氨(離子)診斷/測定試劑盒及氨(離子)的濃度測定方法
2023-08-07 09:29:16
專利名稱：氨(離子)診斷/測定試劑盒及氨(離子)的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定氨 (離子)濃度的方法，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應 用最多的方法是酶法和基於離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴散法是標本鹼化後，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler 反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要鹼化，內源性的氨形成 造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比 擴散法更準確，CV為8X 13X;離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表 面，引起電極的PH發生變化進行測定，該方法的CV為3.5X 4.8X，回收 率高。結合具體實際，應以酶法測定為實用。
檢索中國專利，僅查出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯， 卻未發現比較理想的血氨測定方法。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，計量還原型 煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨(離 子)濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的氨(離子)診斷/ 測定試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分 析儀上進行氨(離子)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得 到切實的推廣應用。
4本發明氨(離子)濃度測定方法原理如下
氨離子+穀氨酸+腺苷三磷酸穀氨醯胺合成酶穀氨醯胺+
腺苷二磷酸+磷酸根
磷酸根+肌苷 5'-核苷酸酶肌苷單磷酸+水 肌苷單磷酸+輔酶次黃苷單磷酸脫氫酶黃苷單磷酸+
還原型輔酶
這種方法應用穀氨醯按合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶) 聯5，-核苷酸酶(5'-Nucleotidase; EC 3.1.3.5)、次黃苷單磷酸脫氫酶(Inosine 5-phosphate dehydrogenase; EC 1.1丄205)酶促反應終點法。穀氨醯按合成酶 酶解氨(離子)反應產生磷酸根，再通過(偶)聯合5'-核苷酸酶、次黃苷單 磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型 輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度 上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算氨(離子)的 濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明氨(離子)診斷/測定試劑
盒較為理想
緩衝液 100mmol/L
穩定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
穀氨醯按合成酶 10000 U/L
5'-核苷酸酶 12000 U/L
次黃苷單磷酸脫氫酶 12000 U/L
穀氨酸 8 mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
肌苷 5 mmol/L
本發明的氨(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷 酸脫氫酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷。 試劑2
緩衝液、穩定劑、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫 氫酶。
輔酶、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、穀氨酸、腺 苷三磷酸、肌苷在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀 態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷。 試劑2
緩衝液、穩定劑、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫氫酶。 試劑3
緩衝液、穩定劑、穀氨醯按合成酶。 輔酶、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是 乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定氨(離子)濃度的方法，其輔酶 可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液100 mmol/L
穩定劑500 mmoI/L
輔酶3 mmol/L
穀氨醯按合成酶10000U/L
5'-核苷酸酶12000U/L
次黃苷單磷酸脫氫酶12000U/L
穀氨酸8 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
肌苷5 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用前， 加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間0分鐘，檢測 時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測主波長340rnn吸光度上升的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大
實施例二
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定齊ij 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
穀氨酸 8 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
肌苷 5 mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000 U/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑
穀氨醯按合成酶 5'-核苷酸酶 次黃苷單磷酸脫氫酶 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑 1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間0 分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
實施例三
本實施例的氨(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
8 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
肌苷 5 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 穩定劑 5'-核苷酸酶 次黃苷單磷酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 穩定劑
穀氨醯按合成酶
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定氨(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37X:，反應時 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測氨(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為正反應(上升反應)，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘左右。
100 mmol/L 500腿ol/L 12000 U/L 12000 U/L
100mmol/L 500 mmol/L 10000U/L加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀
下，檢測主波長340nrn吸光度上升的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大 小。
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達 到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0016;吸光 度時間反應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(RX).99)線形範圍 可達2.0mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過士 6%;試劑測 試的精密度(重複性)的變異係數(CV)《3%;試劑的靈敏度可達0.65 ± 0. 2AA/mmol/L——本發明靈敏度高、精確度好，線形範圍寬廣，足以便於 推廣應用。
權利要求
1. 一種酶比色法及酶聯法的氨(離子)的濃度測定方法，其方法原理如下氨離子+穀氨酸+腺苷三磷酸 穀氨醯胺合成酶 穀氨醯胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+肌苷 5』-核苷酸酶 肌苷單磷酸+水肌苷單磷酸+輔酶 次黃苷單磷酸脫氫酶 黃苷單磷酸+還原型輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出氨(離子)的濃度大小測定結果。
2. —種氨(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩衝液20——500 mmol/L穩定劑1——-4000 mmol/L輔酶1——6 mmol/L谷氮醯按合成酶1000-——80000 U/L5'-核苷酸酶1000-——80000 U/L次黃苷單磷酸脫氫酶1000-——80000 U/L穀氨酸l一50 mmol/L腺苷三磷酸l一50 mmol/L肌苷l一50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限於上述範圍；在此範圍內效果較好，在此範 圍外，試劑仍會反應作用。其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也 可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸 脫氫酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、 穩定劑、輔酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷組成；試劑2，由緩衝液、穩 定劑、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫氫酶組成。輔酶、 穀氨醯按合成酶、 ，-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫氫酶、穀氨酸、腺苷三磷 酸、肌苷在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸 脫氫酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷組成多劑試劑；試劑1，由緩衝液、 穩定劑、輔酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷組成；試劑2,由緩衝液、穩 定劑、5'-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定 齊"穀氨醯按合成酶組成。輔酶、穀氨醯按合成酶、5'-核苷酸酶、次黃苷 單磷酸脫氫酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷在試劑l、試劑2或試劑3中 的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括 穩定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定氨(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、輔酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、肌苷、穀氨醯按合成酶、5』-核苷酸酶、次黃苷單磷酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464383SQ20071019217
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優先權日2007年12月19日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司