一種提高小麥成熟胚再生率的培養基及其根癌農桿菌轉化方法
2023-08-07 22:30:36
專利名稱：一種提高小麥成熟胚再生率的培養基及其根癌農桿菌轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種提高小麥成熟胚再生率的培養基及其根癌農桿菌轉化方法。
技術背景到目前為止，小麥組織培養成功的外植體包括幼胚、幼穗、花葯和成熟胚等， 其中，幼胚再生最為容易，花葯培養次之，成熟胚培養最難。所以，幼胚一直被認 為是最理想的組織培養外植體材料，其愈傷組織誘導率和植株再生率都比較高，迄 今獲得的轉基因小麥基本上都是以幼胚作為外植體。而小麥幼胚的取材受時間、空 間和季節的限制，合適的取材時期難以把握，所取材料的生理狀態和發育階段的一 致性也無法保障，這在一定程度上制約了轉基因小麥的應用；而小麥成熟胚取材方 便，不受季節和植株發育階段等因素的限制，能保證不同個體間生理狀態的一致性， 是研究小麥遺傳轉化最為方便實用的受體材料。在成熟胚處理方面，不同研究者所採取的方式也不盡相同，如完整胚接種、胚 乳支撐接種、成熟胚碎片組織接種和成熟胚切割接種等，其植株再生率最高為10% 左右。在小麥成熟胚培養過程中，培養基和小麥的基因型是關鍵的影響因素，其中， 激素作為培養基中必不可少的組分，對調節組織和細胞培養中胚狀體的發生具有舉 足輕重的作用。國內外學者對小麥成熟胚組織培養中誘導培養基和分化培養基中所 添加的激素的種類及其濃度進行了比較研究。其中，2，4-D是小麥成熟胚培養中應 用最廣泛的生長調節劑，每升培養基中添加2 8 mg的2，4-D即能夠誘導愈傷組織， 但其具體濃度與成熟胚的培養方式密切相關。碎片組織和整粒切胚誘愈法一般用2mg/L的2，4-D，胚乳支撐法則以8 mg/L的2,4-D為宜。高濃度2，4-D能有效抑制 胚發芽，但對愈傷組織的分化不利；細胞分裂素KT在某種程度上能夠拮抗高濃度 2,4-D對愈傷組織分化的抑制作用，但對愈傷組織有一定的毒害作用。研究者們還 發現，在成熟胚愈傷組織誘導的起始階段2，4-D起著非常重要的作用，之後需降低 2,4-D濃度或不添加2,4-D才更有利於胚性愈傷組織的產生。相對於其他單子葉植物，小麥基因工程育種研究遠遠滯後。限制小麥轉基因研 究發展的首要因素是缺乏有效的受體材料及其再生體系。小麥幼胚雖然再生性能比 較強，但在取材的時間和空間上受到很大的限制，適宜轉化的生理狀態對培養條件的要求比較嚴格，轉化周期比較長。而小麥成熟胚則取材方便，生理狀態一致，不 受生長季節限制，是組織培養和遺傳轉化的理想外植體。另外，以小麥成熟胚作為 遺傳轉化的受體，不但可以節省時間、空間和能源，提高工作效率，而且更經濟、 方便、實用。然而，小麥成熟胚的離體培養比較困難，再生率比較低。如何誘導小 麥成熟胚產生高質量的愈傷組織及提高愈傷組織誘導率是小麥成熟胚轉化的關鍵。 探索小麥成熟胚處理方法，優化小麥成熟胚愈傷組織誘導培養基和農桿菌轉化方 法，建立高頻率再生體系，對小麥轉基因研究將有巨大的推動作用。 發明內容本發明的目的是提供一種提高小麥成熟胚再生率的培養基。本發明所提供的提高小麥成熟胚再生率的培養基是含有MS基本培養基的大量 元素、MS基本培養基的微量元素、MS基本培養基的鐵鹽、B5基本培養基的維生素、 葡萄糖、甘露醇、山梨醇、AgN03、 AS、 MgCl2、半胱氨酸、維生素C、水解酪蛋白、 穀氨醯胺和Dicamba的固體培養基，所述培養基中葡萄糖的濃度為10_15g/L,所 述培養基中甘露醇的濃度為0—15g/L，所述培養基中的山梨醇的濃度為0—15g/L， 所述培養基中AgN03的濃度為0_8mg/L，所述培養基中AS的濃度為0—40mg/L， 所述培養基中MgC^的濃度為0—1.75g/L，所述培養基中半胱氨酸的濃度為0 — 40mg/L，所述培養基中維生素C的濃度為0—100mg/L，所述培養基中水解酪蛋白 的濃度為0—100mg/L，所述培養基中穀氨醯胺的濃度為0 — 500mg/L，所述培養基 中Dicamba的濃度為l一3mg/L。上述培養基中葡萄糖的濃度優選為12g/L、甘露醇的濃度優選為15g/L、山梨醇 的濃度優選為15g/L、 AgN03的濃度優選為4mg/L、 AS的濃度優選為39mg/L、 MgCl2 的濃度優選為0.75g/L、半胱氨酸的濃度優選為40mg/L、維生素C的濃度優選為 100mg/L、水解酪蛋白的濃度優選為100mg/L、穀氨醯胺的濃度優選為5mg/L、 Dicamba的濃度優選為2mg/L。本發明的另一個目的是提供一種根癌農桿菌介導的轉化小麥成熟胚的方法。本發明所提供的根癌農桿菌介導的轉化小麥成熟胚的方法，包括下述步驟1) 將小麥種子滅菌後在無菌水中浸泡15-18小時，將浸泡後的小麥種子上的 成熟胚刮碎後接種於上述培養基中，23 — 25。C的培養溫度下黑暗培養7天；2) 用目的根癌農桿菌侵染經過步驟1)處理的小麥成熟胚刮碎組織、進行共培 養，將根癌農桿菌中的目的基因導入小麥成熟胚刮碎組織。上述培養溫度優選為24°C，上述根癌農桿菌為含有目標基因的根癌農桿菌。 上述根癌農桿菌介導的轉化小麥成熟胚的方法中還包括將經過共培養的小麥 成熟胚刮碎組織進行誘導愈傷組織的步驟。上述方法中還包括將得到的愈傷組織進行分化培養並進行生根的步驟。 利用本發明的培養基及其轉化方法，成熟胚刮碎組織的再生率得到提高。其中，輪選987成熟胚刮碎組織的再生率為84%，邯6172成熟胚刮碎組織的再生率為46%, Bobwhite成熟胚刮碎組織的再生率為42%，鄭9023成熟胚刮碎組織的再生率為34%， 石4185成熟胚刮碎組織的再生率為34%，濟麥20成熟胚刮碎組織的再生率為32%。
圖1為小麥輪選987成熟胚刮碎組織在Adi預培養培養基上的生長情況圖2為小麥輪選987的愈傷組織在XCFH分化培養基上的分化效果圖3為小麥邯6172的愈傷組織在XCra分化培養基上的分化效果圖4為小麥Bobwhite成熟胚的愈傷組織與農桿菌共培養的情況圖5為小麥Bobwhite成熟胚抗性愈傷組織及其在XCra分化培養基上的分化效果圖6為小麥Bobwhite T。代轉基因植株的PCR檢測情況 圖7為小麥Bobwhite L代轉基因植株的Southern blot檢測情況具體實施方式
下述實施例中所涉及的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。 實施例1、農桿菌轉化法轉化小麥成熟胚 一、培養基的配製和滅菌Adi培養基10XMS大量lOOrnl、 100 XMS微量10ml、 200 X MS鐵鹽5ml、B5基本培養基的維生素14mg (維生素B1 10rag、維生素B6 lmg、煙酸lmg、甘氨酸 2mg) 、 MgCl20.75g、甘露醇15g、山梨醇15g，定容至950ml，然後調節pH至6.0， 再加入瓊脂8g，以上成分採用12rC高壓溼熱滅菌20分鐘；均勻混合下面的幾種 成分5mg穀氨醯胺、水解酪蛋白0.5g、葡萄糖12g、乙醯丁香酮(AS) 39mg、 B5 基本培養基的維生素14mg、 3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(Dicamba)2mg、 AgN03 4mg、 半胱氨酸40mg和維生素C 100mg，定容至50ml，過濾滅菌後加入到上述高壓滅菌 後的培養基中。Adi培養基的特點是去除了 MS基本培養基中的有機成分，添加了 B5基本培養基的維生素、甘露醇、山梨醇、AgN03、 AS、 MgCl2、半胱氨酸、維生素C、水解酪 蛋白和穀氨醯胺，用葡萄糖取代了蔗糖，用Dicamba取代了2， 4-D。WCCAg4培養基10XMS大量10ml、 100XMS微量lml、 200 X MS鐵鹽0.5ml、 麥芽糖40g、 MgCl2 0.75g、乙磺酸(MES) 1.95g，定容至975ml，然後調節pH至 5.4，以上成分採用12rC高壓溼熱滅菌20分鐘；均勻混合下面的幾種成分100X MS維生素10ml、穀氨醯胺0.5g、水解酪蛋白0.1g、葡萄糖10g、 100mg/ml維生素 Clml、 4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram) 2.2mg、乙醯丁香酮(AS) 39mg， 定容至25ml，過濾滅菌後加入到上述高壓滅菌後的培養基中；待滅菌後的培養基溫 度降至65"C左右時，再加入過濾滅菌後的Dicamba2mg和AgN03 4mg。愈傷組織誘導培養基IESDI2: 10XMS大量100ml、 100XMS微量lOml、 200 XMS鐵鹽5ml、 IOOXMS維生素10ml、蔗糖20g，定容至1000ml，然後調節pH 至6.0，再加入瓊脂8g，以上成分採用12rC高壓溼熱滅菌20分鐘；待滅菌後的培 養基溫度降至65"C左右時，加入過濾滅菌後的AgN03 4mg和Dicamba2mg。IESDI2培養基的特點是在MS培養基的基礎上添加了 AgN03，用Dieamba取代了 2， 4-D。愈傷組織分化培養基XCFH: 10XMS大量lOOml、 100XMS微量10ml、 200X MS鐵鹽5ml、蔗糖30g、維生素Bl 10mg、維生素B6 lmg、煙酸lmg、甘氨酸2mg、 穀氨醯胺5mg、吲哚乙酸(IAA)0.2mg、瓊脂8g，定容至1000ml,然後調節pH至 6.0， 121。C高壓溼熱滅菌20分鐘。二、農桿菌轉化法轉化小麥成熟胚1、 預培養將以下基因型的小麥種子(輪選987、邯6172、鄭9023、石4185、 Bobwhite 和濟麥20，來自中國國家種質資源庫)滅菌後在無菌水中浸泡15-18小時，用接種 刀分別在各基因型的小麥種子上將成熟胚刮碎，然後接種在Adi培養基上，25'C黑 暗條件下培養7天。小麥輪選987成熟胚刮碎組織在Adi預培養培養基上的生長 情 況如圖l所示。2、 侵染將攜帶有叩tll基因的PBI121質粒轉入根癌農桿菌C58C1 (北京拜爾迪生物技 術有限公司)中，將得到的包含pBI121質粒的根癌農桿菌命名為C58Cl-121。 挑取根癌農桿菌C58C1-121的單菌落接種到YEP液體培養基中，28'C條件下250rpm振蕩培養至OD柳。=0. 6 — 1. 0。將上述0D6。。值為0. 6—1. 0的根癌農桿菌C58C1-121的菌液於室溫條件下 4500rpm離心10 min收集，沉澱重懸於上述WCCAg4液體培養基中，將上述預培養 的小麥輪選987、邯6172、鄭9023、石4185、 Bobwhite和濟麥20的成熟胚刮碎組 織分別放入重懸菌液中浸泡30 min，期間輕輕搖動。3、 共培養取出根癌農桿菌C58C1-121侵染後的小麥輪選987、邯6172、鄭9023、石4185、 濟麥20和Bobwhite的成熟胚刮碎組織，分別置於無菌濾紙上，25t:黑暗條件下共 培養3天。其中，小麥Bobwhite成熟胚經農桿菌C58C1-121侵染後的培養效果圖4 所示。4、 誘導抗性愈傷組織分別將上述共培養後的小麥輪選987、邯6172、鄭9023、石4185、濟麥20和 Bobwhite的成熟胚刮碎組織轉移到每升培養基中補充10. Omg G418和250. 0mg羧苄 青黴素的IESDI2培養基上，25'C弱光條件下培養15天誘導抗性愈傷組織。5、 愈傷組織分化將小麥輪選987、邯6172、鄭9023、石4185、濟麥20和Bobwhite的抗性愈 傷組織分別轉移到每升培養基中補充25. Omg G418和250. 0mg羧苄青黴素的愈傷組 織分化培養基XCFH中，25C條件下進行分化培養。輪選987成熟胚愈傷組織在分 化培養基XCra上的分化情況如圖2所示，邯6172成熟胚愈傷組織在分化培養基 XCra上的分化情況如圖3所示，小麥Bobwhite成熟胚刮碎組織經農桿菌C58C1侵染後產生的抗性愈傷組織在分化培養基xcra上的分化情況如圖5所示。6、 生根培養當從小麥輪選987、邯6172、鄭簡、石4185、濟麥20和Bobwhite的成熟 胚抗性愈傷組織分化出的抗性再生芽高度達2-3cm時，分別轉到生根培養基上，3 周左右長出不定根，當不定根長到3-4cm時，取出植株，徹底清除根部培養基，移 入土壤中培養。分別測定小麥輪選987、邯6172、鄭9023、石4185、濟麥20和 Bobwhite的成熟胚刮碎組織的再生率(成熟胚刮碎組織的再生率指實驗用成熟胚個 數與再生植株數的百分比)。結果表明，輪選987成熟胚刮碎組織的平均再生率為 84%，邯6172成熟胚刮碎組織的平均再生率為46%， Bobwhite成熟胚刮碎組織的再 生率為42%，鄭9023成熟胚刮碎組織的平均再生率為34%，石4185成熟胚刮碎組織的平均再生率為34%，濟麥20成熟胚刮碎組織的平均再生率為32%。 7、轉基因植株分子檢測培養抗性再生植株至分櫱-孕穗期，從葉片中提取其基因組DNA，並以其為模板， 以5 ， 一 TCGGCAAGCAGGCATCGCCA-3 ，和5 ， -TGTTCCGGCTGT CAGCGCAG-3 ，為引物， 擴增抗性再生植株中的叩tll基因。PCR反應條件為先94"C預變性5rain，然後 94。C變性30sec， 58。C復性30sec， 72。C延伸lmin 30sec，共計30個循環，最後再 72'C延伸10min。對PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，小麥Bobwhite 的T。代轉基因植株的PCR檢測情況如圖6所示。其中，M為DNA分子量標準，l為 攜帶有叩tll基因的pBI121質粒的PCR擴增結果，2為未轉基因的小麥Bobwhite的 PCR擴增結果，3 — 9為小麥Bobwhite的T。代轉基因植株的PCR擴增結果。結果表 明獲得了 476bp的PCR括增產物。對小麥Bobwhite的T,代轉基因植株進行Southern blot檢測，以叩tll基因全 長序列為探針。小麥Bobwhite的L代轉基因植株的Southern blot檢測情況如圖7 所示。其中，l一10為小麥Bobwhite的L代轉基因植株的Southemblot檢測情況， 11為未轉基因的小麥Bobwhite的Southern blot檢測情況，12為攜帶有叩tll基因的 pBI121質粒的Southern blot檢測情況。
權利要求
1、根癌農桿菌介導的轉化小麥成熟胚用培養基，是含有MS基本培養基的大量元素、MS基本培養基的微量元素、MS基本培養基的鐵鹽、B5基本培養基的維生素、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、AgNO3、AS、MgCl2、半胱氨酸、維生素C、水解酪蛋白、穀氨醯胺和Dicamba的固體培養基，所述培養基中葡萄糖的濃度為10-15g/L，所述培養基中甘露醇的濃度為0-15g/L，所述培養基中的山梨醇的濃度為0-15g/L，所述培養基中AgNO3的濃度為0-8mg/L，所述培養基中AS的濃度為0-40mg/L，所述培養基中MgCl2的濃度為0-1.75g/L，所述培養基中半胱氨酸的濃度為0-40mg/L，所述培養基中維生素C的濃度為0-100mg/L，所述培養基中水解酪蛋白的濃度為0-100mg/L，所述培養基中穀氨醯胺的濃度為0-500mg/L，所述培養基中Dicamba的濃度為1-3mg/L。
2、 根據權利要求1所述的培養基，其特徵在於所述培養基中葡萄糖的濃度 為12g/L、甘露醇的濃度為15g/L、山梨醇的濃度為15g/L、 AgN03的濃度為4mg/L、 AS的濃度為39mg/L、 MgC^的濃度為0.75g/L、半胱氨酸的濃度為40mg/L、維生素 C的濃度為100mg/L、水解酪蛋白的濃度為100mg/L、穀氨醯胺的濃度為5mg/L、 Dicamba的濃度為2mg/L。
3、 一種根癌農桿菌介導的轉化小麥成熟胚的方法，包括下述步驟1) 將小麥種子滅菌後在無菌水中浸泡15-18小時，將浸泡後的小麥種子上的 成熟胚刮碎後接種於權利要求1或2所述的培養基中，23 — 25i:的培養溫度下黑暗 培養7天；2) 用目的根癌農桿菌侵染經過步驟l)處理的小麥成熟胚、進行共培養，將目 的根癌農桿菌中的目標基因導入小麥成熟胚。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述培養溫度為23-25°C。
5、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述目的根癌農桿菌中含有目 標基因。
6、 根據權利要求3 — 5中任一所述的方法，其特徵在於所述方法中還包括將 經過共培養的小麥成熟胚刮碎組織進行誘導愈傷組織的步驟。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述方法中還包括將得到的愈傷組織進行分化培養的步驟。
8、根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述方法中還包括在所述分化 培養後進行生根的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種提高小麥成熟胚再生率的根癌農桿菌介導的轉化方法及其專用培養基。本發明所提供的提高小麥成熟胚再生率的根癌農桿菌介導的轉化方法，包括下述步驟1)將小麥種子滅菌後在無菌水中浸泡15-18小時，將浸泡後的小麥種子上的成熟胚刮碎後接種於預培養的培養基中，23-25℃的培養溫度下黑暗培養7天；2)用目的根癌農桿菌侵染經過步驟1)處理的小麥成熟胚、進行共培養，將目的根癌農桿菌中的目標基因導入小麥成熟胚。利用上述農桿菌介導的轉化方法將外源基因導入小麥中，經測定，用本發明的培養基及其轉化方法，小麥成熟胚再生率得到提高。
文檔編號A01H5/00GK101265481SQ200810106258
公開日2008年9月17日 申請日期2008年5月9日 優先權日2008年5月9日
發明者葉興國, 徐惠君, 徐明星, 杜麗璞, 殷桂香, 王豔麗, 王道文, 辛志勇, 陶麗莉 申請人:中國農業科學院作物科學研究所