傳感器可產生電化學發光及電化學信號，具有較高的選擇性及靈敏度；

(4)本發明利用抗原、抗體的免疫反應，提高了檢測方法的特異性。

附圖說明

圖1為一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器的製備過程示意圖。

圖2A為AMCs材料的電子發射掃描電子顯微鏡（SEM）圖。

圖2B及圖2C為AMCs材料的透射電子顯微鏡（TEM）圖。

圖2C插圖為AMCs 納米片的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）及選區電子衍射（SAED）圖。

圖2D為OAMs材料的電子發射掃描電子顯微鏡（SEM）圖。

圖2E及圖2F為OAMs材料的透射電子顯微鏡（TEM）圖。

圖2F插圖為OAMs納米片的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）及選區電子衍射（SAED）圖。

圖3為雙響應夾心型免疫傳感電極的電化學信號及電化學發光響應信號與白介素6標準溶液濃度的線性關係圖。

具體實施方式

本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護範圍並不限於下列實施例。

實施例1

一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器的製備（如圖1所示）：

（1） 玻碳電極（GCE）首先在鋪有氧化鋁粉末的麂皮上機械打磨拋光，用二次水洗去表面殘留粉末，再移入超聲水浴中清洗，直至清洗乾淨，最後依序用乙醇，稀酸和水徹底洗滌；

（2） 滴加4μL銳鈦礦型TiO2 介籠（AMCs）/Ru(bpy)32+溶液於乾淨的玻碳電極表面， 60°C下乾燥20min，製得AMCs/Ru(bpy)32+/GCE電極；

（3） 滴加4μL 羧基化離子液體（CTIL）溶液於AMCs/Ru(bpy)32+/GCE修飾電極表面，60°C下乾燥20min，製得CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE電極；

（4） 將CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE修飾電極浸入濃度比為1：2的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）混合液中50min，再浸入5 μL濃度為2 mg/mL白介素6抗體（Ab1)溶液中並在4°C冰箱中孵育45min，用去離子水洗去物理吸附的Ab1，製得Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE電極；

（5） 將Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE修飾電極浸入0.5 wt.%的BSA溶液中並在4°C冰箱中孵育1 h，以封閉電極表面上非特異性活性位點，用去離子水衝洗電極表面洗去物理吸附，並保存在4°C冰箱中；

（6） 將步驟（5）得到的電極浸入不同濃度的白細胞介素6（IL-6）標準溶液中並在4°C冰箱中孵育30 min，用pH7.5的 PBS緩衝溶液衝洗電極表面，製得IL-6/Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/ GCE電極；

（7） 將IL-6/Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/ GCE修飾電極浸入固定化辣根過氧化物酶（HRP）標記的IL-6二抗（Ab2）和酸性磷酸酶（ACP）及八面體銳鈦礦型TiO2介晶（OAMs）（Ab2-HRP/ACP/OAMs）複合物溶液並在4°C冰箱中孵育40 min，用pH7.5的 PBS緩衝溶液衝洗電極表面，製得Ab2-HRP/ACP/OAMs/IL-6/Ab1/CTIL/AMCs/Ru(bpy)32+/GCE，並保存在4°C冰箱中。辣根過氧化物酶（HRP）標記的IL-6二抗（Ab2）和酸性磷酸酶（ACP）購於上海領潮生物科技有限公司。

實施例2

上述實施例1的羧基化離子液體（CTIL）的製備：

3.3g甲基咪唑與5.7g 氯乙酸在20ml的甲苯中回流24h, 重結晶純化得到羧基化離子液體。

實施例3

上述實施例1的銳鈦礦型TiO2 介籠（AMCs）/Ru(bpy)32+溶液的製備：

4.5g十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解在150ml濃度為2 mol/L的鹽酸溶液中，攪拌5分鐘；加入4.5ml四異丙醇鈦（IV），在80°C下攪拌48 h，離心收集沉澱物並用蒸餾水徹底清洗；在60°C下烘乾12 h，然後在空氣中400°C下煅燒30min，，以除去殘餘的有機物，製得銳鈦礦型TiO2介籠（AMCs）。AMCs的電子發射掃描電子顯微鏡（SEM）圖、透射電子顯微鏡（TEM）圖、高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）及選區電子衍射（SAED）圖，如圖2A、圖2B、圖2C及圖2C插圖所示，表明AMCs的形成。

500 μL 濃度為10mg/mL 的AMCs溶液 與 500 μL 濃度為 0.01mol/L的 Ru(bpy)32+ 溶液混合2 h，在10000 rpm轉速下離心 10 min，收集AMCs/Ru(bpy)32+沉澱物，在去離子水中重新分散以備使用。

實施例4

上述實施例1的辣根過氧化物酶（HRP）標記的IL-6二抗（Ab2）酸性磷酸酶（ACP）及八面體銳鈦礦型TiO2介晶（OAMs）（Ab2-HRP/ACP/OAMs）複合物溶液的製備：

1 mL OAMs 懸浮液 與40μL（3-氨基丙基）三乙氧基矽烷（APTES）試劑在室溫下攪拌12 h，離心收集氨基化的OAMs沉澱物並用蒸餾水徹底清洗去掉多餘的APTES；將20ul濃度為10mg/ml HRP標記的Ab2溶液及濃度為1mg/ml ACP與10 μL 濃度為10 mM的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及10 μL濃度為20 mM的 N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）混合50 min, 加入氨基功能化的 OAMs 溶液4℃放置12 h，在 10000 rpm 轉速下離心 10 min 獲得Ab2-HRP/ACP/OAMs複合物並分散在pH 7.4 PBS溶液中保存。

實施例5

上述實施例4的八面體銳鈦礦型TiO2介晶（OAMs）材料的製備：

1.2克的銳鈦礦型TiO2粉末溶解於60mL濃度為18mol/ml 的KOH溶液中，攪拌20分鐘後，將懸浮液移入一個100ml聚四氟乙烯內襯不鏽鋼高壓釜內；密封反應器， 170ºC 下反應72小時，冷卻到室溫；然後，用稀醋酸溶液洗滌沉澱至沉澱pH值為3.5，沉澱離心後在65ºC下乾燥12 小時得到產物鈦酸納米線.；取400mg前驅體鈦酸納米線分散在70ml稀醋酸中，於100聚四氟乙烯高壓反應釜中200ºC條件下反應 48h，所得到的產物用蒸餾水和無水乙醇離心洗滌，60ºC條件下烘乾12 h並400ºC下煅燒 30分鐘，以除去殘餘的有機物，製得OAMs。其中銳鈦礦型TiO2粉末購於青島德固賽化學有限公司。OAMs的電子發射掃描電子顯微鏡（SEM）圖、透射電子顯微鏡（TEM）圖、高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）及選區電子衍射（SAED）圖，如圖2D、圖2E、圖2F及圖2F插圖所示，表明OAMs的形成。

實施例6

白介素6(IL-6)的檢測步驟：

（1）使用電化學工作站採用三電極體系進行測定，以上述實施例製備的基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，在含有濃度為5×10-3 mol/ml 1-萘磷酸（NPP） 和濃度為15×10-3mol/ml H2O2的Ph7.5的 PBS緩衝溶液中進行測試，採用差示脈衝伏安法（DPV），掃描電壓範圍為0.2V–0.6 V，掃描速率為100 mV/s，通過所得的氧化峰電流信號與IL-6標準溶液濃度之間的關係，繪製電化學工作曲線，如圖3所示；

（2）使用電化學工作站採用三電極體系進行測定，以上述實施例製備的一種基於TiO2介晶納米材料的雙響應夾心型免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，在含有濃度為5×10-3 mol/ml 1-萘磷酸（NPP） 和濃度為15×10-3mol/ml H2O2的Ph7.5的 PBS緩衝溶液中進行測試，採用循環伏安電壓，掃描電壓範圍為0V–1.3 V，掃描速率為100 mV/s，通過電致化學發光設備採集電致化學發光信號，光電倍增管電壓為900V，通過所得的電致化學發光強度與IL-6標準溶液濃度之間的關係，繪製電化學發光工作曲線，如圖3所示；

（3）待測樣品溶液代替IL-6標準溶液進行檢測，檢測的結果通過工作曲線查得。