檢測Ⅰ群禽腺病毒抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法及其應用與流程

2023-07-12 06:29:41 1

本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種檢測ⅰ群禽腺病毒抗體的間接elisa試劑盒及其檢測方法及其應用。

背景技術：

禽腺病毒(fowladenovirus，fav)是一種無囊膜的雙鏈dna病毒，可分為ⅰ、ⅱ、ⅲ三群，ⅰ群禽腺病毒(fowladenovirusgroupi，favⅰ)具有共同的群抗原，該群病毒代表株為雞胚致死孤兒病毒(chickenembrolethalorphanvirus,celov)。2015年6月以來，我國多數省份的雞群爆發安卡拉病(angraradisease)，病原為ⅰ群fav中c種fav-4型，主要以病禽突然倒地，出現呼吸道症狀、神經症狀、包涵體肝炎、心包積液症候群和砂囊糜爛為特徵。該病主要發生於3周齡的肉雞，發病1周左右為死亡高峰，死亡率可達20％～80％，給養殖生產造成巨大經濟損失。目前，該病仍在我國雞群中流行。

目前對於favⅰ傳統的實驗室診斷方法均存在一定缺陷，如病毒的分離鑑定、中和試驗、瓊脂擴散試驗等方法費時耗力，結果不夠精確，pcr、lamp等對試劑和設備要求較高且不便對大量樣品進行檢測，而elisa具有簡便、快速、特異性強等優點，並且elisa檢測抗體能有效的評估疫苗免疫效果。六鄰體蛋白hexon是favⅰ的主要結構蛋白，位於favⅰ的外殼，hexon蛋白含有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇，可以作為診斷抗原。因此，六鄰體蛋白hexon對於favⅰ抗體的間接elisa檢測具有重要研究意義。

技術實現要素：

有鑑於此，本發明實施例提供了一種檢測ⅰ群禽腺病毒抗體的間接elisa試劑盒及其檢測方法及其應用，主要目的是提供一種簡便、快速及準確檢測favⅰ血清抗體的方法。

為達到上述目的，本發明主要提供了如下技術方案：

一方面，本發明實施例提供了一種檢測ⅰ群禽腺病毒抗體的間接elisa試劑盒，所述試劑盒包括：包被酶標板、洗滌液、血清稀釋液、底物顯色液、兔抗雞酶標二抗、終止液、favⅰ標準陽性血清和favⅰ標準陰性血清；其中，所述包被酶標板是以ⅰ群禽腺病毒favⅰ的重組六鄰體蛋白作為包被抗原。

作為優選，所述ⅰ群禽腺病毒favⅰ的重組六鄰體蛋白的核苷酸序列表為seq.id.no.1。

作為優選，所述ⅰ群禽腺病毒favⅰ的重組六鄰體蛋白的製備方法包括：

設計合成引物，以ⅰ群禽腺病毒favⅰ代表株雞胚致死孤兒病毒基因組為模板，通過pcr擴增得到六鄰體蛋白的擴增產物，所述擴增產物連接其表達載體並同時進行雙酶切,然後連接，構建重組質粒；將挑選的陽性重組質粒轉化大腸桿菌bl21(de3)感受態細胞，獲得陽性重組質粒單克隆菌，所述陽性重組質粒單克隆菌在iptg誘導下進行蛋白表達得到誘導產物，所述誘導產物依次經裂解沉澱、純化及六階段梯度復性後得到重組六鄰體蛋白；其中，所述合成引物為：

上遊引物：5'-cgcggatccatgactgcgcttactcccga-3'，

下遊引物：5'-ccgctcgagccgctcgagcgccagcatgtactggtaac-3'。

作為優選，所述洗滌液為含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩衝液，ph為7.4。

作為優選，所述血清稀釋液為含50g/l脫脂奶粉的磷酸鹽緩衝液；所述底物顯色液為過氧化氫的四甲基聯苯胺溶液。

作為優選，所述終止液為2m硫酸溶液。

作為優選，所述包被抗原的包被濃度為5.0μg/ml；所述包被酶標板經含50g/l脫脂奶粉的pbst封閉，裝入密封袋中置於4℃保存。

作為優選，所述兔抗雞酶標二抗的稀釋倍數為1:5000。

另一方面，本發明實施例提供了上述檢測ⅰ群禽腺病毒抗體的間接elisa試劑盒的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：

用血清稀釋液以體積比1：200的比例稀釋待檢血清得到稀釋血清；

向96孔酶標板每孔中加入100μ所述稀釋血清，向酶標板各添加兩孔favⅰ標準陽性血清和favⅰ標準陰性血清作為對照，於37℃孵育1h，棄去反應孔中液體，再向每孔加入300μl洗滌液並洗滌3次，每次5分鐘，棄洗滌液，最後一次拍幹；

向96孔酶標板每孔中加入100μl以體積比1:5000稀釋後的兔抗雞酶標二抗，於37℃孵育1h，棄去反應孔中液體，向每孔中加入300μl洗滌液並洗滌3次，每次5分鐘，棄洗滌液，最後一次拍幹；

向96孔酶標板每孔中加入100μl底物顯色液，室溫下避光作用10分鐘；

向96孔酶標板每孔加入100μl終止液以終止顯色反應；

用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光光度(od)值；

根據od值判定，當od450值≥0.322時，判定favⅰ抗體水平為陽性，當od450值＜0.322時判定favⅰ抗體水平為陰性。

又一方面，本發明實施例提供了上述檢測ⅰ群禽腺病毒抗體的間接elisa試劑盒在檢測ⅰ群禽腺病毒抗體中的應用。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

本發明的間接elisa試劑盒，使用favⅰ重組六鄰體蛋白(hexon)作為包被抗原，該重組六鄰體蛋白易於製備和純化，其免疫反應性良好；該重組六鄰體蛋白純化後作為包被抗原，其濃度易於確定和控制，有利於該試劑盒的大量生產與成本控制。

本發明的試劑盒用於檢測ⅰ群禽腺病毒的抗體，具有高效、靈敏特異性和重複性均良好的優點，該試劑盒操作簡便、快速、成本低廉，適合於在臨床應用中進行推廣，為ⅰ群禽腺病毒的快速檢測提供可靠的技術手段。

附圖說明

圖1是本發明實施例1提供的pet-28a-hexon/b2l表達菌陽性單克隆鑑定核酸瓊脂糖凝膠電泳圖(圖中，m是dm2000plusdnamarker，1是hexon基因擴增產物，2是pet-28a-hexon雙酶切分析)；

圖2是本發明實施例1提供的favⅰhexon重組蛋白的誘導表達及表達形式的分析和純化圖(圖中，m是廣譜蛋白marker，1是未誘導pet-28a-hexon，2是誘導5h的pet-28a-hexon，3是pet-28a-hexon菌體裂解上清，4是pet-28a-hexon菌體裂解沉澱，5是純化的hexon重組蛋白)；

圖3本發明實施例1提供的westernblot鑑定圖(圖中，m是預染蛋白marker，1是favⅰ陽性血清，2是spf雞血清)。

具體實施方式

為更進一步闡述本發明為達成預定發明目的所採取的技術手段及功效,以下以較佳實施例，對依據本發明申請的具體實施方式、技術方案、特徵及其功效，詳細說明如後。下述說明中的多個實施例中的特定特徵、結構、或特點可由任何合適形式組合。

實施例1

1.favⅰhexon蛋白(hexon指六鄰體蛋白)表達載體的構建：

提取favⅰcelo毒株(cvccav208)(購自中國獸藥監察所)的基因組dna，設計合成引物hexonf:5′-cgcggatccatgactgcgcttactcccga-3'(下劃線為bamhi酶切點)，hexonr:5'-ccgctcgagccgctcgagcgccagcatgtactggtaac-3'(下劃線為xhoi酶切位點)，擴增獲得hexon基因擴增產物，擴增產物長度為1017bp，其核苷酸序列詳見seq.id.no.1，膠回收hexon基因目的片段(擴增產物)，連接克隆載體peasy-tl，16℃連接過夜，連接產物轉化trans5α克隆感受態細胞，並塗布至卡那黴素抗性(100mg/ml)的lb平板，於37℃培養過夜，挑取單克隆，於卡那黴素抗性的lb培養基中振蕩培養10h後，提取質粒，酶切鑑定；

選取鑑定正確的peasy-t1-hexon質粒，pet-28a空質粒，分別用bamhi和xhoi雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收pet-28a載體條帶和hexon基因目的條帶，將回收產物16℃連接過夜；連接產物轉化trans5α克隆感受態細胞，常規化選取陽性克隆，提取菌體質粒酶切鑑定，鑑定為陽性質粒送公司測序；將測序正確的重組質粒命名為pet-28a-hexon，如圖1所示。

2.重組質粒的誘導表達

將構建正確的重組質粒pet-28a-hexon轉入大腸桿菌感受態細胞bl21，常規化選取陽性克隆，提取菌體質粒酶切鑑定，陽性質粒命名為pet-28a-hexon/bl21，按體積分數1％轉接至5ml新鮮含卡那黴素抗性的lb培養基，振蕩培養至對數生長期(3.5h左右)，加入0.1％iptg進行誘導，繼續誘導培養5h，取1ml菌液，4℃、12000r/min離心5min收集沉澱，加入100μlpbs(磷酸緩衝液)重懸菌體後，加入25μlsds-page上樣緩衝液，沸水煮10min，12000r/min離心10min，進行sds-page電泳分析，電泳結果參照蛋白分子質量標準，可見誘導表達獲得蛋白大小為37.4ku，如圖2所示，與預測結果相符，證明該重組質粒在大腸桿菌中得到了誘導表達；

取1ml誘導5h的菌液，8000r/min離心5min收集菌體沉澱，加入100μlpbs重懸，超生裂解，4℃、12000r/min離心10min離心分離上清液和包涵體，用sds-page上樣緩衝液分別處理上清液和沉澱，進行sds-page電泳分析，由電泳結果可見重組hexon蛋白已在沉澱中表達。

3.favⅰ重組hexon蛋白的westernblot試驗

取誘導後5h菌液進行page-sds電泳，將電泳後的page-sds電泳凝膠，不經染色，直接用轉印裝置將蛋白以150ma轉印到padf膜上，轉印1.5h，轉膜完畢後，小心取出padf膜，在tbst中漂洗一下，置於封閉液(含2.5％脫脂奶粉的tbst)中室溫封閉1h(緩慢搖動)；棄封閉液，溫育後的padf膜用tbst洗3次，每次10min，把padf膜放入用封閉液合適比列稀釋的一抗(favⅰ陽性血清)中，4℃孵育過夜(緩慢搖動)，棄一抗，孵育後的padf膜tbst洗3次，每次10min，把padf膜放入用封閉液稀釋的二抗(酶標抗雞lgg二抗)，平穩搖動，室溫孵育1h。棄二抗，用padf膜用tbst洗3次，每次10min，按照eeclwesternblotkit說明書進行顯色，暗室壓片曝光。

4.重組hexon蛋白的純化復性

將pet-28a-hexon/bl21加入5mllb培養基，活化培養過夜，取5ml菌液加入500mllb培養基中，培養至對數期，加入0.1％iptg(iptg是指異丙基硫代半乳糖苷，一種誘導劑)後，誘導培養5h，收集菌液5000rpm離心10min，棄上清，再加入200mlpbs(磷酸鹽緩衝液，ph＝7.4)重懸，再次5000rpm離心10min，棄上清；將加入50ml的細菌裂解液重懸菌體，超生破碎，12000rpm離心10min，收集沉澱；用包涵體洗滌液重懸沉澱，12000rpm離心10min，棄上清，共洗3次；加入5ml的含8mol/l尿素的包涵體溶解液，室溫溶解30min，12000rpm離心10min，取上清用0.45μm濾器過濾，加入到proteinisoni-nta進行純化，用180mmol/l的咪唑進行洗滌，收集1ml洗滌液，用300mmol/l的洗脫液進行洗脫，每次收集1ml的洗脫液，連收集10次，經sds-page檢驗，可見純化效果良好，該蛋白易於製備和純化；

將一定量的蛋白裝入截留分子質量為15ku的透析袋中，用不同濃度的尿素(6，4，2和1mol/l)的透析液a、透析液b(20mmol/ltris-hci，0.6mmol/ll-精氨酸，10％甘油，2mmol/ledta，0.5mol/l尿素，ph8.0)和透析液c(20mmol/ltris-hci，25mmol/lnac1，0.2mol/l尿素)中進行蛋白的梯度復性，共六個階段，每個階段12h，於4℃緩慢的磁力攪拌；透析結束，收集復性蛋白，並用微量蛋白濃度測量儀測定蛋白濃度為1mg/ml，可見該蛋白易於純化復性。

5.樣品包被液、稀釋液、洗滌液、終止液的配製

包被液為0.05m碳酸鹽緩衝液：na2co31.59g，nahco32.93g，加蒸餾水定容至1000ml，ph為9.6；

樣品稀釋液為含50g/l脫脂奶粉的洗滌液；

洗滌液為含0.05％tween-20的0.01mph為7.4的磷酸鹽緩衝液，其配方為：

nacl：8.5g，nah2po4·2h2o：0.356g，nah2po4·12h2o：2.772g，將其混合後，再用蒸餾水溶解並定容至1000ml，再向其中加入0.5ml吐溫-20得到上述洗滌液；

終止液為含2m硫酸溶液：將21.8ml濃硫酸稀釋定容至200ml得到上述2m硫酸溶液。

6.抗原(重組hexon蛋白)的最適包被濃度和血清的最適稀釋度的確定

採用正交試驗來確定抗原最適包被濃度，血清最適稀釋度和酶標二抗最佳工作濃度；將純化復性後的重組hexon蛋白用包被液依次稀釋為2.5μg/ml、5.0μg/ml和7.5μg/ml三個稀釋度，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反應板中，組成方陣，4℃包被過夜；棄去抗原液，用洗滌液充分洗滌3次，300μl/孔，5min/次，用50g/l脫脂乳封閉，200μl/孔，37℃作用1h；棄去封閉液，用上述方法進行洗滌；將favⅰ陰、陽性血清一次做1:50、1:100、1:200、1:400倍稀釋後，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反應板中，37℃作用1h；棄血清，用上述方法洗滌，加入1:5000倍稀釋的酶標二抗，以100μl/孔的量滴加到96孔聚苯乙烯微量反應板中，於37℃作用1h；棄去酶標二抗，用上述方法洗滌，加入底物顯色液，100μl/孔，37℃避光顯色10min，最終加入終止液終止反應；用酶標儀在450nm波長下測定od值；比較陰、陽性血清的od450值，即選擇陽性樣品od450值(p值)約為1.0，陰性樣品od450值(n值)在0.1左右，並且p/n值最大時為最佳抗原包被濃度及血清和二抗稀釋度。

正交試驗結果顯示當抗原的稀釋度為5.0μg/ml每孔，血清以1:200倍稀釋，酶標二抗以1:5000倍稀釋時，陽性樣品od450值(p值)約為1.0，陰性樣品od450值(n值)在0.1左右，並且p/n值為9.31最大，因此確定重組hexon蛋白的最佳包被濃度為5.0μg/ml，血清最佳稀釋度為1:200，酶標二抗最佳稀釋度為1:5000，下述表1為間接elisa正交試驗結果。

7.作用時間的優化

以抗原、血清和酶標二抗最佳作用濃度為基礎，優化抗原的最佳封閉時間(37℃1h、1.5h和2h)、血清反應時間(37℃0.5h、1h、1.5h)、酶標二抗最佳孵育時間(37℃0.5h、1h、1.5h)以及最佳顯色時間(37℃，10min、20min、30min)等條件，取陽性樣品od450值(p值)約為1.0，陰性樣品od450值(n值)在0.1左右，並且p/n值最大時，為最佳的作用時間，最終確定抗原的最佳封閉時間為1h，血清反應時間為1h，酶標二抗最佳孵育時間為1h，最佳顯色時間為10min。

8.陰、陽性標準臨界值的確定

取50份favⅰ抗體為陰性的血清樣品，按照確定的條件進行間接elisa，用酶標儀在450nm波長下測定od值，計算od450的平均值及標準方差(s)，為消除每次間接elisa檢測時，試驗環境及操作的影響，每次檢測時加入標準陽性血清和標準陰性血清作為對照，陽性血清od450約等於1.0，否則結果無效；經計算，50份陰性血清od450值的平均值標準差s≈0.061，因此間接elisa陰陽性臨界值因此，當樣品od450值≥0.322時，判定favⅰ抗體水平為陽性，當od450值＜0.322時，判定favⅰ抗體陰性。

9.間接elisa操作程序的確定(試劑盒的檢測方法的確定)

按照以上各項所確定的最佳操作條件，確定間接elisa操作程序為：取出已包被並封閉好的elisa板條，用血清稀釋液將待檢血清做1：200倍稀釋，加入酶標板各孔，每孔100μl，各加一孔，favⅰ陰性、陽性血清各加兩孔，37℃作用1h；棄去孔內液體，每孔用300μl洗滌液洗滌3次，每次5min，最後一次洗滌完後，在吸水紙上拍打，棄盡孔內液體；每孔加入100μl酶標二抗，37℃作用1h；棄去孔內液體，每孔用300μl洗滌液洗滌3次，每次5min，最後一次洗滌完後，在吸水紙上拍打，棄盡孔內液體；每孔加入100μltmb(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)底物顯色液後，室溫避光顯色10min，加入100μl終止液；用酶標儀在450nm波長讀取各孔od值，判定結果。

表1.間接elisa正交試驗結果

實施例2

elisa試劑盒的特異性試驗：

按已建立的間接elisa操作方法，利用elisa試劑盒分別檢測已知的i群禽腺病毒、雞新城疫、禽流感、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸桿菌陽性血清樣品；用酶標儀在450nm波長下測定各孔od值，確定該間接elisa檢測方法的特異性；

檢測結果表明，只有favⅰ陽性血清的od450>0.322，其他各分血清od450在0.112-0.201之間，遠小於0.322，說明該間接elisa檢測結果特異性良好。

實施例3

elisa試劑盒同批內的重複試驗：

使用同批誘導純化製備的favⅰhexon重組蛋白，按照最佳包被濃度包被酶標板，用已建的間接elisa操作方法，檢測favⅰ抗體水平不同的陽性血清和favⅰ陰性血清各3份，在不同時間分別檢測該6份隨機選擇的血清，用酶標儀在450nm波長下測定od值；根據每孔的od450值，計算各份血清的平均值標準差s，變異係數cv；檢測結果顯示，6份血清od450值的變異係數在1.2％-3.5％之間，說明同批favⅰhexon重組蛋白檢測結果重複性良好。

實施例4

elisa試劑盒批間重複性實驗：

使用不同批次純化復性後的favⅰhexon重組蛋白，按照最佳抗原包被濃度包被酶標板，用已建立的間接elisa操作方法，檢測同1份favⅰ陽性血清和1份favⅰ陰性血清，每孔設置4個重複，用酶標儀在450nm波長下測定od值；根據每孔的od450值，計算各份血清的平均值標準差s，變異係數cv；檢測結果顯示，2份血清od450值的變異係數在5.1％-8.3％之間，說明不同抗原檢測重複性良好。

本發明的間接elisa試劑盒，使用favⅰ重組hexon蛋白作為包被抗原，該重組hexon蛋白易於製備和純化，其免疫反應性良好；該重組hexon蛋白純化後作為包被抗原，其濃度易於確定和控制，有利於該試劑盒的大量生產與成本控制。

本發明的試劑盒用於檢測ⅰ群禽腺病毒的抗體，具有高效、靈敏特異性和重複性均良好的優點，該試劑盒操作簡便、快速、成本低廉，適合於在臨床應用中進行推廣，為ⅰ群禽腺病毒的快速檢測提供可靠的技術手段

本發明實施例中未盡之處，本領域技術人員均可從現有技術中選用。

以上公開的僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應以上述權利要求的保護範圍為準。

sequencelisting

楊凌職業技術學院，興平市眾和現代生態農牧有限公司

檢測ⅰ群禽腺病毒抗體的間接elisa試劑盒及其檢測方法及其應用

1

1

1017

dna

ⅰ群禽腺病毒favⅰ

1

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