快速測定盾葉薯蕷中甲基原薯蕷皂苷含量的方法與流程
2023-08-07 02:01:21 3
本發明屬於醫藥技術領域，涉及運用高效液相色譜串聯三重四級杆質譜快速測定盾葉薯蕷中甲基原薯蕷皂苷含量的方法。
背景技術：
盾葉薯蕷俗稱黃姜、火頭根，為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）植物盾葉薯蕷Dioscorea zingiberensis C. H. Wright的根狀莖橫生，近圓柱形。以根狀莖入藥，甘、苦、平。解毒消腫，用於癰癤早期未破潰，皮膚急性化膿性感染，軟組織損傷，蜂螫蟲咬。盾葉薯蕷根莖富含皂苷類成分，因其組分複雜，且分離過程難度較大，難以定量，目前只能以總皂苷經酸水解，得到皂苷元的含量為測定指標來控制盾葉薯蕷的質量。近代藥理學研究表明，盾葉薯蕷總皂苷有抗腫瘤、抗血栓形成、抗過敏、抗病毒和抗休克作用。且盾葉薯蕷總皂苷中甲基原薯蕷皂苷的含量影響其質量和作用效果。目前，甲基原薯蕷皂苷的含量測定僅有為HPLC法，提取方法複雜，費時，且其僅在近200nm處有較弱的紫外吸收，易產生幹擾。對盾葉薯蕷中甲基原薯蕷皂苷質譜快速定量方法尚未見報導。
本發明採用MRM方法，解決了甾體皂苷類化合物沒有共軛結構，吸收波長處於紫外末端吸收，以往HPLC檢測基線不穩，靈敏度較低，不易測定的問題。同時，盾葉薯蕷根莖中化學成分複雜，且皂苷化學結構比較相近，極性較大，HPLC法測定需採用長時間的梯度洗脫程序。本方法對待測成分的分離要求不高，因此大大縮減了洗脫時間，簡化了操作步驟，為盾葉薯蕷的成分分析、質量評價提供指導意義和科學基礎。
技術實現要素：
本發明建立了HPLC-QqQ-MS法，以甘草次酸為對照，採用多級反應監測（MRM）法，測定盾葉薯蕷中甲基原薯蕷皂苷的含量。它是採用SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18（150 mm×4.6 m，5μm）色譜柱，流動相：乙腈：水（70：30），等度洗脫：8min；進樣量：10μL；柱溫：40℃；流速0.5mL/min；掃描方式為多級反應監測（MRM）模式，離子源為ESI（Turbo Spray）源，負離子化方式檢測，離子源電壓為5.5kV；加熱毛細管溫度為400℃；CAD為5；簾氣為10；Gas1為45；Gas2為45；去簇電壓為-114V。用於定量分析的離子反應為m/z 1061.6→915.5（甲基原薯蕷皂苷）、m/z 469.3→425.3（外標甘草次酸）。結果：採用液質聯用法測得, 甲基原薯蕷皂苷質量濃度在9～60μg·mL-1內，線性關係良好，R2 0.9998，平均加樣回收率為90.6%。結論: 所建立方法快速、簡便、準確、重現性好，可用於盾葉薯蕷提取物質量控制。
為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容：
一種測定盾葉薯蕷中甲基原薯蕷皂苷含量的方法，其特徵在於採用高效液相色譜串聯三重四級杆質譜法，快速測定盾葉薯蕷中甲基原薯蕷皂苷的含量，按如下步驟進行：
（1）對照品、內標溶液製備：稱取甲基原薯蕷皂苷對照品及甘草次酸對照品各5.0mg分別置於5mL容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，配製成濃度為1mg/mL的儲備液，4℃保存備用；
（2）供試品溶液製備： 取盾葉薯蕷乾燥根莖粉末1g精密稱定。加入甲醇25mL, 超聲波處理30min後離心。上清液過微孔濾膜, 濾液即HPLC-QqQ-MS法測定用的供試溶液；
（3）測定：
分別精密吸取步驟（1）得到的對照品溶液各10μL，步驟（2）提取的供試品溶液10μL，注入HPLC-MS/MS聯用儀，測定。多級反應檢測模式進行掃描，鎖定甲基原薯蕷皂苷結構，用外標法計算甲基原薯蕷皂苷含量。
本發明中，更加詳細的製備方法及測定方法如下：
1.儀器與試藥
1.1儀器 LC-20AD液相色譜系統，配備SIL-20AC自動進樣系統和CTO-20A柱溫箱（日本島津公司）；API 4000 三重四級杆檢測器，操作軟體為Analyst 1.5.1（美國應用生物系統有限公司）；AL104-1C萬分之一電子天平(瑞士Mettler Tolido公司)；AB 135-S十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Tolido公司）；KQ－100DE型數控超聲波清洗器（崑山市超市儀器有限公司）； Direct-Q3純水機 (美國Millipore)。
1.2試藥 對照品甲基原薯蕷皂苷（批號：130205） 購於四川省維克奇生物科技有限公司 純度>98% 對照品甘草次酸（批號：Z110723）購於上海源葉生物科技有限公司 純度>98%
乙腈、甲醇為（色譜純，TEDIA） 超純水經Milli-Q系統純化製備。
2.方法與結果
2.1色譜及質譜條件 色譜柱：SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18柱（日本島津公司產品，規格：150 mm×4.6 mm，柱內徑：5μm）。流動相：乙腈：水（70：30），等度洗脫：8min。進樣量：10μL；柱溫：40℃；流速0.5mL/min。掃描方式為多級反應監測（MRM）模式，離子源為ESI(Turbo Spray)源，負離子化方式檢測，離子源電壓為5.5kV；加熱毛細管溫度為400℃；CAD為5；簾氣為10；Gas1為45；Gas2為45；去簇電壓為-114V。待測成分和外標離子對質量數及碰撞能量優化結果見表1。
表1 甲基原薯蕷皂苷及外標的MRM參數
2.2溶液的製備
2.2.1對照品溶液的製備：差量法精密稱取甲基原薯蕷皂苷對照品及甘草次酸對照品各5.0mg分別置於5mL容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，配製成濃度為1mg/mL的儲備液，4℃保存備用；
2.2.2供試品溶液的製備：取盾葉薯蕷乾燥根莖粉末1g精密稱定。加入甲醇25mL, 42kHz超聲波處理30min, 5000r·min-1離心5min。上清液過0.45μm微孔濾膜濾過, 濾液即為HPLC-MS/MS法測定用的供試溶液；
2.3方法學考察
2.3.1線性範圍考察 精密吸取甲基原薯蕷皂苷對照品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至各濃度（分別為9.0，18.0，30.0，36.0μg·mL-1)。精密吸取各個濃度10μL, 依次進樣,以進樣濃度(μg·mL-1)為橫坐標, 待測品色譜峰面積與外標峰面積比值為縱坐標, 繪製標準曲線, 甲基原薯蕷皂苷回歸方程見表2。
表2 甲基原薯蕷皂苷的線性考察
結果表明，甲基原薯蕷皂苷回歸方程線性關係良好，線性範圍為9～60μg·mL-1。
2.3.2定量限和檢測限的測定 取2.2.1項下甲基原薯蕷皂苷對照品溶液1 mL，逐級稀釋，並依次進樣10 μL，以S/N=3求得各個組分的檢測限，以S/N=10求得各個組分的定量限，結果見見表2。
2.3.3 精密度試驗 取2.2.2項下樣品，連續進樣6次，測定峰面積平均值，計算精密度RSD值。
2.3.4 重複性 稱取盾葉薯蕷藥材粉末6份，按2.2.2項下方法製備供試品溶液，測定峰面積，計算含量平均值及RSD值。
2.3.5 穩定性 取2.2.2項下製得的供試品溶液，置4℃冰箱存放。分別於0，6，12，18，24 h進樣分析，測定峰面積，計算穩定性RSD值。
2.3.6 加樣回收率考察 精密稱取盾葉薯蕷藥材粉末6份，加入對照品甲基薯蕷皂苷1.7mg，按2.2.2項下方法製備溶液，進樣分析，計算回收率為90.6%，RSD為2.3%。
4. 樣品測定 按1.2項下對樣品進行含量測定，MRM質譜圖見圖1。按外標法計算甲基原薯蕷皂苷的含量，結果見表3。
表3 甲基薯蕷皂苷含量測定
3. 流動相及質譜檢測方法的確定
3.1 皂苷類成分極性偏大，因此本實驗考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－酸水和乙腈－酸水不同的溶劑系統，以及60%，70%，80%，90%四種比例等度洗脫 及梯度洗脫。結果表明80%乙腈－水系統的分離效果較好，使得峰形良好，且出峰時間適中，相對於梯度洗脫更穩定、簡便。因此本實驗選擇梯80%乙腈－水系統度洗脫方式。
3.2 本實驗採用MRM方法，解決了甾體皂苷類化合物沒有共軛結構，吸收波長處於紫外末端吸收，以往HPLC檢測基線不穩，靈敏度較低，不易測定的問題。同時，盾葉薯蕷根莖中化學成分複雜，且皂苷化學結構比較相近，極性較大，HPLC法測定需採用長時間的梯度洗脫程序。本方法對待測成分的分離要求不高，因此大大縮減了洗脫時間，簡化了操作步驟，為盾葉薯蕷的成分分析、質量評價提供指導意義和科學基礎。
本發明公開的測定盾葉薯蕷中甲基原薯蕷皂苷含量方法的優點在於：
（1）經摸索建立了薯蕷皂苷的高效液相色譜串聯三重四級杆質譜（HPLC-QqQ-MS）測定法。研究表明，選用此方法，解決了甾體皂苷類化合物沒有共軛結構，吸收波長處於紫外末端吸收，以往HPLC檢測基線不穩，靈敏度較低，不易測定的問題。
（2）經方法學考察證明，本方法操作簡便、準確，重現性好，可用於盾葉薯蕷的成分分析及質量評價。