PrP基因的遺傳學消融使用靶定啟動子陷阱法生產作為治療劑的無血清重組蛋白的細胞的製作方法

2023-08-07 15:37:51 2

專利名稱：：PrP基因的遺傳學消融使用靶定啟動子陷阱法生產作為治療劑的無血清重組蛋白的細胞的製作方法PrP基因的遺傳學消融使用耙定啟動子陷阱法生產作為治療劑的無血清重組蛋白的細胞本發明提供不含朊病毒蛋白(PrP)的永生化人類體細胞系，其中，所述PrP基因的兩個等位基因已被完全剔除。本發明還提供了用於生產所述細胞系的方法，以及將它用於生產適合作為生物藥品的靶定的人蛋白的應用。
背景技術：
：朊病毒是傳染性病原體，它能導致動物的中樞神經系統海綿狀腦病，與病毒和類病毒不同，朊病毒完全缺少核酸，並且能耐受蛋白酶。感染顆粒已被鑑定為PrpSe,它是Prpe(即正常細胞朊病毒蛋白)的異構形式。所述朊病毒假說(Pmsiner，Proc.Natl.Acad.Sci.95，13363-13383,(1988))認為PrPSe分子本身能將PrP。分子轉化成異常的構象，通過雜二聚體化或通過核聚合化過程。動物中最常見的朊病毒疾病是綿羊和山羊瘙癢病，以及牛綿狀腦病(BSE)。已在人類中鑑定了四種朊病毒疾病(l)庫魯病，(2)克勞伊氏病(CJD),(3)Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合症(GSS)和(4)致命性家族失眠(FFI)。所述人類朊病毒疾病可能是偶發性的，遺傳學起源的或傳染性起源的。第一個傳染性朊病毒疾病是250年以前披露的作為綿羊和山羊疾病的瘙癢病。瘙癢病在50年以前被證實可以通過實驗傳播。沒有證據表明瘙癢病曾經傳播到人類。BSE最初是1985在英國的牛身體上披露的(Wells等，Veterinaryrecord121，419-420,(1987)),並且被認為通過食用來自反芻動物的肉和骨粉而傳播(Wilesmith等，VeterinaryRecord123,638-644，(1988))。這種病被廣泛傳播，在1992年達到高峰，在英國出現了超過180,000的臨床病例，儘管數學統計表明，有l-2百萬頭牛受到了感染，不過，在它們大到足以表現出臨床疾病症狀之前就已經被宰殺並且進入人類食物鏈(Anderson等，Nature382,779-788，(1996))。BSE已傳播到高達20種其他物種，包括國內的和外來的貓(Wyatt等，VeterinaryRecord129:233-236，(1991);KirkwoodandCunningham,VeterinaryRecord135,296-303(1994))和在英國動物園裡的外國的有蹄類。在1988年7月，BSE的傳播導致英國政府限制來自XA^妁離和骨粉體為動物鉤料使萬y在m^年遊41月，規定了限制將牛內臟用於人類消費。人類朊病毒疾病的傳播最初是在20世紀50年代後期在巴布亞紐幾內亞的Fore人(Forepeople)中報導的(Gajdusek&Zigas,NewEnglandJournalofMedicine257,974-978(1957)),並且被認為已在儀式性食人和祭禮期間傳播。CJD的醫源性傳播已有文獻記載系通過受到汙染的醫療器械和移植物直接接種了CNS。醫源性傳播也通過肌內注射人屍垂體生長激素和促性腺激素而發生(Buchanan等，BritishMedicalJournal302，824-824，(1991);Brown等，Transfusion38:810-816,(1992))。變體CJD(vCJD)是人類朊病毒疾病，顯然是通過接觸狂牛症(BSE)感染劑導致的。VCJD首先於10年以前才艮導出(Will等，Lancet347:921-5,(1996)),它是系統性監測英國的CJD發病率和臨床表現而獲得的結果。對於vCJD來說，與其他人類朊病毒疾病相反，所述朊病毒蛋白的疾病相關形式和傳染性可以在整個身體的淋巴樣組織中方便地4全測(Hill，A.F.等，Lancet353:183-9(1999);Head,M.W.等，Am.J.Pathol.164:142(2004)),甚至是在臨床疾病發作之前檢測到(Hilton,D.A.等，Lancet352:703-4(1998))。這會引起這樣的擔心，血液和血液製品也可能含有傳染性顆粒，它構成了變體CJD的醫源性傳播的可能的來源。通過給綿羊模型輸注來自該病臨床發病前的動物血液和白細胞層進行的BSE傳播實驗強化了上述擔心(Hunter等，J.Gen.Virol.83:2897-905(2002))。在動物模型上進行的研究表明，血液中的大部分朊病毒傳染性是與細胞相關的，在血漿中的水平較低(BrownP等，Transfusion38:810-816(1998)),並且有證據表明，任何傳染性的存在都可能在血漿分離期間減弱(Stenland,C丄等，Transfusion42:1497-500(2002);Gregori,L.等,Biologicals32:1-10(2004))。應對vCJD的輸血傳播，使其本身就是血液成分受體的供體的供血延遲，這一方法從1980年就開始實施，以便降低導致自我爆發的三級或更高級傳播的風險。然而，並無法排除血漿或血液製品傳播所述疾病的可能性，因為尚沒有合適的血液檢測方法(Aguzzi,A.及GiateeiM.,Nat.CHn.Pract.Netirol.2:321-徴(2006))。通過人類製品傳播朊病毒相關疾病的危險是一個嚴重的健康問題。對於血液製品來說，預防的方法一方面是控制vCJD供體，同時通過過濾淨化血液。另一方面，重組人蛋白的安全生產，能避免朊病毒通過輸入來自受汙染供體的血液傳輸的危險。人蛋白的生產是在諸如大腸桿菌(E^c/zer/c/z/aco/O和酉良酒酵母(6Wcc/zara附jcescereWw'ae)等生物體中生產的，使得很多人蛋白的生產能夠大規模地合成，不過所希望的蛋白製品的質粒穩定性和不溶性之類因素可能制約上述系統的應用。大部分人蛋白需要額外的翻譯後修飾，以便實現所述內源蛋白的功能，並因此得;斤生產蛋白的血漿樣功l。、'、''例如，對於因子Vin來說，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等非人類細胞系的使用，面臨著純化的治療蛋白被細胞微量成分汙染的關鍵缺陷，這種汙染會導致患者體內出現抗原反應(Refacto,Wyeth,packageinsert)。另外，由非人表達系統表達的蛋白可能具有非人類糖基化形式，同樣會在患者體內產生抗原反應。凝血因子的生物學穩定性和效力主要受它們的O-和N-糖基化形式的影響。外周和末端單糖尤其重要，因為它們是被來自負責它們降解的細胞的特殊受體檢測的。凝血因子攜帶有唾液酸殘基作為末端單糖。糖蛋白觸角中的唾液酸組成的改變，可能產生不同的糖基化形式。因此，當出現修飾時，會對生物學穩定性和效力產生至關重要的影響。因此，在生產重組凝血因子時要考慮的重要因素是評估糖基化對非人類生產細胞系的影響。一般來說，人類細胞系比非人類細胞系更適合生產重組凝血因子。其原因可能是，在重組蛋白合成期間沒有外來的低聚糖結合進所述低聚糖部由於上述原因，哺乳動物，特別是人類系統被優選用於重組人蛋白的生產。特別是永生化細胞系HEK293及其衍生物，f.e.FreeStyleHEK293F能夠表達重組人蛋白(EP05105965.7)。由於4艮多治療劑是在哺乳動物系統內生產的，有必要確保從所述系統中分離的上述產品的安^j^確保它完^L有朊病泰蛋白。一#,考^^L有可^W的竭於^r測朊病毒傳染性的合適的^r測方法，另一方面，朊病毒的傳播和傳染性取決於正常細胞的朊病毒蛋白的表達，這種朊病毒蛋白可能轉化成傳染性朊病毒蛋白，在所述系統中消除朊病毒傳染性的最可靠和可行的方法是通過完全剔除朊病毒基因徹底避免所述朊病毒蛋白基因表達。本發明披露的剔除細胞系生產系統完全阻止了所述朊病毒蛋白的表達，並且能夠提供不含傳染性朊病毒蛋白的重組人蛋白，並且使接受所述無朊病毒細胞中生產的重組藥品治療的患者，避免了受朊病毒汙染的風險。為了專門抑制特定基因在真核細胞中的表達，已採用遺傳工程和分子生物學技術開發了若干種方法。遺傳學消融(在本行業中通常被本領域的專家稱作"遺傳學剔除")表示消除編碼特定蛋白的DNA序列。這種消除的結果是，所得到的"剔除細胞"完全不能表達所述剔除的基因。相反，"幹擾RNA"(RNAi)技術是不消除所述DNA序列，而是引入反義或互補序列，這樣可以防止翻譯這些受到抑制的基因。在大多數情況下，所得到的"剔除-抑制"基因只能部分抑制，允許某些殘留的表達水平。由於小鼠作為人類疾病模型的廣泛應用，並且由於鼠類胚胎幹(M)細胞早期的可利用性，這些細胞可以方便地進行遺傳學和胚胎操作，剔除才支術主要是在小鼠ES細胞上進行的(JoynerA丄.，OxfordUniv.Press,UK1993)。當今，在小鼠上進行的剔除技術已發展到足以不僅允許完全剔除("沒有等位基因")，而且還可以獲得條件突變型。靶定的突變可以暫時i秀導或抑制，例如通過在小鼠飼料中添加四環素(tet-on,tet-off系統，Gossen,M.andBujard,H.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551(1992));它可以通過細胞或組織特異性啟動子啟動，或者通過普遍存在的，但是通過發育調控的啟動子啟動，這種啟動子可能在胚胎發育期間關閉，而在出生之後快速啟動。剔除ES細胞系的發生總是要求相同的初始步驟(1)生產為了剔除特定基因而專門設計的靶定構建體；(2)將該構建體導入所述ES細胞，和(3)選擇並且篩選其所承載的預期基因已被靶定刪除的細胞。所述靶定的構建體必須總是包含選擇框和與欲被剔除的基因同源的標誌區。逸兩個元件是實現和檢測僅在所需要的位點整合所M;與所述內源基因同源的區域能啟動這兩個同源DNA片段之間的同源重組，而所述選擇框允許篩選承載所整合的構建體的細胞。在ES剔除技術中最廣泛使用的選擇框是新黴素磷酸轉移酶框("neo")，它包括編碼由小鼠磷酸甘油酸激酶(pGK)啟動子啟動的這種酶的ORF(Soriano等，Cell64,69!3-702(1991)),並且其下遊是polyA轉錄終止信號。在將所述靶定的構建體導入ES細胞並且用G418選擇時，只有那些已穩定整合所述構建體的細胞能夠耐受所述抗生素。在這些抗性細胞中，有些耙定的構建體被內源原始序列所置換。隨後可以通過基因組PCR或通過基因組Southern印跡分析篩選分離的克隆中的耙定的結果。在小鼠ES細胞中，所述靶定的構建體整合到所述基因組的預期部位的頻率遠遠低於隨機整合的頻率，這使得在鑑定出正確靶定的克隆之前通常必須篩選數百個抗生素抗性克隆。提高特定構建體的靶定頻率的一種可能性是增加同源區域的長度，因為在這兩個參數之間存在線性相關(Hasty等，MolCellBiol.1991Nov;11(11):5586-91(1991))。另外，已開發了多種"陷阱法"，這些方法取決於有效表達所述選擇框的靶定位點的元件的使用。例如，在所述啟動子陷阱法中，所述靶定的載體是這樣設計的，內源靶定的基因的轉錄機構能驅動克隆在所述靶定的載體中的選擇框的表達。在這種情況下，所述載體包含與靶定的基因同源的區域，所述區域沒有任何啟動子活性，因此，發生隨機整合的大部分克隆在抗生素篩選中不能存活。一般，啟動子陷阱篩選可以將靶定的克隆富集100倍。使用RNAi法，PrP基因的表達迄今為止在培養的瘙癢病感染的小鼠成神經細胞瘤細胞中只能是瞬時的和部分沉默的(Daude等，J.Cell.Sci..2003Jul1;116(Ptl3):2775-9(2003))。已成功地報導了使用不同方法實現的朊病毒基因在小鼠基因組內的遺傳學靶定結果(表1),以便說明它的功能喪失的有效後果以及它與TSES的可能的關係。表1:從文獻中獲得的PrP小鼠剔除數據tableseeoriginaldocumentpage10正如才艮據"朊病毒蛋白-唯一理i侖，，(PrusinerNobelLecture,Dec.8，1997)所預期的，失活基因的小鼠純合體(即完全缺乏PrP表達)實際上是抗朊病毒感染的，不過，最明顯的是，上述提到的所有剔除PrP小鼠是能生存的並且能正常發育。僅在長崎、RcmO和蘇黎世II剔除試驗中鑑定到相對溫和的神經學表現型(Rossi等，EMBOJ.20,4,694-702，(2001)),這表明PrP基因的功能不是絕對必要的。另外，正如已表明的，存在某種由Dpi產生的功能基因補償機制，該基因表現出明顯的與PrP的同源性，而作圖表示該基因在剔除PrP的小鼠的CNS中^5l下遊的16Kb被上調(Moore等，J.Mol.Biol.292,797-817(1999))。上述剔除技術在應用於體細胞時遇到了兩大問題。首先，剔除上述細胞中的一個基因只能提供有關這種破壞的功能後果的有限的信息。因為培養中的剔除細胞的表現型不一定體現了突變型生物，如來自剔除ES細胞的小鼠的最終效果。其次，更重要的問題是，體細胞中同源重組的革巴定頻率比在ES細胞中低大約兩個數量級(HansonandSedivy,Mol.CellBiol.15(1):45-51(1995))。為了在體細胞中進行有效的基因靼定，使用無啟動子載體的啟動子陷阱法是絕對必要的(SedivyandDutriaux，TrendsGenet.15(3):88-90(1999)),因為它們通常能夠強化100-500倍。在導入體細胞中並且進行抗生素篩選時，所述選擇框只能在來自靶定的基因的啟動子進行同源重組之後表達。通過由Genetix,UK提供的ClonePix技術也可以改善靶定的基因。目前已發現，可以建立人類體細胞系(例如，來自HEK293F細胞系的細胞系)，其中，編碼朊病毒蛋白序列的基因已在至少一個，優選在兩個等位基因上失活，或對於三倍體細胞來說在三個等位基因上失活。這一目的是通過攜帶無啟動子選^標記的剔除載體的同源員實I!W，在它靶定的整合到基因組中之後，可以通過內源PrP啟動子使所述選擇標記表達。所得到的朊病毒消融的細胞適合在用編碼輩巴定蛋白的合適表達載體轉染之後，用於耙定的人蛋白的重組生產。在結合合適的蛋白純含朊病毒蛋白的、安全的並且具有高度活性的重組人蛋白的有效系統。
發明內容本發明涉及(1)不含朊病毒蛋白(PrP)的永生化體細胞系，其中，所述PrP基因的兩個等位基因被完全刪除；(2)用於生產上述(l)中所限定的不含PrP的永生化細胞系的方法，該方法包括通過與PrP剔除構建體同源重組，隨後刪除相應原始細胞中的PrPORF的兩個等位基因；(3)如上面的(2)中所定義的PrP剔除構建體；(4)將上面(1)中所定義的所述無PrP的永生化細胞系用於人蛋白或其衍生物或其突變體(以下均稱之為"靶定的蛋白")的無PrP重組生產；(5)製備用於靶定蛋白的無PrP重組生產的細胞系的方法，該方法包括用包括複製起點和編碼所述人靶定的蛋白的基因的轉染載體，轉染上述(l)中所限定的無PrP的永生化宿主細胞系，由此所述耙定的人蛋白基因的5，末端與啟動子連接，而它的3，末端與polyA信號連接；(6)無PrP的永生化細胞系穩定轉染，優選是在無血清條件下，用上述(5)中所限定的轉染載體轉染；和(7)用於生產被用作藥品的靶定人蛋白的無PrP重組生產的方法,該方法包括培養上述(6)中所限定的無PrP的永生化人類細胞系。本發明的實施方案(7)的方法特別適合生產重組人蛋白和治療用抗體，包括凝血因子，如因子Vn/a,因子VIII,因子IX,vonWillebrand因子(vWF)和Adamtsl3和生長因子，如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),沒有朊病毒蛋白汙染。對於該方法來說，可以使用下述永生化人類細胞系，例如，具有本發明消融朊病毒蛋白序列的HEK293細胞系。該細胞系可以通過萬含有可^#或選擇標記，例如，新黴素磷酸轉移酶ORF,缺少它自身的啟動子和翻譯啟動的載體，來轉染永生化人類細胞系獲得。在一種優選實施方案中，所述細胞系是下述人類細胞系，如來自HEK293F或Per.C6細胞(永生化人類胎兒視網膜細胞)的細胞系。其他合適的細胞是CHO(中國倉鼠卵巢細胞)和BHK(幼倉鼠腎細胞)細胞。圖1:用於消融人類PrP基因的啟動子陷阱法圖2:l.PrPK.O.構建體pBS—Neo—P-—R+L—Arm—2B圖3:製備構建體pBS—Neo_p-_L+R—Arm一2B的克隆方法。被克隆到pBluescript載體中的片段的序列，i)沒有它自身的啟動子和ATG的新黴素基因，ii)用於同源重組的左臂，iii)用於同源重組的右臂圖4:在G418選擇之後的基於PCR的篩選方法圖5:在穩定整合了靶定的構建體pBS—Neo-—P-_L+R—Arm—2B之後用於表徵克隆的基因組Southern法圖6:在整合靶定的構建體pBS一Neo—P-—R+L—Arm—2B之後的基因組PCR篩選。DNA標記基因標尺DNA階梯混合物；陽性對照來自靶定PrP的細胞混合群體的基因組DNA。A1-8和Bl-8是通過ClonePixFL挑選的細胞克隆。用綠色圓環標記的克隆被鑑定為PCR陽性克隆，因為它是2.3kb帶。圖7:在靶定整合第一K.O.構建體pBS—Neo—P-—R+L—Arm—2B之後的PrPK.O.細胞的Southern分析使用了以下成分DNA標記基因標尺DNA階梯混合物；WT:293F野生型；K.O.:在耙定整合了第一K.O.構建體pBS—Neo—P-—R+L—Arm—2B之後鑑定的K.O.克隆。來自K.O.克隆和293FWT細胞的基因組DNA與5，-,3，-和Neo-探針雜交。正如所預期的，WT293F細胞與5，-和3，-探針表現出10.8kbWT帶，但是與Neo-探針沒有信號。對於K.O.克隆來說，可以檢測到與3，-探針的4.2kb的帶和與3，-探針的6.5kb的帶，另外，用Neo-探針看到了6.5kb的帶。閨g:具有一個fe^PrP等位基離的PrPK.O.^的FISH分析圖譜a:chr20和Bac的2個信號；圖譜b:chr20和Bac的3個信號；圖譜c:chr20的3個信號，不過Bac只有2個信號。圖9:具有一個耙定PrP等位基因的PrPK.O.細胞和293F細胞的ELISA分析分析了承載一個靶定PrP等位基因的兩種K.O.細胞系(K.O.l和K.O.6),並且與野生型293F細胞進行了比較。圖10:2.PrPK.O.構建體pBS—Zeo—P-—R+L—Arm。圖11:具有兩個PrPK.O.整合的細胞克隆的或混合的細胞群體的PCR篩選在凝膠上使用了以下成分DNA標記；基因標尺DNA階梯混合物；陽性對照來自耙定PrP細胞混合群體的基因組DNA。T3-l是用zeocin選擇的混合的細胞群體。T3-2是用zeocin和G418選擇的混合的細胞群體。這兩種混合的細胞群體都被鑑定為陽性。圖12:在穩定整合了靶定的構建體pBS—Neo-—P-—L+R—Arm—之後用於表徵克隆的基因組Southern法。圖13.:具有一個靶定PrP等位基因的PrPKO細胞的轉染效率。用表達質粒轉染相同數量的細胞並且比較轉染效率。圖14:FVIII(圖14a)，FIX(圖14b)和G陽CSFb(圖14c)在具有一個靶定的PrP等位基因的PrPK.O.細胞中的表達。任意單位的FVIII，FIX和G-CSFb/10E6細胞的表達與293F野生型細胞進行比較。具體實施例方式在本申請中使用了以下定義和縮略語"BAC"表示細菌人工染色體。"bp"表示鹼基對。"G418"和"zeocin"是兩種不同的選擇抗生素；以攜帶這些抗生素作為選擇標記的構建體穩定地轉染細胞，使其能夠耐受("G418^或"zeocin^)上述抗生素。"同源重組"表示具有同源序列的兩個DNA片段彼此重新組合的機制。"左臂"表示緊靠外顯子3上遊的PrP基因的內含子區。"右臂"表示緊靠PrP基因的外顯子3下遊的區域。"Neo"表示新黴素磷酸轉移酶基因。"ORF'表示開放閱讀框。"PCR"表示聚合酶鏈反應，"PrP"表示朊病毒基因或朊病毒蛋白。"HEK293F"表示一種特異性的人類胚胎腎細胞系。本發明的實施方案U)涉及不含朊病毒蛋白(PfP)的永生化A4^體細胞系，其中，所述PrP基因的兩個等位基因已被完全剔除。根據本發明，所述細胞系能夠被轉染並且在無血清條件下培養。另外優選的是，所述細胞系已通過在它的基因組中整合腺病毒序列被永生化。所述細胞系可以選自下列一組原始細胞腎臟，膀胱，肝臟，肺，心肌，平滑肌，卵巢和胃腸細胞。優選的是，所述原始細胞是人腎細胞系，如人類胎兒腎細胞。特別優選的是，所述人類胎兒腎細胞是FreeStyle293(293Fi田月包；InvitrogenR79007)，HEK293(293《田月包；ATCCCRL-1573;DSMACC305)，或293T細胞(DSMACC2494),優選是293F細胞(InvitrogenR79007)。在本發明的另一種優選實施方案中，所述PrPORF已通過與攜帶可選擇或選擇標記基因的剔除陷阱進行同源重組而被完全刪除，這樣所述可選擇或選擇標記的表達是由內源PrP啟動子啟動的。在特別優選的實施方案中，實施方案(1)的無朊病毒細胞系是無朊病毒293F細胞系pf293F，它包括所有中間混合群體、需分離所述最終剔除細胞系的分離克隆、以及由其衍生的修飾物。在本發明的實施方案(2)中，所述剔除構建體可能適合刪除兩個等位基因上的完整的PrPORF。另外，所述剔除構建體可以攜帶相同或不同的無啟動子選擇標記基因，其側鏈為與原始細胞的PrP基因內的插入位點同源的兩個序列。不過，優選的是，所述剔除構建體攜帶不同的選擇標記基因或可選擇標記。所述剔除構建體還可以攜帶下列功能序列之一polyA序列、重組酶識別序列、和IRES等。所述剔除構建體的同源序列的長度可以為1-10kb,優選大約6kb，並且優選相當於所述原始細胞系的PrPORF上遊和下遊的序列。特別優選的是，所述同源序列是SEQIDNOs:2和3中所示出的序列。編碼陽性選擇標記的合適的選擇標記包括但不局限於，新黴素磷酸轉移酶，zeocin，潮黴素；並且，所述選擇標記包括焚光標記，如GFP和Dsred和酶，如LacZ。特別優選的是，所述剔除構建體具有SEQIDNOs:1和16中示出的一個或多個序列。下面4W^HEK293或HEK293F細胞對本發明做更進一步餘說^。在本發明的上述細胞系中，PrP的編碼區基因通過啟動子陷阱被完全刪除。為了刪除HEK293F細胞中的PrP基因的編碼區需要三個連續的步驟1.用含有新黴素選擇標記的PrP剔除(以下稱之為"K.O."-)構建體靶定一個等位基因上的PrP的編碼區。2.鑑定並且分離僅承載一個靶定PrP等位基因和一個野生型PrP等位基因的克隆。該步驟是必需的，因為親本HEK293F細胞的遺傳學不均勻性，在75%的群體中攜帶3個拷貝的PrP基因，在25%的群體中攜帶有2個拷貝。3.用第二個PrPK.O.構建體靶定其餘等位基因上的PrP的編碼區，這一次構建體中包含zeocin選擇標記。在將第一PrPK.O.構建體(攜帶新黴素作為選擇標記，圖2)穩定轉染到HEK293F細胞中之後，在若干不同抗生素濃度下分離G418R克隆，並且通過基於PCR的方法篩選，這種篩選可以鑑定靶定的結果(圖4,圖6)。然後通過基因組Southern印跡分析鑑定攜載PrP-靶定整合的克隆，以Y更評估(a)所述靶定構建體的整合在它的5'和它的3'末端是否正確(b)已靶定了多少PrP等位基因(一個，兩個或三個)以及有多少仍然未經觸動(野生型一個或兩個)在第二輪K.O.中，將第二個PrPK.O.構建體(攜帶zeocin而不是新黴素作為選擇標記)用於剔除所述克隆中的其餘的PrP等位基因，其中，一個等位基因已被新黴素靶定，而第二個PrP等位基因仍然未經觸動。在對分離的zeocinR克隆進行PCR篩選和基因組Southern分析之後,通過RT-PCR分析證實了PrP基因的完全消融，以便證實缺少PrPmRNA，並且通過Western印跡分析證實完全缺少PrP蛋白。然後可以將本文所披露的所得完全的PrPK.O.細胞系用於確保人重組蛋白的無朊病毒表達。在轉染，抗生素篩選，克隆分離，篩選和擴增的整個過程中，細胞是在無血清條件下培養的(例如在FreeStyle培養基中或Octapharma室內培養基中)。^Jt主和完成最終PrPK.Ct細胞克隆6jij傳學和表型表徵之後，創立研究細胞庫(參見在6丄的材料和方法部分的293F細胞的培養法)。然後，該PrPK.O.細月包系，以下稱之為"無朊病毒293F細胞系"可以用任何感興趣的基因穩定地轉染(例如因子VIII,因子IX,G-CSF,vWF,GM-CSF,因子VII/VIIa或抗體)，根據本發明完全在無血清條件下進行(參見待審批的EP05105965,該申請的全部內容被收作本文參考)。通過用無朊病毒293F細胞進行穩定轉染得到的細胞通常在無血清培養基中生長，例如用攜帶感興趣基因的pcDNA3.1構建體感染，將所述細胞接種於半固體的甲基纖維素型培養基中，含有適合克隆選擇的抗生素和為通過焚光檢測最高產克隆的標記過的抗體。然後使用ClonePixFL(Genetix)針對細胞數量和分泌重組蛋白對大量(例如，數萬個)克隆進行分析，以便隨後挑選數百個最佳生產克隆。與其他已知方法不同，其中，非生產克隆和混合克隆都是隨機挑選的，ClonePixFL可以同時鑑定並且挑選生長最快的克隆，它也是產量最高的克隆，並且它來自單細胞。所挑選的細胞在微量滴定板上擴增，並且隨後在旋轉試管，細胞培養瓶和發酵罐中，在無血清條件下完成全部的過程。在這裡，整個穩定轉染過程是在無血清條件下進行的。另外，在隨後的整個擴增和細胞培養過程中，細胞不會與血清或動物衍生蛋白發生任何接觸。在擴增期間，通過ELISA測定，針對強健性，高生長速度，活力，易剝離性和活性重組蛋白的生產能力來選擇最佳克隆。在該選擇過程中，將數量再次降低到僅有少量最佳生產克隆。除了生產能力之外，正確的cDNA序列，mRNA含量和在發酵時的細胞表現是鑑定用於繼代培養的最佳克隆的標準。為此，要將選擇的克隆的細胞重新鋪平板，分析並且用ClonePixFL挑選，然後再按照上述方法擴增和選擇。繼代培養是一個重要步驟，以便僅選擇在鋪平板的克隆的亞群體中沒有遺傳變異的最佳生產克隆。在繼代培養之後，再在無血清條件下庫存所選擇的克隆。對由最終選擇的亞克隆表達的重組人蛋白做更詳細的生物化學表徵。另外，可以使用ClonePixFL從半固體培養基上分離K.O.克隆，用螢光標記的抗體檢測出PrP基岡已被完全剔除的克隆u實施例材料和方法1.用於分子生物學技術的裝置tableseeoriginaldocumentpage17ibiTreat818262.用於分子生物學技術的試劑和試劑盒tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage183.細菌生長培養基LB培養基胰蛋白腖10g,酵母抽提物5g,NaCl10g,溶解到1升H20，然後高壓滅菌。LB/amp瓊指平板將1.5%的瓊脂添加到含有100pg/ml氨節青黴素的LB培養基中4.用於293/293F細胞培養的材料4.1.細月包系293細胞系:293細胞系是在存在血清的條件下黏附生長的永久性細胞系。該細胞系是用通過切碎的人類腺病毒5型DNA轉化過的最初的人胚胎腎建立的(Graham等，1977;Harrison等，1977)。所述EIA腺病毒基因是在所述細胞中表達的，並且參與了某些病毒啟動子的轉移活化，使得這些細胞能產生很高水平的蛋白。293F細胞系:FreeStyle293F細胞系是293細胞系的變體，它適合在FreeStyle293表達培養基中懸浮生長。原始細胞系是於1988年從Pharmacopeia7>司的RobertHorlick那裡獲得的。所述FreeStyle293F細胞系來自所述293細胞系，並且預期和可以從Invitrogen司獲得的FreeStyle293(InvitrogenCatalogno.K9000-01)表達系統一起使用，或使用其他無血清培養基，如Octapharma公司的室內培養基。FreeStyle2MF細胞適合在FreeStyle293表達培養基中懸浮培養。所述FreeStyle293F細胞系具有以下特徵-由第一世代MasterCellBank培養物製備，該培養物來自親本293F細胞，通過有限稀釋對它進行過再克隆。所述293克隆衍生培養物在無血清條件下僅維持總共30-35個世代。-適合高密度，無血清，懸浮生長；可以在FreeStyle293表達培養基中維持。-用293fectin轉染具有高轉染效率-懸浮培養物可以在FreeStyle293表達培養基中轉染，不需要改變培養基。-允許以大體積轉染細胞。4.2.用於293/293F細胞培養的裝置tableseeoriginaldocumentpage19tableseeoriginaldocumentpage20tableseeoriginaldocumentpage214.4.用於FISH,免疫染色和ELISA的試劑tableseeoriginaldocumentpage214.5.用於293F細胞的起始和標準生長培養基FreeStyle293培養基，無添加劑FreeStyle293表達培養基可用於FreeStyle293F細胞生長，維持和轉染。可以從Invitrogen公司獲得的FreeStyle293表達培養基是確定的無血清配方，它是為了293細胞的高密度，懸浮培養和轉染專門開發的。該培養基不含人類和動物起點成分，並且是用Glutamax-I配製的，以便提高穩定性並且延長貨架期。4.6.用於293F細月包的冷凍培養基FreeStyle293培養基+10%DMSO5.分子生物學方法5.1使用QIAGENDNAeasyBlood&Tissue試劑盒(catNo.69504)或Gentra細胞試劑盒(QIAGENCatNo.158767)從細胞沉澱中分離基因組DNA用於PCR和Southern分析。5.2從96-孔平板上分離基因組DNA用於PCR分析用PBS漂洗所述細胞兩次。按照下面的表向每一個孔中添加5(Hil的溶胞緩衝液(0,6ml蛋白酶K應當添加到12ml溶胞緩衝液中[10mMTris，10mgEDTA，10mMNacl，0.5%sarcosyl])在50。C下培養所述平板過夜，應當用Pamfilm封口膜覆蓋所述平板。以2500rpm的速度離心1分鐘。向每一個孔中添加100^1的NaCl/ETOH(150lil的5MNaCl與10ml的冷卻無水乙醇)並且在室溫下搖晃所述平板30分鐘。核酸以絲狀網絡形式沉澱。以2500rpm的速度離心l分鐘，小心翻轉所述平i反，以Y更倒掉溶液，核酸保持附著在所述平板上，在紙巾上吸印多餘的液體。使用多通道吸液管在每個孔中滴加100^1的80%乙醇漂洗所述核酸3次。在每一個洗滌步驟中搖晃所述平板30分鐘。以2500rpm的速度離心l分鐘並且通過每次翻轉小心倒掉乙醇。將基因組DNA溶解在50pl的TE中，並且用Parafilm封口膜覆蓋。將所述平板放入37。C的培養箱過夜或在50。C下培養l-2小時，以便完全溶將具有基因組DNA的平板在4。C下保存待用，或在-20。C下保存。6.用Lipofectamin2000CD轉染細胞開始之前，確認細胞是健康的，並且存活率>90%。1.在轉染前一天，用不含抗生素的生長培養基製備懸浮培養物，其細胞密度為0.8-1.lx106細胞/ml。2.在轉染當天製備密度為l.lxlO"舌細胞/ml的懸浮培養物。3.為了進行每一次轉染，使用以下試劑用量和體積製備複合物，用於在生長培養基中有或沒有Albuminative作為添加劑的條件下進行每一毫升的細胞轉染在34pl的OptiMEMTMSFM或OptiPRC)TMSFM中稀釋0.5畫1.5pgDNA在34^1的OptiMEMSFM或OptiProSFM中稀釋l-10pl的Lipofectamin2000CD4.將所述複合物添加到含有細胞和培養基的燒瓶/平板中。5.在37。C下在平板上培養所述細胞，或在C02培養箱中，在軌道搖床上以125rpm的速度搖晃懸浮培養24-96小時。6.3.轉染的選擇，培養物的擴增，將細胞接種在96-孔平板上，並且準備使用ClonePixFL進行克隆挑選1.在轉染之後，將抗生素zeocin或G418添加到轉染過的培養物中以進行選擇。2.在選擇之後，收集抗生素抗性細胞，以便分離基因組DNA並且通過PCR分析篩選。3.將具有陽性PCR篩選結果的培養物擴增到5xlS細胞/ml。4.將細胞接種到裝有生長培養基的96孔平板上，密度為1000細胞/孔。5.如果細胞密度達到50%的話，製備複製平板用於PCR和細胞冷凍。6.當達到80%的細胞密度時，即可將所述平板用於PCR篩選。7.收集PCR陽性細胞並且再次以200-250細胞/孔的密度將它接種到96孔平板上；或分別擴增所述PCR陽性細胞並且以200-250細胞/孔的密度接種到96-孔平板上。8.製備複製平板用於PCR,並且當細胞密度達到50%進行細胞冷凍。9.當達到80%的細胞密度時，即可將所述平板用於PCR篩選。10.將所述PCR陽性細胞擴增到5xlS細胞/ml，以便進行接種試-驗。11.以不同的密度將所述細胞接種到半固體培養基中，以便尋找最佳細胞密度，以便可以在不接觸其他集落的情況下通過ClonePixFL輕易地挑選單一集落。12.用ClonePixFL挑選單一細胞集落。13.同步地將挑選的集落置於96-孔平板上並擴增，製備細胞的複製品用於冷凍和PCR分析。7.FISH分析確定293F細胞和pf293F細胞中20號染色體的數量在開始之前，確認細胞是健康的並且存活率>85%。1.用5-10ml生長培養基製備懸浮培養物，使細胞密度為l-3xl04田胞。2.將0.2ng/ml秋水仙醯胺添加到培養基中，並且在軌道搖床上以125rpm的速度旋轉培養30分鐘-1小時。3.通過以1100rpm的速度離心1O分鐘收穫細胞。4.取出上清液，留下500pl並且重新懸浮沉澱物。5.在室溫下在5-10ml75mMKC1中培養8-10分鐘。將第一毫升的KC1溶液滴加到所ii細胞中。6.添加2-3ml固定液並且以1100rpm的速度離心IO分鐘。7.將細胞沉澱轉移到微型離心機試管中，並且在該試管中進行隨後的所有固定洗滌操作。重要的是，細胞要完全重新懸浮。8.用固定液洗滌細胞3-6次，在每一個洗滌步驟之後，以6000rpm的速度在微型離心機中將細胞離心1分鐘。9.載玻片必須為室溫，用2-3秒鐘使載玻片通過熱蒸汽，以便使其表面溼潤(水浴溫度為75-80。C)10.將10-30)il細胞懸浮液放置在載玻片上，不讓液體乾燥。11.當表面成為顆粒狀時，讓所述載玻片用l-2秒時間再次通過熱蒸汽。12.馬上在其表面具有溫度梯度的金屬平板上將其乾燥。13.於室溫培養載玻片2-3天或在65。C下培養載玻片過夜。14.將載玻片浸泡在2xSSC,pH7.0中2分鐘。15.將載玻片放入乙醇系列液中各2分鐘進行脫水(70%,85%和100%)16.從-20。C下取出探針(染色體染色探針，Cytocell/Aquarius,LPP20G),並且讓它升溫到室溫。17.通過反覆用移液管混合確保探針溶液均勻。18.取出5-10pl探針溶液，並且放置在載玻片上，用24x24mm蓋玻片覆蓋，並且用橡膠溶膠或透明指甲油密封19.在75。C(+/-1。C)下變性2分鐘，並且在37。C(+/-1°C)下雜交過夜020.小心去掉蓋玻片和所有膠的痕跡21.用72。C(+/-1。C)的0.4xSSC(pH7.0)洗滌載玻片2分鐘。22.排乾載玻片上的洗滌液並且在室溫下用2xSSC,0.005%Tween20(pH7.0)洗滌30秒。23.排乾載玻片並且添加10pl的DAPI抗退色劑24.用蓋玻片覆蓋並且在黑暗中10分鐘使顯色。25.用螢光顯微鏡觀察。8.免疫染色分析293F細胞和pf293F細胞的細胞表面上的PrP蛋白量在開始之前，確保細胞是85%。1.以1-3乂105細胞/孔(lp載玻片,Ibidi)的密度接種到30-100jd生長培養基中，並且在37。C下培養過夜。2.如果細胞生長良好並變成黏著狀，就開始染色3.小心吸出培養基，並且用PBS小心漂洗細胞，不進行搖晃。4.在室溫下添加水冷固定劑(50%乙醇，50%曱醇)l分鐘。5.馬上用PBS洗滌細胞兩次5分鐘6.用8%BSA/PBS覆蓋細胞並且在室溫下培養1小時。在密封的潮溼培養箱中進行培養，以防止固定的細胞風乾。7.用lxPBS洗滌細胞兩次，5分鐘8.輕輕除去多餘的PBS,並且用在1%BSA/PBS中稀釋的原發抗體(3F4,POM12,POM17,SAF32，SAF32FITC,6H4)覆蓋細胞，並且在室溫下培養l-2小時。在密封的潮溼培養箱中進行培養，以防止組織切片風乾。9.用PBS洗滌細胞兩次，5分鐘10.輕輕除去多餘的PBS,並且用在1。/。BSA/PBS中稀釋的二級抗體(山羊抗小鼠-FITC)覆蓋細胞，並且在室溫下培養l-2小時。在密封的潮溼培養箱中進行培養，以防止組織切片風乾。11.在黑暗中用PBS洗滌細胞三次，5分鐘12.在載玻片上添加Dapi-抗退色劑，安放蓋玻片並且在螢光顯微鏡下才全查樣本。9.ELISA分析對含有一個或兩個PrP等位基因的293F細胞和pf293F細胞進行PrP蛋白含量定量分析1.收集2xl07細胞並且以800rpm的速度離心5分鐘2.除去培養基3.用5ml冷PBS洗滌細胞沉澱4.以800rpm的速度4吏所述細胞離心5分鐘。5.除去PBS6.用lml冷PBS洗滌細胞沉澱物，並且以6000rpm的速度離心5分鐘，除去PBS7.細胞沉澱物可以直接溶胞或冷凍，以便在-80。C下保存8.將1000pl冷的溶胞緩衝液添加到所述細胞沉澱中9.讓溶胞液通過20,23和26號注射器針頭10.通過Bradford分析測量細月包溶胞液的蛋白濃度實施例1:用含有新黴素的PrPK.O.構建體pBS—Neo—P—_R+L—Arm—2B(SEQIDNO:1)進行第一輪剔除的詳細說明。A.靶定方法通過啟動子陷阱徹底消除人類HEK293或HEK293F細胞的PrP表達。設計該方法(參見圖1)是為了專門選擇其中PrP基因的ORF被新黴素磷酸轉移酶ORF所取代的細胞(翻譯起始密碼子排除，它屬於PrP基因)。質粒構建體2B(參見圖2)由4個主要部分構成1.載體主鏈(在附圖中沒有示出)pBluescript，2."neo"(=新黴素磷酸轉移酶)截短的框，由該基因的完整的ORF組成，沒有它自身的翻譯起始密碼子，隨後是轉錄終止信號(參見SEQIDNO.1)。關鍵問題該neo截短的框不攜帶它自身任何的啟動子。所述neoORF被設計成從PrP基因的起始ATG密碼子開始翻i爭。3.neo上遊的"左臂"區，它的序列與位於E2和E3之間的PrP內含子相同(參見SEQIDNO.2)。4.neo下遊的"右臂"區,它的序列與PrPORF下遊的PrP區相同(參見SEQIDNO.3)。在進行以下操作時(a)將該構建體轉染到宿主293F細胞，(b)隨後整合到它們的基因組中和(c)用G418選擇，該方法的目的是富集具有同源重組(圖1中用兩個黑色"X"表示)的細胞，這種重組會導致PrP轉錄的neoORF下遊和翻譯調控序列(P,El，E2)的整合。只有在功能啟動子下遊整合了所述構建體的轉染過的細胞才能在G418選擇中存活。因此，所有存活的細胞預期都攜帶有來自功能啟動子下遊的整合(因此稱之為啟動子陷阱)。因為構建體臂與PrP基因有很長的同源性(一共大約6kb同源序列)，預計同源重組是專門針對所述PrP基因座的整合，它導致了如圖l的第三列所示的整合。B:靶定PrPK.O.構建體(pBSNeoP-—R+LArm2B)的產生靶定構建體的產生包括三個連續的克隆步驟(圖3),每一個步驟包括用於生產"插入片段"的PCR擴增步驟，將所述插入片段插入載體的連接步驟，以及將連接混合物轉化到大腸桿菌中並且通過限制酶消化選擇正確的克隆。1.製備pBS—Neo—P-—2B構建體通過PCR擴增neoORF，將pcDNA3.1+載體(Invitrogen)用作才莫板，使用以下程序合成寡核苷酸2B-Neo-F:5，-GGCAAGAATTCGC4GAGCAGTCATTATGATTGAACAAGATGGATTGCAC-GCAG-3，(SEQEDNO.4)2B-Neo-R:5，-GGACCGCTCGAG陽ATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT-3，(SEQIDNa5),它具有五coi7和io/限制位點(加下劃線處)。用五ca^Z和I0/消化擴增的產物(1244bp)並且連接到五07//;^0/-消化過的pBluescriptIIKS+(Stratagene)上。然後將連接混合物轉化入OneshotToplOF，感受態細胞(Invitrogen)中。通過用Ecoi^/^o/限制性消化以單個菌落製備的質粒DNA來進行篩選。2.製備pBS—Neo一P-一L一Arm一2B構建體通過PCR擴增所述耙定的構建體的左臂，將BACDNA克隆186(BACPACResourcesCenter,BPCR,http:〃bacpac.chori.org/)用作模板，並且使用以下程序合成寡核苦酸2B-L墨F:5'-GGCAAGCGGCCGC-CTCTGTCTAGGAACACTGCTGTG-3，(SEQIDNa6)2B-L-R:5，-GGCAAGAATTC-AAAATGAAGAGGAGAACGTCAGAGTC-3，(SEOIDNO.7),它們分別具有7VW/和五coi7限制位點(加下劃線處)。用五ca^Z和lo/消化擴增產物(1929bp)並且連接到五caR/M^/-消化過的pBS_Neo—P-—2B上。然後將連接混合物轉化入OneshotT叩IOF，感受態細胞(Invitrogen)中。通過用五coi/M^/限制性消化以單個菌落製備的質粒DNA來進行篩選。3.製備pBS—Neo—P-—R+L—Arm—2B構建體通過PCR擴增所述耙定的構建體的右臂，將與上面的B.2部分相同的BACDNA克隆186用作模板，並且使用以下程序合成寡核苷酸2B-R-F:5'-GGACCGCTCGAG-TGTGTACCGAGAACTGGGGTGATG-3'(SEQIDNO.8)2B-R-R:5,-GGCGGGGTACC陽GCAGAATCTCTGAGCTCACCTCAG-3'(SEQIDNO.9),它們分別具有Io/和^w/限制位點(加下劃線處)。用lo/和Xp"/消化擴增產物(4.6Kb)並且連4妄到五^//^^/-消化過的pBS—Neo—P-—L—Arm—2B上。然後將連接混合物轉化入SURE2超感受態細胞(Stratagene)。通過用J^o/力^w/限制性消化由單個菌落製備的質粒DNA來進行篩選。在所得到的構建體pBS—Neo—P-—R+L—Arm—2B(如SEQIDNO.1所示的克隆區的序列)上，neoORF(沒有任何啟動子序列，並且沒有它自身的翻譯起始密碼子的選擇框)的旁側-上遊是內含子區，在人類基因組中領前於PrP基因的外顯子3;和陽下遊是PrP區，在人類基因組中緊隨PrPORF後。4.pBS—Neo—P-—R+L—Arm—2B構建體的線性化通過用iQw/限制消化將所述靶定的構建體線性化，使用QIA快速凝膠提取試劑盒(參見MolecularBiologyMethods,5.2)純化，然後通過將1pi等分試樣;故置在0.8%瓊脂糖凝膠上與5pi的SmartLadder標記(Eurogentec)—起電泳進行定量分析。C.將pBSNeoP-R+LArm2B構建體導入人類細胞使用Lipofectamin2000CD試劑(Invitrogen，參見轉染方法，6.2)將靶定的構建體pBS—Neo—P-—R+L—Arm—2B導入宿主細胞(293F,Invitrogen)。在轉染48小時之後，將細胞鋪到10cm的培養皿上，密度為1.25-1.5xl06細胞。抗生素篩選是在接種時開始的，抗生素的濃度為30-120|igG418/ml。每隔2/3天進行培養基更換，培養14-21天。D.靶定的克隆篩選在抗生素篩選時當細胞達到融合時,製備基因組DNA,使用QIADNAeasy組織試劑盒(參見MolecularBiologyMethods,5.3),以1xl06-lxio7G418R細胞製備基因組DNA，或者使用以前披露的方法以ES細胞鋪在96孔平板上(Ramirez-Solis等，1992)來製備基因組DNA。從每一種基因組DNA製劑，配製PCR混合物，它含有80-300ng基因組DNA,lxPCR緩衝液，200nM每一種寡核苦酸引物，5mMMgCl2，200nMdNTP和1.33單位的ExpandFidelity聚合酶(Roche)。用於篩選的合成寡核苦酸的序列如下K.O,Fl:5'CGACTCAGTGTCATTCCCTGCAGTCTC3'(SEQIDNO.10)K.O,Rl:5'CATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAG3'(SEQIDNO.11)循環參數如下94。C2分鐘；[94。C，15s;71,6。C,30s;72。C100s]xl6個循環；[94°C,15s;71，6°C，30s;72°C100s+在每一個連續的循環中延長3秒]x26個循環；72。C7min。基因組DNA樣品得到2.3kb的PCR產物，表明在該細胞群體中存在一個或若干革巴定的等位基因。使用Southern-印跡分析進一步分析靶定的克隆。E.攜帶一個靶定PrP等位基因的靶定克隆的表徵1.基因組PCR篩選(圖4):正如在上面的D部分所披露的方法從混合的細胞群體中或分離的細胞集落中分離基因組DNA。所有PrPK.O.篩選PCR反應都是用正對照和負對照進行的。用於正對照的模板是來自以PrPK.O.PCR篩選法確定包含耙定PrP等位基因的細胞群體混合物的200ng基因組DNA;負對照用水取代基因組DNA作為模板。在電泳之後2.2kbPCR產物在瓊脂糖凝膠上的出現，表明了相應的細胞集落擁有至少一個靶定的prp細胞等位基因。通過這種方法對由ClonePixFL挑選的克隆進行分析，結果如圖6所示。2.基因組Southern分析(圖7):通過上述基因組PCR鑑定的靶定PrP的293F細胞克隆通過Southern印跡分析做進一步的遺傳學表徵。在五coiZ-消化的基因組DNA電泳分離和毛細轉移到Hybond+膜上之後，所得到的印跡用專門設計的DNA探針進行放射性雜交(參見圖5中的紅色箭頭)，以便驗證neoORF的正確和完整的整合。5，-和3，-探針是與預期的整合位點的5，-和3，-外部區域同源的。將Neo#笨針用於驗證K.O.構建體是否整合在靶定的基因座上或者僅僅是隨機整合。5，-和3，-探針是通過PCR擴增法，使用在本實施例的B.2所披露的BACDNA克隆186製備的。Neo糹笨針是用質粒pcDNA3.1(+)擴增的，它包括新黴素框，參見下面表格的概述tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31在圖5中示出了用構建體pBS—Neo-—P-—L+R—Arm—2B進4亍的基因組Southern方法。在對基因組進行五coi/消化和放射性雜交之後，靶定PrP的克隆與5，-DNA探針雜交時顯現出4.2kb的譜帶，與3，-DNA探針雜交時顯現出6.5kb的譜帶，而用任意探針檢測到的來自未靶定等位基因的野生型的譜帶都是10.8kb。採用Neo-探針，6.5kbDNA帶應當在PrP靶定等位基因上檢測到，而對於野生型293F細胞來說，不應當有譜帶被才t測到。將用所有3個探針檢測時在PCR和Southern印跡上都表現出正確圖譜的克隆，鑑定為在一個等位基因上靶定PrPK.O.的細胞。通過FISH，ELISA和免疫染色對這些陽性克隆做進一步的分析。3.FISH分析(圖8):人類PrP基因位於20號染色體上。293F細胞與WCP(全染色體染色)探針雜交，以便對20號染色體進行染色。該FISH分析表明，25%的293F野生型細胞具有2個拷貝的20號染色體，而75%的293F細胞^有3個拷貝的20號染色體。從技術上講，使用現有的方法很難並且幾乎不可能剔除3PrP基因。因此，用20號染色體WCP染色探針進行的FISH分析有助於鑑別已承載一個靶定PrP等位基因的細胞克隆，是否具有兩個或三個20號染色體。另外，BACDNA克隆186糹笨針跨越100kb,包括所述PrP基因，並且是20號染色體的一部分，同樣將它用於FISH雜交，以便檢測可能的染色體缺失和易位。在第一K.O.構建體pBS—Neo—P-—R+L—arm—2B靶定整合之後，可以觀察到PrPK.O.細胞系的三種不同的FISH圖a.用20號染色體探針染色兩個染色體/中期，都表現出BAC信號(圖8a)。b.三個染色體/中期進行染色，三者都表現出BAC信號(圖8b)。c.三個染色體/中期進行染色(由於一條20號染色體的臂易位到另一個染色體，該染色體只能部分染色)，只有兩個完整的20號染色體表現出BAC信號(圖8c)。對若干PrPK.O.細胞系的統計學分析歸納在以下表格中tableseeoriginaldocumentpage32具有兩個BAC信號的K.O.細胞;故用於剔除第二個PrP基因，無i侖每個細胞存在兩個或是三個20號染色體拷貝。因此，選擇以下的兩個K.O.細胞系K.O.1:該細胞系存在具有兩個染色的20號染色體拷貝的群體，並且二者都具有BAC的FISH信號(佔被檢測細胞的12%)。更大的群體(85%)表現出有三個染色的20號染色體拷貝。上述染色體之一只能部分染色，並且被易位到另一個染色體。只有兩個完全染色的20號染色體表現出BAC的FISH信號。K.O.6:96%的細胞具有20號染色體的3個信號，以及BAC的2個信號。K.O.1和K.O.6通過ELISA做進一步的分析，以便確定它們的PrP蛋白水平是否為野生型293F細胞的大約二分之一。4.ELISA試驗(圖9)進行ELISA分析，以便對PrPK.O.細胞中的PrP蛋白濃度進行定量，並且與野生型293F細胞進行比較。細胞系K.O.1和K.O.6擁有一個PrPK.O.等位基因，與WT293F細胞相比，能恆定地表達二分之一的PrP蛋白(圖9)。該數據還額外支持並且額外證實了FISH分析之後得到的結論。實施例2:用含有zeocin的PrPK.O.構建體進行第二輪剔除的詳細說明。該靶定方法與例1所述方法相同，所不同的是，抗生素不同。即在第二PrPK.O.構建體上zeocin取4義了豸斤黴素,因jt匕4兀生素^兄'l"生克隆的選擇是用zeocin而不是G418進行的。A.克隆含有zeocin框的第二PrPK.O.構建體在第一PrPK.O.構建體pBS—Neo—P-—L+R—Arm—2B上的新黴素ORF被沒有其自身啟動子和ATG翻譯起始密碼子的zeocinORF所取代。通過PCR擴增所述zeocin框，沒有來自質粒pcDNA3.1-Zeo(+)的其自身ATG,使用以下PCR引物。formulaseeoriginaldocumentpage33所得到的PCR產物的長度為412bp。用EcoRI和Xhol消化pBS—Neo—P-_R+L—Arm—2B質粒，並且與PCR擴增的Zeocin框連接，該框在它的末端包括EcoRI和Xhol的限制位點。通過這種連接得到的質粒被稱為pBS—Zeo—P-一R+L—Arm(圖10)(SEQIDNO.16),並且被用於靶定第二PrP等位基因。用BamHI將該第二PrPK.O.構建體pBS—Zeo—P-—R+L—Arm線性化，以便按照B.4部分所披露的方法進行轉染。B.將第二PrPK.O.構建體，pBSZeoPR+LArm導入具有一個PrP基因的等位基因的PrPK.O.細胞:使用Lipofectamin2000CD試劑將第二PrPK.O.構建體，pBS—ZeoP—R+L-Arm導入鑑定的具有一個靶定PrP等位基因的靶定的細胞(參見轉染方法，第19頁)。轉染48小時之後，將細胞鋪到10cm的平皿上或在125ml的搖床燒瓶中進一步懸浮培養，細胞密度為1.25-1.5xl06細胞/ml。為了進行抗生素篩選，將G418和zeocin按以下濃度添加到培養物中G4180-30|ig/ml，zeocin0-30pg/ml。每隔2/3天更換培養基，培養14-30天。C.篩選zeocin-耙定的克隆當細胞在抗生素篩選下得到融合時，完全按照篩選第一K.O.的方法製備基因組DNA(第25頁，D)。PCR篩選方法與例1D方法類似，所不同的是，將PCR的反向引物i殳i十成與zeocinORF同源。製備PCR混合物，含有20-300ng基因組DNA,lxPCR緩衝液，每個寡核苷酸引物200nM,1.25mMMgCl2,200nMdNTP和1.33單位的ExpandFidelity聚合酶(Roche)。用於篩選的合成寡核苷酸的序列如下Zeo-K.O,F2:5'CTCCTCTTCCTCCCATCTTACC3'(SEQIDNO.19)Zeo-K.O,R2:5'CGAAGTCGTCCTCCACGAAGTC3'(SEQIDNO.20)循環參數如下94。C4min;[94。C,15s;63。C,30s;72。C100s]xl6個循環；[94°C,15s;63°C,30s;72°C100s+每一個連續的循環延長3s]x24個循環；72°C7min。基因組DNA樣品得到了2.3kbPCR產物，表明在該細胞群體中存在一個或幾個靶定的等位基因。D.具有兩個靶定PrP的等位基因的靶定克隆的表徵l.基因組PCR篩選(圖11):為了鑑定細胞或細胞混合群體是否擁有兩個靶定PrP的等位基因，進行兩個獨立的PCR篩選。將PCR引物對Zeo-K.O,F2和Zeo-K.O.-R2用於證實第二PrPKo.O.構建體(pBS—Zeo—P-—R+L—Arm)的把定整合，同時引物對K.O.-F1和K.O.-F2用於證實第一PrPK.O.構建體(pBS—Neo—P-—R+L—Arm—2B)的靶定整合。按照上述C部分所披露的方法從混合的細胞群體或分離的細胞集落中提取基因組DNA。所有PrPK.O.篩選PCR反應都是用正對照和負對照進行的。用於正對照的模板是來自細胞群體混合物的200ng基因組DNA，在該群體中靶定PrP的等位基因事先已通過PrPK.O.PCR篩選方檢測到，其首先使用的是引物對Zeo-K.O.-F2和Zeo-K.O.-R2;所述負對照用水取代了基因組DNA做模板。在瓊脂糖凝膠電泳之後2.3kbPCR產物的出現，表明了相應的細胞集落具有攜帶zeocin框而不是PrP基因的細胞，它是第二輪K.O.的結果。該結果如圖11所示。用引物Zeo-K.O.-F2和Zeo-K.O,R2鑑定為PCR陽性的克隆，使用K.O.-F1和K.O,Rl通過PCR做進一步的分析，以便確定第一K.O.構建體的靶定整合是否依然存在，或者它已被第二K.O.構建體所取代(圖11)。當兩次PCR均為陽性時，該克隆通過Southern-印跡分析做進一步的分析。2.Southern印跡篩選法(圖12)與例1所述方法類似。用構建體pBS—Zeo-—P-_L+R—Arm進行的基因組Southern法如圖11所示。在用Eco及/對基因組進行消化和放射性雜交之後，靶定PrP的克隆與5，-DNA探針雜交時表現出4.2kb的譜帶，與3'-DNA探針雜交時表現出5.7kb的譜帶，而來自未靶定等位基因的野生型在用兩種探針檢測時都顯現出10.8kb的譜帶。對於PrP靶定的等位基因來說，使用Zeo探針檢測到5.7kbDNA帶，而對於野生型293F細胞來說4企測不到譜帶。兩種K.O.構建體的靶定整合的Southern圖譜的差別，僅在使用3，-探針和Zeo-或Neo探針時一企測到。*使用3，-探針對於第一K.O.構建體來說，應當檢測到6.5kb的帶，而對於第二K.O.構建體來說，還應當出現5.7kb的帶。在這兩種情況下，WT帶都是10.8kb。,使用Neo-探針在整合第一K.O.構建體之後應當檢測到6.5kb的帶。"吏用Zeo-探針對於第一K.O.構建體的靶定整合來說，沒有檢測到的信號，而對於第二K.O.構建體一般檢測到5.7kb的帶。用於Southern分析的DNA探針及其預期的圖i普歸納在以下表格中tableseeoriginaldocumentpage35tableseeoriginaldocumentpage363.FISH分析已發現，對於室內無血清適應性野生型293F細胞來說，20號染色體的拷貝隨著時間延長而增加。重要的是，應排除擁有兩個靶定PrP等位基因的K.O.細胞，其仍然還含有具有野生型基因座PrP的第三個未觸動的20號染色體的情況。因此，所鑑定的擁有兩個耙定PrP等位基因的K.O.細胞應當用BAC186探針和20號染色體WCP染色探針進一步雜交。對於完全的PrPK.O.細胞系來說，不應當觀察到超過2BAC信號。4.ELISA分析按照方法9所述進行該分析。在pf293F細胞中不應當4全測到PrP蛋白。5.免疫染色對於pf293F細胞來說，在細胞表面上沒有抗體染色的信號。實施例3:為製備無朊病毒重組蛋白而進行的無朊病毒293F細胞系pf293F無血清轉染。3.1具有一個靶定PrP等位基因的pf293F細胞的轉染。用pcDNA3.1-FVin(SEQIDNO.26)，pcDNA3.1-FIX(SEQIDNO.17)和pcDNA3.1-hyg(+)-G-CSFb(SEQIDNO.25)載體轉染具有一個靶定PrP等位基因的PrPKO克隆，以便表達人類FVIII，FIX和G-CSFb蛋白。在圖13中示出了在刪除第一PrP等位基因之後的轉染效率與wt293F細胞的相當(圖10)。每個10E6細胞的FVIII,FIX和G-CSFb的活性單位的表達與293F野生型細胞類似(圖14)。這表明了，一個PrP基因的剔除既不會影響該細胞的轉染能力，又不會減少所生產的重組蛋白的數量。3.2完全無朊病毒293F細胞系中人重組蛋白的無血清轉染和生產成功消融朊病毒ORF,導致了新型細胞系pf293F的產生，它能夠生產完全無朊病毒的治療劑。為了避免朊病毒汙染這種新的細胞系，例如來自培養基原料的朊病毒汙染，所有程序(包括穩定轉染，細胞培養和發酵)都是在無血清條件下進行的(參見PCT/EP2006063705)，並且使用ClonePixFL方法。具體地講，通過使用HindIII和Notl進行雙重消化，從WO01/70968中所4皮露的載體pTG36和pcDNA3.1-FIX,切除包括人類凝血因子IX的開放讀框的1.4kb的片段。將該片段連接到通過HindIII和NotI雙重消化載體pcDNA3.1Hygro(+)-zz(來自V870-20,購自Invitrogen)得到的5.6kb的片段上，得到了如SEQIDNO.17所示出的載體pcDNA3.1-FIX。製備28ml的懸浮培養物，活的pf293F細胞細胞密度為106。通過以下步驟製備脂-DNA複合物，用Opti-MEMI(Invitrogen)稀釋30pg的質粒DNA,使總體積為1ml,並且用Opti-MEMI稀釋40pi的293fectin使總體積為lml。在室溫下培養5分鐘之後，將稀釋過的DNA添加到293fectint，使總體積為2ml。轉染過的樣品在黑暗中，在室溫下培養20分鐘。將2ml的轉染混合物添加到28mlpf293F懸浮培養物中(最終細胞密度為lxl0"田胞/ml)。轉染過的pf293F細胞在37。C/空氣中含有8%C02的潮溼氣體中，在軌道搖床上培養72小時，轉速為125rpm。將按上述方法轉染的pf293F細胞接種到基於半固體曱基纖維素的培養基中，該培養基含有合適抗生素用於克隆篩選，而以標記過的抗體通過螢光來檢測產量最高的生產克隆。使用ClonePixFL(Genetix)分析大量(數千)克隆，分析了細胞數量和靶定的FIX蛋白的分泌，以便隨後僅挑選數百個最佳FIX生產克隆。與其他已知方法不同，非生產克隆和混合的克隆也是隨機挑選的，ClonePixFL的使用使得能夠挑選快速生長的克隆，它們僅僅是來自單細胞的高生產克隆。挑選的細胞在微量滴定平板上擴增，隨後在離心試管，細胞培養燒瓶和發酵罐中在無血清條件下擴增，以便完成整個程序。通過上述方法鑑定的FIX生產克隆在無血清FreeStyle293表達培養基中進行培養。^t要照標準方法分離並且純化靶定的蛋白。另外，為了生產安全的治療劑，可以使用披露於PCT/EP2006/061148中的優化的純化方法，包括例如SD-處理。Pf293F細胞還可用於重組人FVIII和G-CSF的無血清生產，使用表達載體pcDNA3.1-hyg(+)-G-CSFb(SEQIDNo.25)和pcDNA3.1-FVIH(SEQIDNo.26)進行。SEOIDNos.2和3:PrP左和右臂SEOIDNos.4-15:引物SEOIDNO.17:pcDNA3.1-FIX,分子6960bpsDNA，環狀38序列表SEOIDNO.1:K.O.載體pBS—Neo—P-R+L—Arm—2B:10623bpsDNA,環狀開始終止名稱/描述6732580PrP左臂26083807Neo38178411PrP右臂963710494AmpRSEOIDNO.16:K.O.載體pBS—Zeo—P-R+L—Arm:97卯bpsDNA,環狀開始終止名稱/描述6732581PrP左臂26052976Zeo29837583PrP右臂88059662■AmpR子型因因因因分t基基基基子型因因因因分l基基基基SEQIDNos18-24:引物SEQIDNO.25:pcDNA3.1勿g(+)-G畫CSFb分子6237bpsDNA環狀209863CMV啟動子9701584GCSFb16581872BGHpA19352348fl起點24132737SV40啟動子27553778HygR37914163SV40pA50964423CPUC起點61015241CAmpRSEQIDNO.26:pcDNA3.1-FVIII分子9975bpsDNA環狀1655CMV後動子區域7833082hFVin基因人類FVIII結構域Al和A2開始終止名稱/描述209863CMV啟動子895911MCS"9392324hFIX23282339SV40'/SV40polya+內含子23402370'MCS23812595BGHpA26583071fl起點31363460SV40啟動子34784501HygR45144886SV40pA58195146CPUC起點68245964CAmpR(互補鏈)型域域因因域域域域因域域因類區區基基區區區區基區區基域因域域域因域域因區基區區區基區區基783839信號肽信號肽forhFVIII8401826AlhFVIIIAl結構域19772972A2hFVIIIA2結構域30843107鉸鏈31055162hFVIII人類因子FVIII結構域A3.32434226A3hFVIIIA3結構域42274670ClhFVIIIC3結構域46835141C2hFVIIIC2結構域51885402BGHpA54655878fl起點59436267SV40啟動子62857308HygR73217693SV40pA86267953CpUC起點96318771CAmpRSEQIDNos27-29:引物或域域域因域域域域域域因域域因2!區區區基區區區區區區基區區基2c權利要求1.不含朊病毒蛋白(PrP)的永生化人類體細胞系，其中，所述PrP基因的兩個等位基因已被完全剔除。2.如權利要求l的細胞系，該細胞系(i)能夠被轉染並且在無血清條件下培養；和/或(ii)在它的基因組中具有整合的腺病毒序列；和/或(iii)來自選自下列一組的原始細胞腎臟，膀胱，肝臟，肺，心肌，平滑肌，卵巢和胃腸細胞，優選的是，所述原始細胞是人腎細胞系；和/或(iv)適用於重組蛋白的生產。3.如權利要求2的細胞系，其中，所述腎細胞是人胎兒腎細胞，優選的是，所述人胎兒腎細胞選自293細胞(ATCCCRL-1573;DSMACC305)，FreeStyle293細胞(293F細胞；InvitrogenR79007)和293T細胞(DSMACC2494),優選為293F細胞(InvitrogenR79007)。4.如權利要求1-3中任意一項的細胞系，其中，所述PrP基因的兩個等位基因已通過與攜帶可選擇或選擇標記基因的剔除陷阱進行同源重組而^皮完全刪除，這樣所述可選擇或選擇標記的表達是由內源PrP啟動子啟動的。5.如權利要求l-5中任意一項的細胞系，包括但不局限於所述最終的無朊病毒293F細胞系pf293F,以及所有的中間混合群體和為分離它所必需的分離克隆。6.用於生產權利要求l-3中任意一項的無PrP的永生化人類體細胞系的方法，該方法依次包括通過同源重組利用若干不同的PrP剔除構建體或利用相同的構建體刪除相應的原始細胞中的PrPORF，並且以逐漸增加的濃度實施抗生素篩選。7.如權利要求6的方法，其中，所述剔除構建體攜帶有所述相同或不同的無啟動子選擇標記基因或可選擇標記，其側鏈為與所述原始細胞的PrP基因內的插入位點同源的兩個序列。8.如權利要求7的方法，其中，所述剔除構建體(i)攜帶不同的選擇標記基因；和/或(ii)還攜帶下列功能序列之一polyA序列，重組酶識別序列，IRES;和/或(iii)所述同源序列的長度為l-10kb,優選為大約6kb，和/或相當於所述原始細胞系的PrPORF的上遊和下遊的序列，更優選的是，所述同源序列是如SEQIDNOs:2和3所示序列；和/或(iv)所述選擇標記編碼陽性選擇標記，包括-f旦不局限於新黴素，Z60cin5潮黴素；而所述可選擇標記包括螢光標記，如GFP和Dsred和酶，如LacZ。9.如權利要求8的方法，其中，所述剔除構建體具有SEQIDNOs:1和16所示序列的一個或多個。10.如權利要求6-9中任意一項定義的PrP剔除構建體。11.將權利要求l_5中任意一項的無PrP的永生化人類細胞系用於人蛋白，或其抗體或其衍生物或其突變體(靶定的蛋白)的無PrP的重組生產的應用。12.—種用於人蛋白，或其抗體或其衍生物或其突變體(靶定的蛋白)的無PrP重組生產的人類細胞系的製備方法，該方法包括用轉染載體轉染權利要求l_5中任意一項的無PrP的永生化人類宿主細胞系，所述載體包括複製起點，和編碼所述靶定的人蛋白的基因，而編碼耙定的人蛋白的基因在它的5，末端與啟動子連接，在它的3，末端與polyA信號連接。13.如權利要求12的方法，其中(i)所述轉染是在無血清條件下進行；和/或(ii)所述轉染載體來源於Invitrogen公司購得的pcDNA3.1載體；和/或(iii)所述靶定的人蛋白是凝血因子，如凝血因子VIII(包括wt因子VIII或B結構域刪除因子VIII),凝血因子IX,因子VII/VIIa,人類生長因子，如G-CSF或GM-CSF，vWF或a-l-抗胰蛋白酶(A1AT)或人類抗體。14.穩定轉染的，優選在無血清條件下用權利要求12或13所定義的轉染載體轉染過的無PrP的永生化人類生產細胞系。15.—種用於所靶定人蛋白的無PrP重組生產的方法，該方法包括培養，優選在無血清條件下培養如權利要求14所述無PrP的永生化人類生產細胞系。16.不含朊病毒蛋白(PrP)的永生化細胞系，其中，所述PrP基因的兩個等位基因已被完全剔除，選自HEK293F或Per.C6細胞(永生化人類胎兒視網膜細胞)，CHO(中國倉鼠卵巢細胞)和BHK(幼倉鼠腎細胞)細胞。17.將權利要求16所述無PrP的永生化細胞系用於人蛋白，或其抗體或其衍生物或其突變體(靶定蛋白)的無PrP的重組生產的應用。全文摘要本發明提供了不含朊病毒蛋白(PrP)的永生化人類體細胞系，其中，所述PrP基因的兩個等位基因已被完全剔除。本發明還提供了用於生產所述細胞系的方法以及將其用於生產適合作為生物藥品的人重組蛋白的用途。文檔編號C12N15/10GK101605891SQ200780046653公開日2009年12月16日申請日期2007年11月20日優先權日2006年11月20日發明者伊莉莎白·卡薩德蒙特,卡羅拉·施洛德,基姆·比約恩斯特普申請人:奧克塔金尼有限責任公司