促創傷癒合因子的純化與應用的製作方法

2023-08-07 22:15:06

專利名稱：：促創傷癒合因子的純化與應用的製作方法促創傷癒合因子的純化與應用本發明涉及一種血漿來源的促創傷癒合因子(factorforsupportingwoundhealing)的純化和應用的方法。本發明的具體方面包括純化和在體內和體外保護所述分子免遭降解的方法。
背景技術：
：HGF是一種促創傷癒合因子，它是一種在間充質細胞(例如肺巨噬細胞和成纖維細胞，肝中的枯否細胞，以及白細胞)中表達的蛋白。HGF是一種細胞因子，它在細胞損傷時分泌並殺J見出對某些器官再生和創傷^合是重要的。從化學角度看，HGF是一種糖蛋白，它首先以天然(無活性)的前體形式合成。該前體在受損器官中通過特定活化子被切割成活性HGF。HGF和其他一些因子與肝素結合，這似乎對HGF的激活和它與其受體的結合很重要。結合HGF的受體是c-MET。由於c-MET受體只在受損器官中被下調，所以看來只有這些受損器官中的細胞響應於HGF-受體相互作用。具有肝素結合親和性的生長因子家族中這類影響創傷癒合過程的因子的實例還包括血小板衍生生長因子(Plateletderivedgrowthfactor,PDGF)，表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)，轉化生長因子a(Transforminggrowthfactoralpha,TGF-a)，轉^ffc生長因子P(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-p)，胰島素樣生長因子(Insulinlikegrowthfactor,IGF-I)和成纖維細J^生長因子(Fibroblastgrowthfactor,FGF)。抗凝血酶III(AT-III)是一種血漿糖蛋白，它可以抑制凝血級聯過程中絲氨酸蛋白酶，因此，在凝血調控中起重要作用。AT-III是因子IXa、Xa、XI、XIIa和凝血酶的抑制劑。因此，AT-III在凝血級聯的不同階段調控凝塊的形成。血液中AT-III含量的輕微減少與血栓栓塞風險的增加相關。AT-III濃縮物被用於在獲得性或遺傳性AT-III缺乏患者中預防和治療血栓栓塞疾病。另外，已有報導表明AT-III還參與許多其它生物學反應，例如血管發生和炎症反應。但AT-III在這些機制中的作用尚未完全弄清。以肝素作為固定相結合配基，採用親和色譜純化AT-III的方法是本領域已知的。Miller誦Andersson等(ThrombosisResearch5,439-452，1974)發表了使用肝素-瓊脂糖凝膠純化人AT-III的方法。包括離子交換和凝膠過濾色鐠法的整個過程提供34%的得率。富含組氨酸的糖蛋白(Histidine-richglyc叩rotein，HRGP)是一種單鏈血漿蛋白，最早於1972分離得到。HRGP確切的生理功能仍舊未知。由於它與肝素、纖維蛋白原和纖維蛋白、纖溶酶原和活化血小板的相互作用，HRGP被認為是凝血和纖溶的調節因子(Koide，T.In:Fibrinolysis:CurrentProspects.Gaffney,PJ(Ed.),JohnLibbey&Co.,London1988，p.55-63)。該多肽鏈由507個胺基酸殘基組成，女包含與其他血漿蛋白(如AT-III)同源的區域(Koide,T.etal.(1986)Biochemistry25，2220-2225)。
發明內容促創傷癒合因子的活化形式在體內很快降解，特別是在已觸發凝血和蛋白水解體系(包含蛋白酶)的創傷區域裡。在純化過程中，能夠抑制天然的和活化形式的促創傷癒合因子的降解在體外也是至關重要的。其中一種因子，HGF，已知在血液中作為無活性前體被傳輸，在創傷過程中被特定的活化劑所活化。例如，在幾乎所測試的所有純化方法中都可以檢測到少量無活性(變性)形式的HGF,但是，只有在使用本發明的方法時才能檢測到活化的和/或非活化的形式。令人吃驚的發現除去蛋白酶和/或蛋白酶前體並且共純化HGF的兩種穩定劑(AT-III和/或HRGP)，得到富集的HGF活化和/或非活化形式，其很容易發揮作用或者可以轉化成它的活性形式。由於HGF通常在體內以無活性前體形式循環，因此很顯然天然的和/或活性的HGF藥物產品可以顯著改善許多機體功能障礙的治療，特別是局部應用可行的區域，例如，在創傷癒合過程中。預期對其它具有肝素結合性質的生長因子也是如此，如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子a(TGF-a)、轉化生長因子p(TGF-p)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細胞生長因子(FGF),同時也預期AT-III和HRGP的存在可以改善這些生長因子的純化和應用。根據用途，可提供帶有或不帶兩種特異性穩定劑AT-III和HRGP的所述活化和/或非活化形式的促創傷癒合因子，所述穩定劑充當促創傷癒合因子天然和活化形式的蛋白降解的抑制劑，因此，提高了產品的功效和半衰期。根據用途，在一些情況下，為患者只提供活化或非活化形式的促創傷癒合因子是有利的，而在另外一些情況下，提供包括所選擇的穩定劑AT-III和HRGP在內的其混合物是比較有利的。這取決於要求促創傷癒合因子分子起作用有多快。顯然，這些原則對其他一些與HGF相似的具有肝素結合性質的生長因子也有效，例如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子a(TGF-a)、轉化生長因子p(TGF-p)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細胞生長因子(FGF)。本發明涉及從含有促創傷癒合因子的來源(例如血液)中製備含有純化促創傷癒合因子組合物的方法，其中純化步驟在存在抗凝血酶III(AT-III)、富含組氨酸的糖蛋白(HRGP)或其組合存在的情況下，施。液)的肝細胞生長因子(HepatocyteGrowthFactor,HGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子a(TGF-a)、轉化生長因子p(TGF-P)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細胞生長因子(FGF)組成，其中所述製備過程包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下實施的純化步驟。本發明方法可以按以下步驟實施(i)將冷凍血液解凍，最終除去沉澱並進一步處理上清液，(ii)使上清液在陰離子交換色鐠所需緩衝液中與陰離子交換色鐠材料接觸，所述緩衝液的鹽濃度與生理條件相當，其pH值約中性，大部分的蛋白質都未被結合(包括所述促創傷癒合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)，但是一些特定的蛋白質和蛋白酶結合在陰離子樹月旨上(例如凝血酶原，FX，FIX等)；(m)將所述陰離子交換色譜材料分離出去，得到溶液(包含促創傷癒合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)；(iv)使所述溶液與肝素-親和色鐠材料接觸，而大部分的蛋白質(白蛋白，IgG，轉鐵蛋白，觸珠蛋白等)未被結合；(v)分離出所述溶液，用解吸緩衝液處理肝素-親和色鐠材料，所述解吸緩衝液具有足夠允許所述促創傷癒合因子從所述肝素-親和色鐠材料解吸的離子強度(任選地，在所述促創傷癒合因子級分解吸前用清洗緩衝液處理肝素瓊脂糖材料，所述清洗液具有提高的足以解吸雜質蛋白(例如肝素輔因子II等)但是不解吸所述促創傷癒合因子級分的離子強度)；(vi)收集包含所述促創傷癒合因子、AT-III和HRGP的解吸緩沖液。在第二個可替代方案中，本發明的方法可採用如下步驟進行(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉澱並進一步處理上清液，(ii)加入無機吸附材料，如硅藻土、矽膠、氧化鋁，孵育足夠的時間使之與不想要的物質(例如FXII和激肽釋放酶原激活劑等)結合；(iii)加入低級脂肪醇，如CrQ醇，以形成科恩級分(Cohnfraction)I;(iv)除去所述無機吸附材料，以及，如果沉澱存在，還除去沉澱；(v)使科恩級分I上清液通過親和色鐠材料來對其進行處理，由此使天然的/活性的促創傷癒合因子、AT-III和HRGP(天然的/活性的促創傷癒合因子、AT-III和HRGP，此後被稱為HAH)結合，而大部分的其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)保持未結合併被除去；(vi)從親和色鐠材料上洗脫並收集^M^創傷癒合因子的物質(任選地，在促創傷癒合因子級分解吸前用清洗緩衝液處理親和樹脂，所述清洗液的離子強度高至足以使雜質蛋白(如肝素輔因子II等)解吸，但是尚不能4吏促創傷^合因子級分解吸)。在第三個可替代方案中，本發明的方法可釆用如下步驟進行(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉澱並進一步處理上清液，(ii)使上清^陰離子交換色鐠所需緩衝液中與陰離子交換色鐠材料接觸，所述緩衝液的鹽濃度與生理條件相當，其pH值約中性，大部分的所述蛋白都未結合(包括所述促創傷癒合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)，但是一些特定的蛋白質和蛋白酶(例如凝血酶原，FX，FIX等)結合在陰離子樹脂上；(m)將所述陰離子色鐠材料分離出去，得到溶液(包含促創傷癒合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)；(iv)加入無機吸附材料，如硅藻土、矽膠、氧化鋁，孵育足夠的時間使之與不想要的物質(如FXII和激肽釋放酶原激活劑等)結合；(v)加入低級脂肪醇，如d-C4醇，形成科恩級分I;(vi)除去無機吸附材料，以及，如果沉澱存在，還除去沉澱；(vii)使科恩級分I上清液通過親和色鐠材料來對其進行處理，由此使活性的促創傷癒合因子、AT-III和HRGP(HAH)結合，而大部分其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)保持未結合併被除去；(viii)從親和色譜材料上洗脫並收集含促創傷癒合因子的物質(任選地，在促創傷癒合因子級分解吸前用清洗緩衝液處理親和樹脂，所述清洗液的離子強度高至足以使雜質蛋白解吸，但是尚不能使促創傷癒合因子級分解吸)。在第四個可替代方案中，本發明的方法可採用如下步驟進行(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉澱並進一步處理上清液，(ii)使上清液通過親和色鐠材料來對其進行處理，由此使活性的促創傷癒合因子、AT-III和HRGP(HAH)結合，而大部分其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)保持未結合併被除去；(iii)從親和色鐠材料上洗脫並收集^l創傷癒合因子的物質並對其進行收集(任選地，在促創傷癒合因子級分解吸前用清洗緩衝液處理親和樹脂，所述清洗液的離子強度高至足以使雜質蛋白(如肝素輔因子II等)解吸，但是尚不能使促創傷癒合因子級分解吸)。在本發明的一個具體實施方案中，所述方法包括病毒滅活，其特別地在步驟(Vi)後進行。在此方法中的病毒滅活優選是用能夠使病毒滅活的化學物進行處理。這樣的病毒滅活在EP-A-131740中有詳細描述，即所謂的溶劑/去汙劑方法。EP-A-131740的內容通過參考併入本文。在病毒滅活步驟之後，可實施陰離子交換色鐠法。也可實施陽離子交換色鐠法，特別是在陰離子交換色諝法之後進行。在本發明方法的另一個實施方案中，實施磷酸纖維素色語法。因為僅僅進行此色鐠法就足夠了，所以磷酸纖維素色譜法可能是有利的。然而，磷酸纖維素色譜法與陰離子和/或陽離子交換色鐠法結合使用也可能是有利的。通常，包含HGF的級分在允許其吸附於磷酸纖維素材料的緩衝液中上樣於磷酸纖維素基質上。通常使用離子強度20.05M氯化鈉或其等同物的緩衝液實現HGF的洗脫。根據本發明，濃縮和/或滲濾(diafiltrate)在各個替代方法中收集的級分得到濃縮物。該濃縮物可任選地通過接觸陽離子交換填料進行進一步處理。用離子強度足夠洗脫主要包含AT-III(>90%)的級分Al的緩衝液處理所述陽離子交換材料，隨後用更高的足以洗脫被收集的所述促創傷癒合因子和HRGP之離子強度的緩沖液處理所述材料。濃縮或滲濾包含所述促創傷癒合因子和HRGP的級分得到級分A2。在本發明方法的第二個可替代方案中，其中向所述濃縮物添加沉澱緩衝液，過濾並用緩衝液處理所述沉澱以回收所述促創傷癒合因子和AT-III。可通過採用下述至少一個步驟使用陽離子交換樹脂對所得天然促創傷癒合因子濃縮物進行進一步純化，其中所述天然促創傷癒合因子和HRGP與所述樹脂結合(i)用緩衝液將所述促創傷癒合因子/HRGP級分從陽離子交換樹月旨上洗脫下來，所述緩衝液具有室溫下10-450mS/cm的電導率，更優選20-200mS/cm，最優選30-100mS/cm，(ii)色鐠過程中pH保持在6-9，尤其是6.5-8或6.75-7.25，(iii)所述樹脂的帶電基團用約10到約100個單體單元組成的弱疏水聚合物碳鏈連接到樹脂上。更詳細地說，採用使HRGP沉澱的鹽析步驟純化所得促創傷癒合因子濃縮物的第二個可替代純化方法的條件包括(i)使用根據霍夫邁斯特序列(Hofmeisterseries)的鹽，優選地選自硫酸鈉、砩酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸銨及其組合；(ii)所述鹽濃度選自0.3-3M，特別地選自0.5-2M或0.75-1.5M的範圍內；(iii)所述溶液的pH選自4-10，特別地選自6-9或7-8的範圍；(iv)通過過濾或離心除去所得沉澱。為了提供可以商業化的促創傷癒合因子級分，處理所得天然促創傷癒合因子濃縮物以減少病原體，其中包括至少下述一種方法(i)用溶劑去垢劑溶液進行病毒滅活；(ii)用光照(例如UVC)或輻射處理進行病毒滅活；(iii)用熱處理進行病毒滅活；(vi)用病毒濾器除去病毒。本發明的主題還有可根據本發明方法獲得的組合物，其包含活化和/或非活化形式的倡/fi，J傷愈:合因子，活性形式的促創傷1^合因子或其組合。'，本發明的一個實施方案中，所述組合物含有所述活化形式和/或非活外的穩定性。在另一個實施方案中，本發明的組合物含有所述活化形式和/或非活化形式的促創傷癒合因子，並且HRGP也已包含在內以增加天然促創傷癒合因子在體內和體外的穩定性。特別地，所述促創傷癒合因子是完全活化的，或者是非活化的。向含有所述促創傷愈:合因子和HRGP的級分中添加選自糖類和M酸中的穩定劑可以是有利的。通常，所述穩定劑可以是多元醇(polyole)、精氨酸、海藻糖、賴氨酸、甘露醇或其組合。本發明的主題還包括包含本發明組合物的藥物組合物。本發明的藥物組合物可以以活化和/或非活化形式的所述促創傷癒合因子或其組合存在，其優選是液體或凍幹形式並且通常局部施用，其混合於凝膠、噴霧劑等中，劑量方案大致是1-10納克促創傷癒合因子/平方釐米創傷/天。還可以使用下述一種或多種方法施用(取決於用途)所述組合物靜脈內、肌內、皮下、^L^、鞘內或者經直腸。實驗方法AT-III的定量測定測定AT-III作為肝素輔因子活性的生物活性(IU/ml)，其是通過監測在肝素和AT-III存在下凝血酶對發色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HC1(Chromogenix，Sweden)的切割進行的。參見Frantzenhandelandetal.(Scand.J.Haematol.31，427-436，1983)和VanVoorhuizenetal.(Thromb.Haemostas.52(3),350-353，1984).總蛋白通過測量280nm(A28)下的吸光度測定總蛋白濃度，使用係數6.4IU/mg計算AT-III溶液的濃度(mg/ml)。AT-III的比活性定義為以IU/ml計的肝素輔因子活性與A280之間的比值。富含組氨酸的糖蛋白的定量測定使用火箭電泳技術對HRGP進行定量測定，其中"火箭"的高度正比於抗原濃度(Laurell,C-B，(1966)Analyt.Biochem.Vol.15,p.45;Laurell，C國B(1972)J.Clin.Lab.Invset.Vol.29，suppl.124，P.21)。HRGP兔抗體(Behringwerke)加入到1%的瓊脂糖A凝膠中(AmerchamPharmaciaBiotech)。將HRGP樣品(5jd)上樣於所述凝膠，電泳過夜(150V,1V/cm)。將所得的抗原-抗體複合物染色，並與標準品(人血清)進行比較。等電聚焦根據Phast手冊分離技術文件No.100(附帶圖片)，在PhastSystem(AmershamPharmaciaBiotech)上使用預製膠，pi3-9,進行等電聚HGF的鑑定進行Westernblot分析以確定具有該細胞因子特徵性的多種功能的完整HGF的可獲得性。因此，在還原和非還原條件下進行SDS-PAGE。將通過電泳轉移到硝酸纖維素片上的蛋白質與市售抗人HGFIgG(R&DSystems,Inc.)和市售經綴合的二抗(R&DSystems,Inc.)—起孵育，所述二抗對於前一抗體具有特異性。通過顯色反應顯示所述抗原(蛋白質)。HGF的定量測定使用設計用於測定細胞培養上清液、血清及血漿中HGF水平的市售固相ELISA(R&DSystems,Inc.)測定天然HGF的相對質量值。HGF特異性單克隆抗體被預包被在微孔板(microplate)上。將標準品和樣品滴加至孔中，任何存在的HGF被固定化的抗體結合。洗掉所有未結合物質後，將HGF特異性酶聯多克隆抗體加入到孔中。隨後洗去所有未結合的抗體-酶試劑，將底物溶液加入到孔中，顯色，其與最初步驟中HGF結合的量成正比。終止顯色後，使用微孔板讀數器在450nm下測定每孔的光密度。HGF的生物學活性通過使用市售的創傷癒合、遷移和增殖測定來測定生物活性。參見B.Raffertyetal(J.Immunol.Methods258(2001)1-11)。實施例實施例1根據本發明，在AT-III和HRPG穩定下純化天然(活性)HGF。歩驟l將來源於健康供體的匯集的新鮮冷凍血漿(1,200kg)在O'C解凍，通過離心移出所得的冷沉澱(包含例如因子VIII和纖連蛋白)。所述沉澱通常用於FVIII的進一步純化。步驟2使所得的冷上清(來自步驟1)通過陰離子交換柱(70升DEAE-SepharoseFF，AmershamPharmaciaBiotech)進行處理以結合微生素K依賴蛋白(因子IX，因子X，因子II,蛋白C，蛋白S等)。用含0.14M氯化鈉和5mM磷酸鈉pH7.0的緩衝液清洗所述柱。未結合的蛋白級分(約1,270kg)進一步進入步驟3中進行處理，而對所述結合於柱中的蛋白進一步處理以純化FIX、凝血酶等。步驟3通過加入乙醇至8%(v/v)的終濃度進一步處理來自步驟2的未結合蛋白級分中以得到科恩級分I沉澱，其包含例如纖維蛋白酶原和脂蛋白(Cohnetal.(1946)J.Am.Chem.Soc.68，459-475)。加入乙醇前，在溶液中加入5.5kg磋藻土材料(HyflowSupereel)。通過離心除去沉澱和珪藻土。步驟4將科恩級分I上清液(大約1,400kg)pH值調至7.8，然後通過親和色鐠柱(120升肝素畫SepharoseFF,AmershamPharmaciaBiotech)進行處理，其中天然(活性)HGF、AT-III和HRGP(HAH)結合，而大部分的其它血漿蛋白(白蛋白，IgG等)穿過所述柱。用600kg緩衝液(0.4M氯化鈉和0.01M褲酸鈉，pH7.8)對所述柱進行清洗以除去無活性形式的蛋白，再用500kg緩^液(2.3M氯化鈉和0.01M的磷酸鈉，pH7.8)洗脫HAH級分。濃縮所得HAH洗脫液並使用超濾膜(Biomax-10,Millipore)和0.05M、pH7.5的褲酸鈉對其進行滲濾。所得經滲濾的HAH濃縮物被稱作UFl。實施例2根據本發明，在AT-III和HRPG穩定下純化天然(活化和/或非活化)HGF。步驟l將來源於健康供體的匯集的新鮮冷凍血漿U，200kg)在0'C解凍，通過離心移出所得的冷沉澱(包含因子VIII和纖維連接蛋白)。所述沉澱通常用於FVIII的進一步純化。歩驟2通過加入乙醇至8%(v/v)的終濃度處理來自步驟1的冷上清得到科恩級分I沉澱，其包含例如纖維蛋白酶原和脂蛋白(Cohnetal.(1946)J.Am.Chem.Soc.68，459-475)。加入乙醇前，在溶液中加入5.5kg硅藻土材料(HyflowSupereel),攪拌1-2小時。通過離心除去沉澱和珪藻土歩驟3將科恩級分I上清液(大約1,400kg)pH值調至7.8，然後通過親和色鐠柱(120升Heparin-SepharoseFF，AmershamPharmaciaBiotech)進行處理，其中天然(活性)HGF、AT-III和HRGP(HAH)結合，而大部分其它血漿蛋白(白蛋白，IgG等)穿過所述柱。用600kg緩衝液(0.4M氯化鈉和0.01M褲酸鈉，pH7.8)對所述柱進行清洗以除去無活性形式的蛋白，再用500kg緩鬥液(2.3M氯化鈉和0.01M磷酸鈉，pH7.8)洗脫HAH級分。濃縮所述HAH洗脫液並使用超濾膜(Biomax-lO,Millipore)和0.05M，pH7.5的褲酸鈉對其進行滲濾。所得經滲濾的HAH濃縮物被稱作UF1。實施例3天然HGF的進一步純化，以除去AT-III此方法在室溫下(+22'C)進行，實施例1或2中所得的UF1濃縮物(人28。=23.6;圖1，泳道l)用蒸餾水1+3稀釋。使稀釋後的溶液(2050g，電導率2.6mS/cm)通過色鐠柱(PharmaciaBiotechBioprocessColumn,直徑15cm)進行處理，所述柱裝填Fractogel⑧EMDSO3-650(M)陽離子交換色譜介質(1.71)，介質用pH7.5，電導率2.6mS/cm的10mM杵檬酸鈉溶液平衡。流速為91/h。在蛋白溶液上樣之後，用7倍體積的平衡緩衝液清洗色鐠柱。未被吸附到所述柱的物質與所述清洗液混合(14.6kg，稱作"級分A1，，；圖1，泳道2)。用1.9kg緩衝液(1MNacl/10mM檸檬酸鈉，pH7.5,電導率106mS/cm)洗脫更強吸附的蛋白。對洗脫液(1.9kg)進行濃縮並且用pH7.0的0.11\1檸檬酸鈉/1%蔗糖進行滲濾。所得"A2，，含有活性HGF和HRGP(表1和圖1,泳道3)。表1.根據本發明的AT-III和HGF/HRGP級分的分離tableseeoriginaldocumentpage18實施例5為了研究AT-III和/或HRGP對HGF最佳回收率的重要性，進行了下列實驗A.如實施例2(步驟1到3)中所實施的流經肝素-瓊脂糖色譜柱的級分用於進行進一步製備。然後，在不含HGF、活性AT-III和HRGP的此級分中加入HGF，但不加入AT-III和HRGP。在經溶劑去垢劑(solventdetergent,SD)處理(Octoxynol，TnBP)後，過濾(4吏用0.45jim孔徑的濾器)所述溶液，然後上樣於Q-SepharoseXL柱(陰離子交換樹脂)。用pH7.0，20mMTris/HCl溶液(女也用於除去SD試劑)清洗柱後，用含0.2M氯化鈉的pH7.0,20mMTris/HCl緩沖液洗脫結合蛋白。此洗脫液上樣於FractogelEMDS03-柱。在清洗步驟後，用10mM檸檬酸鈉pH5.5和1M氯化鈉進行洗脫。B.純化步驟與A中所描述的相同，只是在加入了HGF的溶液中加入純4t的AT-III。結果對從A和B操作中獲得的不同級分進行的評價表明，來自操作B的洗脫液的兩個色鐠過程的步驟得率明顯高於AT-III不存在時色譜過程的得率，特別是FractogelEMDSOr色鐠過程。HGF步驟的得率至少是AT-III不存在情況下的兩倍。值得注意的是，AT-III不存在時，在洗脫液之外的級分中也檢測到HGF，然而在操作B的清洗級分中和柱穿過液中檢測不到HGF的存在，而其在洗脫液中得到了濃縮。總之，這些結果證明，AT-III的存在明顯提高了HGF的得率。特別是對於此處使用的陰離子和陽離子交換色鐠。實施例6根據實施例5，對實施例2中的肝素-瓊脂糖柱洗脫液和UF1(即包含HGF、AT-III和HRGP)進行SD處理，過濾(0.45jim)並上樣於磷酸纖維素柱，所述柱用1mM的磷酸緩沖液pH6.0進行清洗。用含1M氯化鈉的磷酸緩衝液進行HGF的洗脫。通過該色鐠過程，除去了SD試劑，並實現了HGF的進一步純化，相比於粗製品，HGF的方法步驟得率大於50%。權利要求1.一種從含有促創傷癒合因子的來源如血液中製備含有純化的促創傷癒合因子之組合物的方法，所述促創傷癒合因子選自:肝細胞生長因子(HGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子α(TGF-α)、轉化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細胞生長因子(FGF)，其中所述製備方法包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下實施的純化步驟。2.權利要求l的方法，其包括如下步驟(i)將冷凍血液解凍，最終除去沉澱並進一步處理上清液；(ii)使上清液在陰離子交換色鐠所需緩衝溶液中與陰離子交換色鐠材料接觸，所述緩衝液中的鹽濃度與生理條件相當，其pH值約為中性；(m)將所述陰離子交換色鐠材料分離出去，得到溶液；(iv)使所述溶液與肝素-親和色鐠材料接觸；(v)分離出所述溶液，用解吸緩衝液處理肝素-親和色諳材料，所述緩衝液具有足以允許所述促創傷癒合因子從所述肝素-親和色鐠材料上解吸下來的離子強度；(vi)收集包含所述促創傷癒合因子、AT-III和HRGP的所述解吸緩沖液。3.權利要求l的方法，其包括如下步驟(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉澱並進一步處理上清液；(ii)加入無機吸附材料，如硅藻土、矽膠、氧化鋁，孵育足夠的時間使之與不想要的物質結合；(iii)加入低級脂肪醇，如d-Q醇，以形成科恩級分I;(iv)除去無機吸附材料，以及，如果沉澱存在，還除去沉澱；(v)使科恩級分I上清液通過親和色譜材料來對其進行處理，由此使所述促創傷癒合因子、AT-III和HRGP(HAH)結合，而其它血漿蛋白未結合併被除去；(vi)從親和色i普材料上洗脫並收集所述促創傷癒合因子。4.權利要求l的方法，其包括如下步驟(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉澱並進一步處理上清液；(ii)使上清液在陰離子交換色鐠所需緩衝液中與陰離子交換色鐠材料接觸，所述緩衝液鹽的濃度與生理條件相當，其pH值約中性，大部分的蛋白質(包括所述促創傷癒合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)未結合，但是一些特定蛋白和蛋白酶結合在陰離子樹脂上(例如凝血酶原，FX，FIX等)；(iii)將所述陰離子色鐠材料分離出去，得到溶液(包含促創傷癒合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)；(iv)加入無機吸附材料，如硅藻土、矽膠、氧化鋁，孵育足夠的時間使之與不想要的物質結合，如FXII和激肽釋放酶原激活劑等；(v)加入低級脂肪醇，如d-C4醇，以形成科恩級分I;(vi)除去無機吸附材料，以及，如果沉澱存在，還除去沉澱；(vii)使科恩級分I上清液通過親和色鐠材料來對其進行處理，由此使促創傷癒合因子、AT-III和HRGP(HAH)結合，而大部分其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)未結合併被除去；(viii)從親和色譜材料上洗脫並收集含有所述促創傷癒合因子的物質(任選地，在促創傷癒合因子級分解吸前用清M衝液處理親和樹脂，所述清洗液具有提高的離子強度，足以使雜質蛋白解吸，但是尚不能使所述^^創傷癒合因子級分解吸)。5.權利要求l的方法，其包括如下步驟(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉澱並進一步處理上清液；(ii)使上清液通過親和色譜材料來對其進行處理，由此使促創傷癒合因子、AT-III和HRGP(HAH)發生結合，而大部分其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等)保持未結合併被除去；(m)從親和色鐠材料上洗脫並收集含所述促創傷癒合因子的物質(任選地，在促創傷癒合因子級分解吸前用清洗緩衝液處理親和樹脂，所述清洗緩沖液具有提高的離子強度，足以使雜質蛋白(如肝素輔因子II等)解吸，但是尚不能使所述促創傷癒合因子級分解吸)。6.根據權利要求2至5的方法，其中濃縮和/或滲濾所收集的級分得到濃縮物。7.根據權利要求2至6中任一項的方法，其中病毒滅活特別地在步驟(vi)之後實施。8.根據權利要求2至7中任一項的方法，其中在病毒滅活步驟之後實施陰離子交換色鐠。9.根據權利要求2至8中任一項的方法，其中陽離子交換色鐠特別地在陰離子交換色譜之後實施。10.根據權利要求2至9中任一項的方法，其中實施磷酸纖維素色譜。11.根據權利要求2至10中任一項的方法，其中實施納膜過濾。12.根據權利要求2至11中任一項的方法，其中權利要求2或3中步驟(vi)、權利要求4中步驟(viii)或權利要求5中步驟(iii)所得的級分採用病毒滅活化學劑進行病毒滅活。13.根據權利要求12的方法，其中經病毒滅活化學劑處理的級分接受磷酸纖維素色諉。14.根據權利要求12的方法，其中經病毒滅活化學劑處理的級分先接受陰離子交換色譜再接受陽離子交換色鐠。15.根據權利要求8或14的方法，其中所述陽離子交換材料先用離子強度足夠洗脫主要包含AT-III(>卯％)的級分A1之緩衝液進行處理，隨後用離子強度更高以洗脫大部分所述促創傷癒合因子和HRGP的緩衝液進行處理，並對其進行收集。16.根據權利要求15的方法，其中濃縮或滲濾含有所述促創傷癒合因子和HRGP的級分以得到級分A2。17.根據前述任一項權利要求的方法，其中將沉澱緩衝液添加到所述濃縮物，進行過濾，用緩衝液處理所述沉澱以回收所述促創傷癒合因子和AT-III。18.根據前述任一項權利要求的方法，其特徵在於處理所得促創傷癒合因子濃縮物以減少病原體，其包括以下方法中的至少一種(i)用溶劑去垢劑溶液進行病毒滅活；(ii)用光照(例如UVC)或輻射處理進行病毒滅活；(iii)用熱處理進行病毒滅活；(vi)用病毒濾器除去病毒。19.根據前述任一項權利要求的方法，其特徵在於，使用陽離子交換樹脂進一步純化所得促創傷癒合因子濃縮物，其中所述促創傷癒合因子和HRGP結合到所述樹脂，其包括下述至少一個步驟(i)用緩衝液將所述促創傷癒合因子/HRGP級分從陽離子交換樹脂上洗脫下來，所述緩衝液具有室溫下10-450mS/cm的電導率，更優選20-200mS/cm，最優選30-100mS/cm，(ii)色鐠過程中pH保持在6-9，更優選6.5-8，最優選6.75-7.25，(iii)所述樹脂的帶電基團用約10到約100個單體單元組成的弱疏水聚合物>^鏈連接到樹脂上。20.根據前述任一項權利要求的方法，其特徵在於，使用鹽析步驟進一步純化所得促創傷癒合因子濃縮物，通過該步驟沉澱HRGP,其特徵在於(i)使用根據霍夫邁斯特序列的鹽，優選地選自硫酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸銨及其組合；(ii)所述鹽濃度選自0.3-3M的範圍內，特別地選自0.5-2M或0.75-1.5M;(iii)所述溶液的pH選自4-10的範圍，特別地選自6-9或7-8的範圍；(iv)通過過濾或離心除去所得沉澱。21.可通過前述任一項權利要求的方法得到的組合物，其包含活化和/或非活化形式的促創傷癒合因子或其組合。22.根據權利要求21的組合物，其特徵在於包含活化和/或非活化形定性。23.根據權利要求21和/或22的組合物，其特徵在於包含活化和/或非活化形式的促創傷癒合因子，並且已包含HRPG以增加天然促創傷癒合因子的體內和體外穩定性。24.根據權利要求21至23中任一項的組合物，其中另外存在選自多元醇、糖類和/或胺基酸的穩定劑。25.—種藥物組合物，其包含權利要求21至24中任一項的組合物。26.權利要求25的藥物組合物，其中所述活化和/或非活化形式的促創傷癒合因子以液體或凍千形式存在，以^或噴霧劑形式施用。27.—種藥物製劑，其中權利要求26的組合物是剿歐、軟骨或噴霧劑的形式。28.通it^利要求1到20的方法獲得的富集了HRGP的級分。29.可通過以下方法獲得的才艮據權利要求28的級分，其中經肝素親和和病毒滅活處理後，所得混合物再用磷酸纖維素材料處理。全文摘要本發明涉及一種從含有促創傷癒合因子的來源(如血液)中製備含有純化的促創傷癒合因子之組合物的方法，所述促創傷癒合因子選自肝細胞生長因子(HGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子α(TGF-α)、轉化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細胞生長因子(FGF)，其中所述製備方法包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下實施的純化步驟。文檔編號C07K1/36GK101374855SQ200780002912公開日2009年2月25日申請日期2007年1月25日優先權日2006年1月25日發明者安娜·米耶德斯坦,安德烈亞·內塞爾-斯瓦埃,斯特凡·溫厄申請人:奧克塔法馬股份有限公司