一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法

2023-07-12 02:28:06 2

一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法
【專利摘要】一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其是將需凍存的鱘魚精子與抗凍保護液按體積份100:90的比例均勻稀釋後，加入8體積份的鮮雞蛋黃、45體積份的花生四烯酸、6體積份的甘油脂，混勻成精液混合液，用冷凍膠囊盛裝，置於抽屜式冷凍室中冷凍，凍速為-58至-60℃/min，冷凍到-56至-58℃後，再將盛裝有精液混合液的膠囊卸載在盛有液氮的杜瓦罐內，控制凍速為-148至-152℃/min，冷凍到-190至-196℃後凍存。本發明能夠有效提高凍精的生存活力，解凍後的精子授精於鮮卵，其鮮卵受精接近鮮精授精，受精率可達80-90%，且胚胎發育良好。
【專利說明】一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種魚類雜交育種的深低溫凍融技術，特別是一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法。
【背景技術】
[0002]保全生物遺傳多樣性及雜交育種的應用，在水產養殖中選擇一 170°C以下深低溫凍存精子進行魚類的繁衍，是生物技術創新應用的發展趨勢。但目前，深低溫保存魚類精子也只是高度發達國家用於實驗室的方法，實際應用範圍卻非常有限，其主要原因，是由於許多種魚類精子在冷凍和解凍過程中會發生重大損害。損害的程度取決於冷凍速率、冷凍保護液以及融凍方法。
[0003]不少學者提出，在深低溫保存凍精的過程中若能實現玻璃化，將更有利於生物遺傳多樣性保全和雜交育種的研究及應用，利於珍稀動物的保存。運用玻璃化冷凍的方法，如果能成功地實現低溫保存遺傳物質，將造福於人類。
[0004]現有的精液冷凍保護方法一緩慢冷凍方法容易形成冰晶，會導致形成胞外冰與胞內冰而損傷細胞，加之凍融過 程中的晶化再結晶，影響其成活率，使得這一生物凍存技術成本昂貴，應用效率極低。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是克服現有技術的不足，而提供一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法。
[0006]本發明的技術方案是:一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其是將需凍存的鱘魚精子與抗凍保護液按體積份100:90—120的比例均勻稀釋後，加入8-12體積份的鮮雞蛋黃、45-50體積份的花生四烯酸、6-10體積份的脂質混勻，用冷凍膠囊盛裝，置於抽屜式冷凍室中冷凍，凍速為-58至-68°C /min,冷凍到-56至_70°C後，再將盛有凍液混合液的膠囊卸載在盛有液氮的杜瓦罐內，控制凍速為-148至-152°C /min，冷凍到-190至_196°C後凍存；
本發明進一步的技術方案是:鮮雞蛋黃的製備方法是:將0-5°C條件下儲存、儲存時間在3個月以內的鮮雞蛋，去除蛋清和蛋殼後即成。
[0007]本發明再進一步的技術方案是:抗凍保護液的製備方法是:按照配比將10%的二甲基酚加入到醫用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:8-12:6-10。
[0008]本發明由於採用如上方法，與現有技術相比，具有如下優點:
1、採取快速降溫的方式對鱘魚精子進行冷凍，避免凍精形成胞內冰與胞外冰傷害，能夠有效提聞凍精的生存活力；
2、採用抗凍保護液作為防凍劑，可以使冰相變化時有效地改變冰微粒的面積，極大地改變了精子凍存過程中形成的冰狀形態，既能削弱和抑制凍精冰粒的產生，又更有效地減小冰微粒在水介質中的可溶性，讓凍存的精子適用適宜的生存環境，避免結晶和重結晶，提高鱘魚精子冷凍存活率。[0009]3、解凍後的精子活力接近鮮精。用其授精於鮮卵，其鮮卵受精率可達80-90%，且胚胎發育良好，降低了產業化應用的生產成本，提高了凍精保存的使用價值。
【具體實施方式】
[0010]以下結合【具體實施方式】對本發明的詳細結構作進一步描述。
[0011]實施例1:
一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其是將需凍存的鱘魚精子與抗凍保護液按體積份100:90的比例均勻稀釋後，加入8體積份的鮮雞蛋黃、45體積份的花生四烯酸、6體積份的甘油脂混勻，用冷凍膠囊盛裝，置於抽屜式冷凍室中冷凍，凍速為-58至-60°C /min，冷凍到-56至_58°C後，再將盛裝有精液混合液的膠囊卸載在盛有液氮的杜瓦罐內，控制凍速為-148至-152。。/min，冷凍到-190至_196°C後凍存。
[0012]抗凍保護液的製備方法是:按照配比將10%的二甲基酚加入到醫用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:8:6。
[0013]實施例2:
一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其是將需凍存的鱘魚精子與抗凍保護液按體積份100:100的比例均勻稀釋後，加入9體積份的鮮雞蛋黃、46體積份的花生四烯酸、7體積份的甘油磷脂，混勻成精液混合液，用冷凍膠囊盛裝，置於抽屜式冷凍室中冷凍，凍速為-60至-62°C /min，冷凍到-60至_62°C後，再將盛裝有精液混合液的膠囊卸載在盛有液氮的杜瓦罐內，控制凍速為-148至-152°C /min,冷凍到-190至_196°C後凍存。
[0014]抗凍保護液的製備方法是:按照配比將10%的二甲基酚加入到醫用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:9:8。
[0015]實施例3: 一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其是將需凍存的鱘魚精子與抗凍保護液按體積份100:110的比例均勻稀釋後，加入10體積份的鮮雞蛋黃、48體積份的花生四烯酸、8體積份的脂蛋白，混勻成精液混合液，用冷凍膠囊盛裝，置於抽屜式冷凍室中冷凍，凍速為-64至-66°C /min，冷凍到-64至_66°C後，再將盛裝有精液混合液的膠囊卸載在盛有液氮的杜瓦罐內，控制凍速為-148至-152°C /min，冷凍到-190至_196°C後凍存。
[0016]抗凍保護液的製備方法是:按照配比將10%的二甲基酚加入到醫用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:10:9。
[0017]實施例4:
一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其是將需凍存的鱘魚精子與抗凍保護液按體積份100:120的比例均勻稀釋後，加入12體積份的鮮雞蛋黃、50體積份的花生四烯酸、3體積份的甘油脂、3體積份的甘油磷脂和4體積份的脂蛋白，混勻成精液混合液，用冷凍膠囊盛裝，置於抽屜式冷凍室中冷凍，凍速為-66至-68°C /min,冷凍到-68至_70°C後，再將盛裝有精液混合液的膠囊卸載在盛有液氮的杜瓦罐內，控制凍速為-148至-152°C /min,冷凍到-190至-196 °C後凍存。[0018]抗凍保護液的製備方法是:按照配比將10%的二甲基酚加入到醫用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=100:12:10。[0019]當需要用冷凍的鱘魚精子對鱘魚母本進行體外授精時，將杜瓦罐內盛裝有精液混合液的膠囊從液氮中取出，放入水浴鍋中，保持水浴鍋中水的溫度為32-34°C，時間40-50秒鐘，待膠囊中的精液混合液成為液體狀態後，取出裝有精液混合液的膠囊，將膠囊中的精液混合液倒入盛精瓶內，即可對鱘魚母本進行體外授精。
【權利要求】
1.一種鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其特徵是:將需凍存的鱘魚精子與抗凍保護液按體積份100:90—120的比例均勻稀釋後，加入8-12體積份的鮮雞蛋黃、45-50體積份的花生四烯酸、6-10體積份的脂質，混勻成精液混合液，用冷凍膠囊盛裝，置於抽屜式冷凍室中冷凍，凍速為-58至-68°C /min,冷凍到-56至_70°C後，再將盛裝有精液混合液的膠囊卸載在盛有液氮的杜瓦罐內，控制凍速為-148至-152°C /min，冷凍到-190至_196°C後凍存。
2.根據權利要求1所述的鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其特徵是鮮雞蛋黃的製備方法是:0-5°C條件下儲存、儲存時間在3個月以內的鮮雞蛋，去除蛋殼和蛋清後即成。
3.根據權利要求1所述的鱘魚精子玻璃化冷凍方法，其特徵是抗凍保護液的製備方法，是按照配比將10%的二甲基酚加入到醫用生理鹽水中混和均勻，再加入甘露糖醇，混和均勻即可；抗凍保護液的重量配比為:醫用生理鹽水:10%的二甲基酚:甘露糖醇=10:0:8-12 :6-10。
【文檔編號】A01N1/02GK103931607SQ201410134067
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】趙智媛, 趙偉 申請人:湖南苗王生物科技有限公司