一種毛細管整體柱及在固定化胰酶中的應用的製作方法

2023-08-07 18:17:16

專利名稱：一種毛細管整體柱及在固定化胰酶中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及功能材料及蛋白質高通量酶解，具體地說是一種毛細管整體柱及在固定化胰酶中的應用。
背景技術：
在研究蛋白質組學的各種方法中，大部分都需要對蛋白質進行高效的酶解以便將蛋白質切割成適合CID[文獻 1. Jolene K. Diedrich and Ryan R. Julian. Anal. Chem. 2010， 82,4006-4014.,文 M 2. Kumaran Kandasamy, AkhileshPandey. Anal. Chem. 2008,80, 4825-4835. ]，MALDI [文獻 3. Michel Salzet, and Isabelle Fournier. Anal. Chem. 2009, 81,8193-8202.], ETD[ JC ^ 4. JackSimons. Chemical Physics Letters. 2010,484, 81-95.]，等具有不同裂解方式的質譜分析和鑑定的肽段。因此，蛋白質酶解流程的優化成為一個熱點領域，其中如何提高酶解流程的通量從而提高酶解的重複性，準確性以及實現在線化是這個領域的關鍵問題。最常用的方法就是將胰酶固定在各種材料上。納米離子 [文獻 5. Hubert H. Girault, and Baohong Liu. Molecular&Cellular Proteomics. 2007, 6，1似8-1436·]、膜[文獻 6.Yan Li ,and Cheng S. Lee. Anal. Chem. 2003，75，1067-1074·]、 整體柱[文獻 7. Gabriele Caccialanza，and Gabriella Massolin. Anal. Chem. 2007, 79, 355-363.]等材料都可以用來實現胰酶的固定化。目前，各種基質的整體柱被合成並用於胰酶的固定化。但是，酶解底物和產物在整體柱基質上的殘留成為一個嚴重的問題，極大的幹擾了整個分析流程的準確性和重複性。 現行的方法是在整體柱基質的表面通過光聚合的方法塗上一層親水的分子，例如，PEG[文獻 8. Timothy C. Logan andDouglas S. Clark. Anal. Chem. 2007,79,6592-6598. ；Nathan A. Lacher, andFrantisek Svec. Anal. Chem. 2009，81，2004-2016.]，從而減少非特異性吸附的發生。聚(丙烯醯胺，N, N-雙甲基丙烯醯胺)基質是一種親水性、生物相容性較好的聚合物材料。在這裡，通過熱聚合方法和選擇合適的單體聚合比例和致孔劑系統，在毛細管內發展一種製備聚(丙烯醯胺，N, N-雙甲基丙烯醯胺)基質整體柱的新方法，並成功用於胰酶固定化從而實現酶解的高通量。

發明內容
本發明的目的在於在毛細管內製備一種以親水性為特徵的用於胰酶固定化的毛細管整體柱。本發明藉由以下技術措施實現一種毛細管整體柱，採用丙烯醯胺和N，N-雙甲基丙烯醯胺兩種功能單體，通過熱聚合在刻蝕處理過的石英毛細管內通過原位共聚合製備成具有特定孔徑範圍的具有親水表面的整體材料，整體材料孔表面經過轉醯胺化處理後，得毛細管整體柱，其可以連接上胰蛋白酶，並作為微酶反應器使用。所述的毛細管整體柱的製備是，將丙烯醯胺，N, N-雙甲基丙烯醯胺，1,4- 丁二醇，二甲基亞碸，十二醇和偶氮二異丁腈按照適當比例混合。隨後將一部分溶液導入經過氫氟酸刻蝕的毛細管內。兩端用矽膠封口並在水浴鍋內反應一段時間。通過轉醯胺化反應實現表面胺基活化。胰酶的固定化通過戊二醛耦聯實現。具體製備過程如下，(1)預聚溶液的配置20-40mg丙烯醯胺，20_60mg N，N-雙甲基丙烯醯胺， 100-400mg 1,4- 丁二醇，100_500mg 二甲基亞碸，100_250mg 十二醇和 0. 5_3mg 偶氮二異丁腈；(2)整體材料的製備將預聚溶液超聲後，通氮氣去除溶液中的溶解氧；導入經過氫氟酸刻蝕的毛細管內，封口，並在60°C下，引發聚合，聚合時間2小時後用純乙腈或甲醇和純水分別衝出致孔劑；(3)整體材料的修飾首先通過轉醯胺化反應將惰性的醯胺鍵活化將整體柱內充滿98%的乙二胺， 90°C反應3小時，最後用純水和50mM碳酸氫銨緩衝液將剩餘的乙二胺從整體柱內衝洗乾淨；其次，在活化後的整體柱內通入25%戊二醛，在室溫下反應6小時，隨後用純水和 50mM碳酸氫銨緩衝液將剩餘的乙二胺從整體柱內衝洗乾淨；得毛細管整體柱。功能單體丙烯醯胺與N，N-雙甲基丙烯醯胺的質量比為1 1;為了完成反應，也需要加入佔預聚溶液的總質量約90%的制孔劑和佔單體溶液的總質量約的引發劑。多孔材料的孔徑範圍為IOOnm lOOOnm。所述的毛細管整體柱可在固定化胰酶中的應用；胰酶固定過程在整體柱內持續通入1 ang/mL的胰酶，50mM苯甲眯和3 5mg/ mL腈基硼氰化鈉的混合溶液，在4°C下反應M小時，從而實現胰酶的固定化。本發明的優點如下本發明的材料藉助了丙烯醯胺和N，N-雙甲基丙烯醯胺的親水性，降低了毛細管整體柱材料對於底物的非特異性吸附，並首次在這種整體柱上實現了胰酶的固定化。


圖1 聚(丙烯醯胺，N, N-雙甲基丙烯醯胺)毛細管整體柱電鏡圖.放大倍數 (A)X2000， (B)X5000。圖2 流速對反壓的影響.條件流動相，乙醇.其它條件在表1中描述。圖3 =BSA MALDI-T0F質譜圖，分別通過製備的固定化酶反應器㈧和自由溶液酶解。圖 4:0.1mg/mL BSA MALDI-T0F 質譜圖· Oh 和酶解 6h 後。5cm，250 μ m. i. d 固定化酶反應器；室溫；500nL/min。圖5 大腸桿菌蛋白酶解質譜圖。
具體實施方式
通過實驗發現當丙烯醯胺的量大於或遠小於N，N-雙甲基丙烯醯胺的量時，製備而成的整體柱沒有良好的通透性。實施例11.預聚溶液的配置35mg丙烯醯胺，40mg N, N-雙甲基丙烯醯胺，150mg 1,4- 丁二醇，330mg 二甲基亞碸，185mg十二醇和0. 8mg偶氮二異丁腈。2.整體材料的製備將預聚溶液超聲後，通氮氣去除溶液中的溶解氧。將一部分溶液導入經過氫氟酸刻蝕的毛細管內。兩端用矽膠封口，並在60°C下，引發聚合。聚合時間2小時後用純乙腈和水衝出致孔劑。3.胰酶固定首先通過轉醯胺化反應將惰性的醯胺鍵活化將整體柱內充滿98%的乙二胺， 90°C反應三小時，最後用純水和50mM碳酸氫銨緩衝液將剩餘的乙二胺從整體柱內衝洗乾淨。其次，在活化後的整體柱內通入25%戊二醛，在室溫下反應6小時，隨後用純水和50mM 碳酸氫銨緩衝液將剩餘的乙二胺從整體柱內衝洗乾淨。最後，在整體柱內持續通入ang/mL 的胰酶，50mM苯甲眯和5mg/mL腈基硼氰化鈉的混合溶液，在4°C下反應M小時，從而實現胰酶的固定化。實驗條件表1 實驗溫度M 25°C ；聚丙烯醯胺整體柱39cm，250 μ m. i. d表1.聚丙烯醯胺基質滲透性考察
權利要求
1.一種毛細管整體柱，其特徵在於採用丙烯醯胺和N，N-雙甲基丙烯醯胺兩種功能單體，通過熱聚合在刻蝕處理過的石英毛細管內通過原位共聚合製備成具有特定孔徑範圍的具有親水表面的整體材料，整體材料孔表面經過轉醯胺化處理後，得毛細管整體柱，其可以連接上胰蛋白酶，並作為微酶反應器使用。
2.根據權利要求1所述的毛細管整體柱，其特徵在於具體製備過程如下，(1)預聚溶液的配置20-40mg丙烯醯胺，20-60mgN, N-雙甲基丙烯醯胺，100_400mg 1,4- 丁二醇，100-500mg 二甲基亞碸，100-250mg 十二醇和 0. 5_3mg 偶氮二異丁腈；(2)整體材料的製備將預聚溶液超聲後，通氮氣去除溶液中的溶解氧；導入經過氫氟酸刻蝕的毛細管內，封口，並在60°C下，引發聚合，聚合時間2小時後用純乙腈或甲醇和純水分別衝出致孔劑；(3)整體材料的修飾首先通過轉醯胺化反應將惰性的醯胺鍵活化將整體柱內充滿98%的乙二胺，90°C反應3小時，最後用純水和50mM碳酸氫銨緩衝液將剩餘的乙二胺從整體柱內衝洗乾淨；其次，在活化後的整體柱內通入25%戊二醛，在室溫下反應6小時，隨後用純水和50mM 碳酸氫銨緩衝液將剩餘的乙二胺從整體柱內衝洗乾淨；得毛細管整體柱。
3.根據權利要求2所述的毛細管整體柱，其特徵在於功能單體丙烯醯胺與N，N-雙甲基丙烯醯胺的質量比為1:1;為了完成反應，也需要加入佔預聚溶液的總質量90%的制孔劑和佔單體溶液的總質量約的引發劑。
4.根據權利要求1所述的毛細管整體柱，其特徵在於多孔材料的孔徑為IOOnm IOOOnm0
5.一種權利要求1所述的毛細管整體柱在固定化胰酶中的應用。
6.按照權利要求5所述毛細管整體柱的應用，其特徵在於胰酶固定過程在整體柱內持續通入1 2mg/mL的胰酶，50mM苯甲眯和3 5mg/mL腈基硼氰化鈉的混合溶液，在4°C下反應M小時，從而實現胰酶的固定化。
全文摘要
一種毛細管整體柱及在固定化胰酶中的應用公開了一種毛細管整體柱及其在固定化胰酶中的應用，將丙烯醯胺，N，N-雙甲基丙烯醯胺，1，4-丁二醇，二甲基亞碸，十二醇和偶氮二異丁腈按照適當比例混合。隨後將一部分溶液導入經過氫氟酸刻蝕的毛細管內。兩端用矽膠封口並在水浴鍋內反應一段時間。通過轉醯胺化反應實現表面胺基活化。胰酶的固定化通過戊二醛耦聯實現。本發明的材料藉助了丙烯醯胺和N，N-雙甲基丙烯醯胺的親水性，降低了毛細管整體柱材料對於底物的非特異性吸附，並首次在這種整體柱上實現了胰酶的固定化。
文檔編號C12N11/08GK102453706SQ20101052295
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月27日 優先權日2010年10月27日
發明者吳帥賓, 張麗華, 張玉奎, 張維冰, 梁振, 王婷婷 申請人:中國科學院大連化學物理研究所