可用於檢測人肝癌細胞株smmc-7721的核酸適體及其篩選方法和應用的製作方法

2023-08-07 05:19:56

專利名稱：可用於檢測人肝癌細胞株smmc-7721的核酸適體及其篩選方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸適配體及其篩選和應用，尤其涉及一種可用於檢測人肝癌細胞的核酸適體及其篩選方法和應用。
背景技術：
核酸適體(aptamer)是通過指數富集配基的系統進化技術(SELEX)篩選得到的， 能特異結合IE物質的單鏈寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸適體與抗體功能類似,但是與抗體相比具有更多的優勢，具有更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠化學合成，成本低；可進行標記；穩定性好，易於保存等優點。核酸適體的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、胺基酸、核酸、多肽、蛋白質，並從單一靶標擴展至完整的病毒顆粒及細胞等複合物靶標。因此，核酸適體具有廣泛的應用前景。肝癌是發生於肝臟的惡性腫瘤，包括原發性肝癌和轉移性肝癌，原發性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年新發肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤的第五位。對於惡性腫瘤而言，如果能及早發現、儘早治療，則癌症的病情往往容易得到控制，降低肝癌發病引起的死亡風險。因此，開發一種更加靈敏、簡便、高效和具有特異性的肝癌檢測手段，對於肝癌的臨床治療將具有十分重要的意義。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無免疫原性、能夠化學合成、分子量小、穩定、易於保存和標記的可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體及其衍生物，還提供前述核酸適體的篩選方法和應用。為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種可用於檢測肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中任意一條序列所示的DNA片段
序列I :
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCAATAGTCGAAGACTGATGGTTGAGCTGATGATCCTACGGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
序列2
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCATTCCGGTTCGTTTCAAAGTTATTGTCTATCTTTTCTAAAGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
序列3
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCTCACGGTCGTTTTAGTCGGAGACGTCTATAATTTTTAATTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3』 ；
序列4 5 』 -TTGACTTGCCACTGACTACCACAAAGAGTAGGGAAACGTTTTTTCAGGCGATAAAAGCATGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
序列5
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCACCTTTCTAGGTGGTTGAGCTGAAGATCGTACCGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，。上述的可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列上的某一位置可優選被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。上述的可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列上優選結合有生物素、地高辛、螢光物質、納米發光材料或酶標記(例如連接上螢光、放 射性和治療性物質等)。以上不論是經部分取代或者經過修飾後的核苷酸序列，都具有原核酸適體基本相同的性質和功能，即都可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種
(1)與上述所列核酸適體的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可將上述核酸適體序列刪除或增加部分互補的核苷酸);
(2)與上述所列核酸適體的核苷酸序列進行雜交的序列；或者
(3)上述所列核酸適體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體衍生物，所述衍生物是上述所列核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是上述核酸適體改造成的相應肽核酸。以上不論是衍生出的核酸適體還是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸適體基本相同的性質和功能，即都可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721。作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的核酸適體的篩選方法，包括以下步驟
(1)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物
隨機文庫 RS40 :5』 - TTGACTTGCCACTGACTACC(40N) GAAGTCAGTCGGTCGTCATC5』 引物5』 -Biotin-GATGACGACCGACTGACTTC-3』
3』 引物5』 -FAM-ITGACTTGCCACTGACTACC-3，；
(2)Cell-SELEX獲得人肝癌細胞株SMMC-7721特異核酸適體培養SMMC-7721細胞至基本鋪滿瓶底，去除培養基後用緩衝液洗滌，然後與隨機序列在冰上孵育後，棄溶液；再將上述隨機文庫溶解、恆溫振蕩後與經前述處理後的SMMC-7721細胞在冰上孵育；孵育完成後棄掉孵育瓶內的液體，並用緩衝液衝洗孵育瓶，然後用無菌水刮取孵育瓶內的SMMC-7721細胞並置於沸水浴中加熱，加熱完成後再離心取上清，即為篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫；
(3)PCR擴增文庫將步驟(2)中篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物；
(4)製備DNA單鏈文庫將鏈黴親和素修飾的瓊脂糖微球離心去上清，再將步驟(3)中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈黴親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面，洗滌後加入鹼液至瓊脂糖微球中，常溫下反應、離心、收集上清；將上清液過除鹽柱後收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫；
(5)重複篩選將步驟(4)得到的DNA單鏈文庫重複上述步驟(2) (4)的過程一次；
(6)陰性篩選以人肝癌細胞H印G為對照，將步驟(5)後篩選得到的DNA單鏈文庫進行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為培養人肝癌細胞H印G至基本鋪滿瓶底，去除培基後用緩衝液洗滌，然後與無關序列在冰上孵育後，棄溶液；再將篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恆溫振蕩後與經前述處理後的人肝癌細胞H印G在冰上孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的溶液；
(7)多輪篩選將步驟(6)所收集的溶液繼續進行上述步驟(2) (4)的操作過程，然後再依次重複步驟(6)、步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)的過程；重複篩選過程中用流式細胞 術監測文庫對SMMC-7721細胞識別能力的增強情況，直至文庫對SMMC-7721細胞的識別能力滿足要求後，將所得產物經克隆測序分析，最終得到可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體。上述的核酸適體的篩選方法，所述PCR擴增時的工藝條件優選為94°C 3min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec，經合適循環輪數(可在PCR擴增前進行循環輪數的優化，選取能夠滿足條帶亮度及特異性好的循環輪數作為PCR反應循環數)，720C 3min。上述的核酸適體的篩選方法，所述步驟(2)中，與無關序列在冰上孵育的時間優選控制在15 min 30min，與所述SMMC-7721細胞在冰上孵育的時間優選控制在30 min 60min,所述沸水浴中的加熱時間優選控制在10 min 15min ;所述步驟(4)中，與瓊脂糖微球在常溫下孵育的時間優選控制在30 min 45min，加入鹼液後的反應時間優選控制在15min 20mino作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的各核酸適體或者上述的核酸適體衍生物在識別人肝癌細胞株SMMC-7721或者製備檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的試劑盒中的應用。與現有技術相比，本發明的優點在於本發明通過SELEX篩選得到的核酸適配體具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠體外化學合成，分子量小，可以對不同部位進行修飾和取代，且序列穩定，易於保存，便於標記(不需要標記的二抗)等。採用本發明的核酸適體進行肝癌細胞的檢測時，操作更為簡單、迅速，由於核酸適體的合成成本較抗體製備成本低，且周期短，重現性好。本發明的可識別人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體均能特異性且高親和力的識別人肝癌細胞株SMMC-7721，且結合能力強，解離常數均在納摩爾範圍以內。利用本發明的核酸適體對其結合的靶分子進行研究，可以得到其腫瘤標誌物，這對於肝癌的早期檢測具有重要意義，在肝癌的診斷方面有良好的應用前景。


圖I為本發明實施例中利用Valfold軟體模擬的FAM-ZYl核酸適體的二級結構示意圖。圖2為本發明實施例中利用Valfold軟體模擬的FAM-ZY2核酸適體的二級結構示意圖。
圖3為本發明實施例中利用Valfold軟體模擬的FAM-ZY3核酸適體的二級結構示意圖。圖4為本發明實施例中利用Valfold軟體模擬的FAM-ZY4核酸適體的二級結構示意圖。圖5為本發明實施例中利用Valfold軟體模擬的FAM-ZY8核酸適體的二級結構示意圖。圖6為本發明實施例中流式細胞儀檢測五條核酸適體對人肝癌細胞株SMMC-7721的結合能力的檢測結果。圖7為本發明實施例中流式細胞儀檢測五條核酸適體對人肝癌細胞株IfepG的結合能力的檢測結果。圖8為本發明實施例中雷射共聚焦檢測五條核酸適體對人肝癌細胞株SMMC-7721的結合能力及特異性的檢測結果(圖中的兩組圖片，一個是螢光通道的成像，一個是螢光通 道和明場的疊加成像，是同一個照片不同通道的信息)。圖9為本發明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZYl核酸適體結合SMMC-7721的解離常數繪製曲線。圖10為本發明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZY2核酸適體結合SMMC-7721的解離常數繪製曲線。圖11為本發明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZY3核酸適體結合SMMC-7721的解離常數繪製曲線。圖12為本發明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZY4核酸適體結合SMMC-7721的解離常數繪製曲線。圖13為本發明實施例中流式細胞儀測定FAM-ZY8核酸適體結合SMMC-7721的解離常數繪製曲線。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和具體實施例對本發明作進一步描述。實施例
一種可用於檢測人上皮源性肝細胞肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，該核酸適體的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中的任意一條序列所示的DNA片段(5』端標記有FAM):FAM-ZYl
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCAATAGTCGAAGACTGATGGTTGAGCTGATGATCCTACGGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
FAM-ZY2
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCATTCCGGTTCGTTTCAAAGTTATTGTCTATCTTTTCTAAAGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
FAM-ZY3
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCTCACGGTCGTTTTAGTCGGAGACGTCTATAATTTTTAATTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3』 ；
FAM-ZY4 5 』 -TTGACTTGCCACTGACTACCACAAAGAGTAGGGAAACGTTTTTTCAGGCGATAAAAGCATGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，；
FAM-ZY8
5，-TTGACTTGCCACTGACTACCACCTTTCTAGGTGGTTGAGCTGAAGATCGTACCGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，。上述的各核酸適體的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。上述各核酸適體的核苷酸序列上可結合生物素、地高辛、螢光物質、納米發光材料或酶標。上述核酸適體的核苷酸序列的骨架還可衍生出可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的硫代磷酸酯骨架，上述核酸適體還可改造成相應肽核酸，還可衍生出其他的核 酸適體，衍生出的核酸適體的核苷酸序列可以為以下三種序列中的任意一種
(1)與上述所列核酸適體的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可將上述核酸適體序列刪除或增加部分互補的核苷酸);
(2)與上述所列核酸適體的核苷酸序列進行雜交的序列；或者
(3)上述所列核酸適體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。本實施例的上述五條可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體主要採用以下篩選方法篩選得到
I.合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物
隨機文庫 RS40 :5』 - TTGACTTGCCACTGACTACC(40N)GAAGTCAGTCGGTCGTCATC
5，引物5』 -Biotin-GATGACGACCGACTGACTTC-3』
3』 引物5』 -FAM-ITGACTTGCCACTGACTACC-3，。2. Cell-SELEX獲得人肝癌細胞株SMMC-7721特異核酸適體。2. I細胞預處理1640培養基加12%小牛血清培養SMMC-7721細胞至鋪滿瓶底95%,去除培基後用10mT, washing buffer洗漆，與ImL含InM隨機序列的binding buffer在冰上孵育15min，棄溶液。2. 2 孵育用 300 ii I binding buffer 溶解 IOnmol 上述的隨機單鏈DNA 文庫，95°C恆溫振蕩5min,迅速放入冰中；在隨機文庫中補充binding buffer至終體積為ImL,與步驟
2.I中已經處理好的SMMC-7721細胞在冰上孵育lh。2. 3解離孵育完成後倒出孵育培養瓶內的液體，用IOmL washing buffer洗滌孵育培養瓶中的細胞；用ImL無菌水刮取孵育培養瓶內細胞，置於EP管中沸水浴加熱lOmin，12000 rmp離心取上清，即為篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫。3.進行PCR擴增文庫取100 U I篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫進行常規 PCR 擴增，擴增條件為94°C 3min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec，經合適循環輪數，72°C 3min。第一輪篩選後需將全部所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫預擴增10個循環，再進行本步驟的擴增，得到擴增產物。4.製備DNA單鏈文庫將100 U I鏈黴親和素修飾的瓊脂糖微球5000rmp離心去上清，再用500 u I PBS洗滌，離心去上清；重複洗滌一次。將步驟3中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育半小時，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈黴親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面；5000rmp離心去上清，用PBS離心洗滌兩次。然後加入200mM NaOH溶液500 U I至瓊脂糖微球中用於雙鏈DNA的變性處理，常溫反應15min, 5000rmp離心5min,收集上清。除鹽柱用IOmL無菌水洗漆後,加入鹼變性後收集得到的上清液，自然滴完。加入ImL無菌水，收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫。5.重複篩選將步驟(4)得到的DNA單鏈文庫重複上述步驟2 4所示的陽性篩選(即步驟2)、PCR擴增及製取單鏈DNA文庫過程。6.陰性篩選在第三輪篩選及以後，以人肝癌細胞H印G為對照，將步驟(5)後篩選得到的DNA單鏈文庫進行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為培養人肝癌細胞H印G至鋪滿瓶底95%，去除培基後用緩衝液洗滌，然後與無關序列在冰上孵育後，棄溶液；再將篩選 得到的DNA單鏈文庫溶解、恆溫振蕩後與經前述處理後的人肝癌細胞H印G在冰上孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的溶液。7.多輪篩選將步驟6所收集的溶液繼續進行上述步驟2 4的操作過程，然後再依次重複步驟6、步驟2、步驟3、步驟4的過程；在第一輪篩選以後，用於細胞孵育篩選的文庫量約為200pmol，從第三輪篩選開始，陽性篩選細胞預處理的孵育溶液中需加入胎牛血清，隨著篩選輪數的增加，添加量從5%增加至20% ;重複篩選過程中用流式細胞術監測所得文庫對SMMC-7721細胞識別能力的增強情況，直至13輪篩選後文庫對SMMC-7721細胞的識別能力滿足要求，將所得產物(產物中含有19條序列)經克隆測序分析，對測序結果整理分析後，最終可得到富集度高的五條序列，這五條序列即為本實施例的可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體。考察I :用Valfold軟體對該本實施例五條序列進行二級結構模擬。用Valfold軟體對本實施例的五條序列進行二級結構模擬後的結構示意圖如圖I 圖5所示。考察2 :流式細胞儀檢測本實施例五條核酸適體與SMMC-7721細胞的結合效果及其特異性。將處於對數期生長的SMMC-7721細胞用胰酶消化後打散，在培養基中懸浮培養4h, 2000rpm離心去上清,用5mL PBS離心洗漆兩次。細胞與含250nM DNA序列的bindingbuffer冰上孵育半小時，2000rmp去上清，用ImL binding buffer洗漆兩次，最後加入400 u I binding buffer，用於流式細胞儀檢測，以人肝癌細胞株H印G作為對照，檢測結果如圖6、圖7所示。由圖6、圖7流式細胞術的檢測結果證明，本實施例的ZYl、ZY2、ZY3、ZY4、ZY8五條核酸適體均對靶細胞人肝癌細胞SMMC-7721具有較強的特異性識別能力，而對對照細胞人肝癌細胞株H印G無識別，與陰性探針(FAM-RS80)也無識別。FAM-RS80
FAM-5， -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3，
注N代表A、T、G、C中任一鹼基。考察3 :雷射共聚焦檢測本實施例五條核酸適體與SMMC-7721細胞的結合效果及其特異性。在雷射共聚焦小皿中分別培養人肝癌細胞SMMC-7721和人肝癌細胞株HepG，倒出培養基，用PBS將細胞洗滌三次。細胞與含250nM上述本實施例五條核酸適體的bindingbuffer冰上孵育半小時，倒出反應液，用binding buffer洗漆兩次，最後加入200 U Ibinding buffer用於檢測,檢測結果如圖8所示。檢測結果表明本實施例的五條核酸適體均能識別原位生長狀態下的靶細胞SMMC-7721，而不能識別對照細胞IfepG。考察4 :流式細胞儀測定本實施例五條核酸適體對SMMC-7721細胞的解離常數。特異性檢測的操作與考察2的操作基本一致，平行配製不同濃度的含本實施例核酸適體的反應液與SMMC-7721細胞孵育，以流式細胞儀的螢光幾何平均值為縱坐標，以核酸適體的濃度為橫坐標，由Y=B_*X/(Kd+X)方程模擬曲線，得到本實施例五條核酸適體的解離常數繪製曲線如圖9 圖13，由此可得到解離常數Kd如下表I所示。圖9 圖13及表I的檢測結果表明ZY1、ZY2、ZY3、ZY4、ZY8與靶細胞SMMC-7721細胞的結合能力很強，解離常數均在納摩爾級別。 表I :解離常數結果 ^_
序列名Kd (nM)_
權利要求
1.ー種可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，所述核酸適體的核苷酸序列包括以下序列I 序列5中的任意一條序列所示的DNA片段 序列I :5，-TTGACTTGCCACTGACTACCAATAGTCGAAGACTGATGGTTGAGCTGATGATCCTACGGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，； 序列2 5，-TTGACTTGCCACTGACTACCATTCCGGTTCGTTTCAAAGTTATTGTCTATCTTTTCTAAAGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，； 序列3 5，-TTGACTTGCCACTGACTACCTCACGGTCGTTTTAGTCGGAGACGTCTATAATTTTTAATTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3』 ； 序列4 5，-TTGACTTGCCACTGACTACCACAAAGAGTAGGGAAACGTTTTTTCAGGCGATAAAAGCATGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，； 序列5 5，-TTGACTTGCCACTGACTACCACCTTTCTAGGTGGTTGAGCTGAAGATCGTACCGTGAAGTCAGTCGGTCGTCATC-3，。
2.根據權利要求I所述的可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，其特徵在於所述核酸適體的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。
3.根據權利要求I或2所述的可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，其特徵在於所述核酸適體的核苷酸序列上結合有生物素、地高辛、螢光物質、納米發光材料或酶標記。
4.ー種可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，其特徵在於所述核酸適體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意ー種 (1)與權利要求I或2或3中所述核酸適體的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)與權利要求I或2或3中所述核酸適體的核苷酸序列進行雜交的序列；或者 (3)權利要求I或2或3中所述核酸適體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。
5.ー種可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體衍生物，其特徵在於所述衍生物是權利要求I或2或3中所述核酸適體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是權利要求I或2或3中所述核酸適體改造成的相應肽核酸。
6.一種如權利要求I所述的核酸適體的篩選方法，包括以下步驟 (1)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物隨機文庫 RS40 :5』 - TTGACTTGCCACTGACTACC(40N)GAAGTCAGTCGGTCGTCATC5』 引物5』 -Biotin-GATGACGACCGACTGACTTC-3』3』 引物5』 -FAM-ITGACTTGCCACTGACTACC-3，； (2)Cell-SELEX獲得人肝癌細胞株SMMC-7721特異核酸適體培養SMMC-7721細胞至基本鋪滿瓶底，去除培養基後用緩衝液洗滌，然後與隨機序列在冰上孵育後，棄溶液；再將上述隨機文庫溶解、恆溫振蕩後與經前述處理後的SMMC-7721細胞在冰上孵育；孵育完成後棄掉孵育瓶內的液體，並用緩衝液衝洗孵育瓶，然後用無菌水刮取孵育瓶內的SMMC-7721細胞並置於沸水浴中加熱，加熱完成後再離心取上清，即為篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫； (3)PCR擴增文庫將步驟(2)中篩選所得的SMMC-7721特異核酸適體文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物； (4)製備DNA單鏈文庫將鏈黴親和素修飾的瓊脂糖微球離心去上清，再將步驟(3)中PCR擴增所得的雙鏈DNA與瓊脂糖微球在常溫下孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈黴親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面，洗滌後加入鹼液至瓊脂糖微球中，常溫下反應、離心、收集上清；將上清液過除鹽柱後收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫； (5)重複篩選將步驟(4)得到的DNA單鏈文庫重複上述步驟(2) (4)的過程一次； (6)陰性篩選以人肝癌細胞H印G為對照，將步驟(5)後篩選得到的DNA單鏈文庫進行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為培養人肝癌細胞H印G至基本鋪滿瓶底，去除培基後用緩衝液洗滌，然後與無關序列在冰上孵育後，棄溶液；再將篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恆溫振蕩後與經前述處理後的人肝癌細胞H印G在冰上孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的溶液； (7)多輪篩選將步驟(6)所收集的溶液繼續進行上述步驟(2) (4)的操作過程，然後再依次重複步驟(6)、步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)的過程；重複篩選過程中用流式細胞術監測文庫對SMMC-7721細胞識別能力的增強情況，直至文庫對SMMC-7721細胞的識別能カ滿足要求後，將所得產物經克隆測序分析，最終得到可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體。
7.根據權利要求6所述的篩選方法，其特徵在於，所述PCR擴增時的エ藝條件為94°C3min，94°C 30sec,60°C 30sec，72°C 30sec，經合適循環輪數，72°C 3min。
8.根據權利要求6或7所述的篩選方法，其特徵在於所述步驟(2)中，與隨機序列在冰上孵育的時間控制在15min 30min，與所述SMMC-7721細胞在冰上孵育的時間控制在30min 60min,所述沸水浴中的加熱時間控制在IOmin 15min ;所述步驟(4)中，與瓊脂糖微球在常溫下孵育的時間控制在30min 45min,加入鹼液後的反應時間控制在15min 20mino
9.一種如權利要求I 4中任一項所述的核酸適體或者如權利要求5所述的核酸適體衍生物在識別人肝癌細胞株SMMC-7721或者製備檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體，包括序列1～序列5中所示的DNA片段，還包括該核酸序列的一系列衍生物。本發明核酸適體的篩選方法包括以下步驟首先合成隨機單鏈DNA文庫和引物，然後Cell-SELEX獲得人肝癌細胞株SMMC-7721特異核酸適體，PCR擴增文庫，製備DNA單鏈文庫，然後經過重複篩選、陰性篩選、多輪篩選等步驟後，得到可用於檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的核酸適體。本發明的核酸適體可在識別人肝癌細胞株SMMC-7721或者製備檢測人肝癌細胞株SMMC-7721的試劑盒中應用，具有特異性強、無免疫原性、分子量小、穩定、易於保存和標記等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102766693SQ20121025902
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者周玉, 王柯敏, 羊小海, 譚譽宇, 郭秋平 申請人:湖南大學