一種游離肝癌細胞的檢測和分選方法

2023-08-07 05:18:31 1

專利名稱：一種游離肝癌細胞的檢測和分選方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種游離肝癌細胞的檢測和分選方法。
技術背景腫瘤轉移是一個多階段、多步驟的複雜過程。存在於原發瘤和轉移瘤之外的腫瘤細胞統 稱為游離腫瘤細胞(Isolated tumor cell, ITC)，亦稱播散腫瘤細胞(Disseminated tumor cell, DTC)，包括淋巴結、骨髓和血液等組織中的單個或小簇腫瘤細胞。其中進入血流的又 稱循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell, CTC)。原發性肝細胞癌是我國最常見、多發的惡性腫瘤之一。儘管近年來治療手段不斷增加， 但並沒有從根本上改變肝癌高死亡率的狀況。究其原因，轉移復發率高是影響肝癌遠期療效 的主要因素。肝癌細胞可以在很早期播散，大多通過血液和淋巴系統轉移，甚至播散到胸水、 腹水等體液中。因此，游離肝癌細胞檢測可以作為肝癌早期診斷的一個標記物、作為肝癌細 胞隱匿播散的一個確鑿證據以及作為監測療效和預測復發的一個獨立指標。以往通常採用RT-PCR檢測白蛋白和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)mRNA來檢測血 循環中的肝癌細胞，但RT-PCR法有其固有局限，如特異性不高、操作耗時且難以標準化、不 能估算樣本中腫瘤細胞的數目等。流式細胞術(flow cytometry, FCM)是一種採用流式細胞儀對懸浮的細胞或其它生物微 粒逐個進行多參數的快速定量分析和分選的技術。其中，流式細胞分選技術又稱螢光激活細 胞分選技術(fluorescence-activated cell sorting, FACS)。目前FCM已被用於檢測神經 母細胞瘤、血液系統腫瘤、乳腺癌、前列腺癌病人的CTC。相比於RT-PCR法，FCM具有省時、 操作易標準化等優點，並可進行CTC計數，因而可提供更準確的診斷信息。遺撼的是，由於缺乏相應的肝癌細胞表面抗體，迄今未見FCM用於檢測和分選游離肝癌 細胞的報導。雖然從理論上講上皮細胞表面抗體也可被用來檢測和分選屬於上皮類的肝癌細 胞，但是這些抗體通常只能識別部分肝癌細胞。比如上皮細胞表面抗體Ber-EP4單抗只能 識另ij約67%白勺肝癌細月包(Latza U et al. Ber—EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelial [J]. J Clin Pathol， 1990, 43(3):213-9.)。Ashwell和Morell於20世紀60年代發現，哺乳動物的肝實質細胞膜表面存在一種肝結合蛋白——去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein rec印tor， ASGPR)，又稱半乳糖受體 (Morell AG et al. Physical and chemical studies on ceruloplasmin. V. Metabolic studies on sialic acid-free ceruloplasmin in vivo J Biol Chem, 1968，243(1) :155-159.) 。 ASGPR是一種跨膜蛋白，其胞外區含有糖識別區(carbohydrate recognition domain, CRD)，能專一性識別和結合以半乳糖殘基和N-乙醯半乳糖胺殘基為 端基的糖蛋白(配體)。ASGPR主要表達於哺乳動物肝竇狀隙的肝實質細胞表面，密度很高， 每個肝細胞表面可多達500,000個受體。這一特性己被用於設計多種實驗研究。.比如，利用 放射性核素標記上述糖蛋白進行肝顯像；而以上述糖蛋白為載體介導基因或藥物導向肝實質 細胞，則是肝靶向治療領域的一個研究命題。但至今未有基於ASGPR檢測或分選游離肝癌細 胞的報導。因此，本領域迫切需要開發一種敏感性高、特異性強、易於操作，而又對受試者無損傷 的肝癌細胞的檢測和分選方法。發明內容本發明的目的是提供一種游離肝癌細胞的檢測和分選方法，以及本發明方法所分選到的 肝癌細胞。本發明的第一方面提供了一種肝癌細胞的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟(a) 採集樣品；(b) 從樣品中分離單個核細胞；(c) 以與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異結合的物質A與單個核細胞中的肝癌細胞結合，形成複合物B;(d) 以螢光素間接標記複合物B;(e) 用流式細胞儀檢測樣品中的肝癌細胞。 上述物質A選自ASGPR的配體或抗體。上述步驟(b)中採取的分離方法為密度梯度細胞分離法。 上述樣品選自骨髓、血液或其他體液。 上述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。上述物質A為ASGPR的配體，上述ASGPR的配體為可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白、 糖、多肽或核酸。上述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為以半乳糖殘基或N-乙醯半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白，優選去唾液酸胎球蛋白。上述物質A為ASGPR的配體，上述步驟(c)中ASGPR的配體與生物素相連接。 上述步驟(d)中採用螢光素-鏈黴親和素或螢光素-生物素抗體標記複合物B。 上述步驟(c)中去唾液酸胎球蛋白反應濃度為0. 1-0. 8mg/ml ，較佳的反應濃度為0. 4-0. 8mg/ml ，優選0. 4mg/ml 。在另一實施例中，上述物質A為ASGPR胞外區的單克隆抗體，如小鼠抗人ASGPR單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。優選小鼠抗人ASGPR單抗。 所述步驟(d)中採用螢光素-二抗標記複合物B。上述步驟(c)中ASGPR單抗的反應濃度為0. 1-5.0ng/ml，較佳的反應濃度為2. 0-5. 0 y g/ml ，優選2. 0 ti g/ml 。上述步驟(e)採用FACSAria流式細胞儀(Becton Dickinson公司)及CellQuest軟體 檢測分析。本發明的第二方面提供了一種肝癌細胞的分選方法，所述分選方法包括以下步驟(a) 採集樣品；(b) 從樣品中分離單個核細胞；(c) 以與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異結合的物質A與單個核細胞中的肝癌細胞結 合，形成複合物B;(d) 以螢光素間接標記複合物B;(e) 用流式細胞儀分選樣品中的肝癌細胞。 上述物質A選自ASGPR的配體或抗體。上述步驟(b)中採取的分離方法為密度梯度細胞分離法。 上述樣品選自骨髓、血液或其他體液。 上述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。上述物質A為ASGPR的配體。上述ASGPR的配體為可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白、 糖、多肽或核酸。所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為以半乳糖殘基或N-乙醯半乳糖胺 殘基為端基的糖蛋白，優選去唾液酸胎球蛋白。上述物質A為ASGPR的配體，上述步驟(c)中ASGPR的配體與生物素相連接。 上述步驟(d)中採用螢光素-鏈黴親和素或螢光素-生物素抗體標記複合物B。 上述步驟(c)中去唾液酸胎球蛋白反應濃度為0. 1-0. 8mg/ml ，較佳的反應濃度為 0. 4-0. 8mg/ml,優選0. 4mg/ml 。在另一實施例中，上述物質A為ASGPR胞外區的單克隆抗體，如小鼠抗人ASGPR單抗、 兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。優選小鼠抗人ASGPR單抗。
上述步驟(c)中ASGPR單抗的反應濃度為O. 1-5.0 ug/ml，較佳的反應濃度為2. 0-4. 0 U g/ml ，優選2. 0 y g/ml 。
上述步驟(d)中採用螢光素-二抗標記複合物B。
上述步驟(e)採用FACSAria流式細胞儀(Becton Dickinson公司)及CellQuest軟體進 行分選。
本發明的第三方面提供了上述分選方法分選到的肝癌細胞。
按照上述分選方法分選到的肝癌細胞完整無破壞。所述肝癌細胞可以用於形態學觀察、 免疫細胞化學染色、免疫螢光染色，從而進行鑑定、計數；並可用於培養擴增以及進一步的 分子生物學研究。
發明人利用ASGPR配體或針對ASGPR胞外區的單克隆抗體，創建了基於ASGPR的流式細 胞儀檢測和分選游離肝癌細胞的技術，從而解決了由於缺乏特異的肝癌細胞表面單克隆抗體 所面臨的困擾。由於正常肝細胞不會進入血循環或體液中，只有肝癌細胞才有可能，因此按 照本發明方法檢測和分選到的細胞就是肝癌細胞。上皮細胞抗體Ber-EP4單抗只能識別約67% 的肝癌細胞，而ASGPR配體或針對ASGPR胞外區的單抗則可識別絕大多數肝癌細胞。利用本 發明方法檢測和分選游離肝癌細胞，敏感性高，特異性強，易於操作，對受試者幾乎無損傷。
本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1.氨基生物素試劑Sulfo-NHS-1C-Biotin與蛋白質的反應原理。 圖2.不同濃度的生物素化去唾液酸胎球蛋白標記H印3B細胞的流式圖。 A、 B、 C中，生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度依次為O. 2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.8mg/ml。 D 中，生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml。
圖3.不同濃度的小鼠抗人ASGPR單抗標記H印3B細胞的流式圖。
A、 B、 C中，小鼠抗人ASGPR單抗濃度依次為1.0ug/ml、 2. 0yg/ml、 4. 0ug/tnl。 D中， 小鼠抗人ASGPR單抗濃度為2. 0ug/ml。
圖4.採用ASGPR配體檢測肝癌患者外周血游離肝癌細胞的流式圖。 圖5.採用ASGPR抗體檢測肝癌患者外周血游離肝癌細胞的流式圖。 圖6.採用ASGPR配體從肝癌患者外周血中分選到的游離肝癌細胞。圖7.採用ASGPR抗體從肝癌患者外周血中分選到的游離肝癌細胞。
具體實施方式
如本文所述"二抗"，通常也稱第二抗體，是相對第一抗體而言的。在本發明中，ASGPR 為抗原，ASGPR抗體為第一抗體，針對ASGPR抗體的抗體是二抗。在本發明中， 一抗為小鼠 抗人ASGPR單抗，則二抗就是抗小鼠抗體；如果一抗為兔抗人ASGPR單抗，則二抗就是抗兔 抗體。本發明所述其他體液為除血液外的常規體液，包括但不限於淋巴液、胸水、腹水。本文所述"反應濃度"為步驟(c)中與肝癌細胞上的ASGPR結合時，ASGPR的配體或者抗 體的初始濃度。在具體實施例中，為去唾液酸胎球蛋白的初始濃度或小鼠抗人ASGPR單抗的 初始濃度。在本發明中，分別通過在分離到的單個核細胞中加入無血清DMEM培養液或PBS洗 液來調節ASGPR的配體或抗體的初始濃度。本發明所述"多肽"是指由3-50個胺基酸通過醯胺鍵(也稱肽鍵)相互連接而成的化合 物。胺基酸數目在50個以上的多肽稱為蛋白質。本發明所述"糖"包括多糖和單糖。單糖如半乳糖或N-乙醯半乳糖等，均可以作為配體 與肝癌細胞上的ASGPR結合。本發明所述步驟(b)中從樣品中分離單個核細胞的方法有多種方法。如可以採用Ficoll或Percoll等密度梯度液分離單個核細胞，也可以採用紅細胞裂解液裂解樣品中的紅細胞，再離心獲得單個核細胞。本發明所述螢光素間接標記指，ASGPR的抗體先與目的細胞(即肝癌細胞)上的ASGPR結合，然後用螢光素-二抗與ASGPR的抗體結合；或者先用生物素化的ASGPR的配體與目的細胞(即肝癌細胞)上的ASGPR結合，再用螢光素-生物素抗體或螢光素-鏈黴親和素與目的細胞上的生物素結合。因此間接標記複合物B後，其結構為目的細胞-ASGPR的抗體-二抗-螢光素、目的細胞-ASGPR的配體-生物素-生物素抗體-螢光素或目的細胞-ASGPR的配體-生物素-鏈黴親和素-螢光素。本發明所述螢光素選自異硫氰酸螢光素(FITC)、四乙基羅達明、四甲基異硫氰酸羅達 明或藻紅蛋白(PE)。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用 於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重 量計算。
實施例l生物素化去唾液酸胎球蛋白的製備
主要材料氨基生物素化試劑Sulfo-NHS-1C-Biotin (Pierce)，去唾液酸胎球蛋白 (Sigma) ， BCA蛋白定量試劑盒(Pierce) ， L-賴氨酸(國藥)，離心超濾管(截留分子量 50, 000) (Millipore)。
實驗歩驟去唾液酸胎球蛋白與氨基生物素化試劑反應按照產品說明書進行。氨基生物 素化試劑Sulfo-NHS-1C-Biotin能選擇性地和蛋白質中的游離氨基發生反應，反應式如圖1 所示。
反應結束後，將反應液移入離心超濾管，25°C, 4000g，離心20min。然後在離心管中加 入雙蒸水和L-賴氨酸，使總體積為3ml， L-賴氨酸終濃度為0. 08mg/ml，室溫放置lh。再將 離心超濾管於25°C， 4000g，離心20niin。吸出超濾管中殘留液體，加適量雙蒸水稀釋。用 BCA蛋白定量試劑盒按照說明書操作，測定生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度。最後用雙蒸水 調整去唾液酸胎球蛋白濃度為3mg/ml， 0.22um濾器無菌過濾後50ul/管分裝，-2(TC保存。
實施例2確定ASGPR配體和抗體的理想流式工作濃度
1.以下實驗用流式細胞儀驗證生物素化去唾液酸胎球蛋白與ASGPR的反應性，及確定生 物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。
主要材料PE標記的小鼠抗人CD45單抗(IgGl)、 PE標記的小鼠同型單抗(IgGl) 、 FITC 標記的鏈黴親和素，均購自晶美公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自製。PBS洗液 (PBS+1%FBS),自配。
實驗步驟
1) 計數500萬個H印3B肝癌細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)，20°C, 300g，離心5min，棄上清，用550 u 1無血清DMEM培養液重懸，充分混勻，100nl/管，分裝 入5個EP管，依次編為1 5號。l號管為空白對照管，2號管為同型對照管，3 5號管為 測試管。
2) 向3 5號管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3 5號管生物素化去唾液酸胎 球蛋白的終濃度依次為0. 2mg/ml、 0.4mgM、 0.8mg/ml'終體積均為150nl (體積不足部分 用無血清DMEM培養液補充)。向1、 2號管中各加入無血清DMEM培養液50ul。 1 5號管37。C孵育lh。
3) 向1 5號管中各加入lml PBS洗液，2(TC, 300g，離心5min，棄上清。重複1次。
4) 向1 5號管中各加入100u 1無血清DMEM培養液。向2 5號管中各加入10 y 1 FITC 標記的鏈黴親和素。向1號管中加入10 u 1無血清DMEM培養液。1 5號管室溫避光孵育20min。
5) 向1 5號管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。 每管500ul PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果
圖2中，A、 B、 C所對應的生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度依次為0.2mg/ml、 0.4mg/ml、
0. 8mg/ml。從圖中可以看出，當生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度從0. 2mg/ml增加到0. 4mg/ml 時，H印3B細胞螢光強度也相應增加；而當濃度繼續增加到0.8mg/ml時，H印3B細胞螢光強 度與濃度為0. 4mg/ml時相比並未增加。可見，生物素化去唾液酸胎球蛋白與ASGPR的反應性 好，當生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml時，H印3B細胞表面的ASGPR即已飽和； 而當濃度為0.8tng/ml時，生物素化去唾液酸胎球蛋白是過量的。故選擇0.4mg/ml作為生物 素化去唾液酸胎球蛋白的候選流式工作濃度。
以下實驗進一步評價0. 4mg/ml是否為生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。 實驗步驟
1) 計數250萬個HL-60細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)和100萬個 H印3B肝癌細胞，混合後2(TC， 300g,離心5min，棄上清，用350 u 1無血清DMEM培養液重 懸，充分混勻，100wl/管，分裝入3個EP管，依次編為1 3號。l號管為空白對照管，2號 管為同型對照管，3號管為測試管。
2) 向3號管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3號管生物素化去唾液酸胎球蛋白 的終濃度為0.4mg/ml，終體積均為150ul (體積不足部分用無血清DMEM培養液補充)。向
1、 2號管中各加入無血清DMEM培養液50ul 。 1 3號管37'C孵育lh。
3) 向1 3號管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。
4) 向1 3號管中各加入10(Hi 1無血清DMEM培養液。向3號管中各加入l(Hi 1 PE標記 的小鼠抗人CD45單抗和10ul FITC標記的鏈黴親和素。向2號管中加入10ul PE標記的小 鼠同型單抗和10li 1 FITC標記的鏈黴親和素。向1號管中加入20y 1無血清DMEM培養液。1 3號管室溫避光孵育20min。
5) 向1 3號管中各加入lml PBS洗液，20'C, 300g，離心5min，棄上清。重複1次。每管500u 1 PBS洗液重懸。6) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果圖2 (D)中，橫坐標為ASGPR-FITC，縱坐標為CD45-PE。 CD45-ASGPR+定義為H印3B細胞， CD45+ASGPR—定義為HL-60細胞，CD45+ASGPR+定義為非特異性染色細胞。從圖中可以看出，當 生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為0. 4mg/ml時，H印3B細胞被充分標記，且無非特異性染色。 可見，0.4mg/ml為生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作濃度。2、流式細胞儀驗證小鼠抗人ASGPR單抗與ASGPR胞外域的反應性，及確定小鼠抗人ASGPR 單抗的理想流式工作濃度。主要材料小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，為法國Dendritics公司產品。小鼠同型單抗 (IgGl) 、 FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體、PE標記的大鼠抗人CD45單抗(IgG2a)、 PE標 記的大鼠同型單抗(IgG2a)，均購自晶美公司。PBS洗液(PBS+1%FBS)，自配。FACSAria 流式細胞儀，為Becton Dickinson公司產品。實驗步驟-1) 計數500萬個H印3B肝癌細胞，20。C， 300g，離心5min，棄上清，用550y 1 PBS洗 液重懸，充分混勻，100y 1/管，分裝入5個EP管，依次編為1 5號。l號管為空白對照管， 2號管為同型對照管，3 5號管為測試管。2) 向3 5號管中加入小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，使得3 5號管小鼠抗人ASGPR單抗 的終濃度依次為1.0ug/ml、 2.0ug/ml、 4. 0 n g/ml ，終體積均為110yl。向1號管中加入 PBS洗液10y 1，向2號管中加入10u 1小鼠同型單抗(IgGl)。l 5號管室溫避光孵育20min。3) 向1 5號管中各加入lml PBS洗液，2(TC, 300g，離心5min，棄上清。重複1次。4) 向1 5號管中各加入100y 1 PBS洗液。向2 5號管中各加入10u 1 FITC標記的大 鼠抗小鼠IgGl。向l號管中加入10ul PBS洗液。1 5號管室溫避光孵育20min。5) 向1 5號管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。 每管500ul PBS洗液重懸。6) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果圖3中，A、 B、 C所對應的小鼠抗人ASGPR單抗濃度依次為1.0ug/ml、 2.0ug/ml、 4.0 Ug/ml。從圖中可以看出，當小鼠抗人ASGPR單抗濃度為2. 0ug/ml和4. Oixg/ml時，H印3B細胞螢光強度也相應增加；而當濃度繼續增加到4. 0ug/ml時，H印3B細胞螢光強度與濃度 為2. Oug/ml時相比並未增加。可見，小鼠抗人ASGPR單抗與ASGPR的反應性好，當小鼠抗 人ASGPR單抗濃度為2. 0 p g/ml時，H印3B細胞表面的ASGPR即已飽和；而當濃度為4. 0 u g/ml 時，小鼠抗人ASGPR單抗是過量的。故選擇2. Oug/ml作為小鼠抗人ASGPR單抗的候選流式 工作濃度。
以下實驗進一步評價2. 0 u g/ml是否為小鼠抗人ASGPR單抗的理想流式工作濃度。 實驗步驟
1) 計數250萬個HL-60細胞和100萬個H印3B肝癌細胞，混合後20。C， 300g，離心5min， 棄上清，用350n 1 PBS洗液重懸，充分混勻，100ul/管，分裝入3個EP管，依次編為1 3 號。l號管為空白對照管，2號管為同型對照管，3號管為測試管。
2) 向3號管中加入小鼠抗人ASGPR單抗，使終濃度為2. Oug/ml，終體積為110ul。向 1號管中加入PBS洗液10ul，向2號管中加入10"1小鼠同型單抗(IgGl) 。 1 3號管室 溫避光孵育20min。
3) 向1 3號管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。
4) 向1 3號管中各加入100p1PBS洗液。向3號管中各加入10ul PE標記的小鼠抗人 CD45單抗(IgG2a)和10ul FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。向2號管中加入10pl PE 標記的大鼠同型單抗(IgG2a)和10ulFITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。向1號管中加入 20ylPBS洗液。1 3號管室溫避光孵育20min。
5) 向1 3號管中各加入lml PBS洗液，2CTC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。 每管500yl PBS洗液重懸。
6) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果
圖3 (D)中，橫坐標為ASGPR-FITC,縱坐標為CD45-PE。 CD45-ASGPR+定義為H印3B細胞， CD45+ASGPR—定義為HL-60細胞，CD45+ASGPR+定義為非特異性染色細胞。從圖中可以看出，當 生物素化去唾液酸胎球蛋白濃度為2. Opg/ml時，H印3B細胞被充分標記，且無非特異性染 色。可見，2.0yg/ml是小鼠抗人ASGPR單抗的理想流式工作濃度。
實施例3採用ASGPR配體檢測游離肝癌細胞
即基於生物素化去唾液酸胎球蛋白的流式細胞儀檢測游離肝癌細胞的技術。採用Ficoll 分離外周血單個核細胞，然後先用生物素化去唾液酸胎球蛋白作為配體與肝癌細胞膜上的ASGPR結合，再用生物素抗體-FITC (也可以用鏈黴親和素-FITC)與生物素化去唾液酸胎球 蛋白結合，從而使肝癌細胞被間接螢光標記。接著用小鼠抗人CD45-PE標記外周血單個核細 胞。然後用流式細胞儀即可檢測到標本中是否含有游離肝癌細胞(CD45—ASGPR+定義為肝癌細 胞，CD45+ASGPR—定義為血細胞)。
主要材料10ml肝癌患者志願者外周血(肝素抗凝)。Ficoll-Paque Plus,購自GE Healthcare。 PE標記的小鼠抗人CD45單抗(IgGl) 、 PE標記的小鼠同型單抗(IgGl) 、 FITC 標記的鏈黴親和素，均購自晶美公司。無血清DMEM培養液，購自Gibco公司。PBS洗液(含 0. 5%BSA、80U/ml肝素)，自配。FACSAria流式細胞儀、Trucount絕對計數管、鞘流液FACSFlow， 均為Becton Dickinson公司產品。
實驗步驟
(1) Ficoll分離外周血單個核細胞
1) 將患者10ml肝素抗凝血、0. 4ml肝素、10mlPBS洗液於50ml離心管中混勻，平鋪於 14mlFicoll上，18°C， 600g，離心25min。
2) 吸棄上層血清。
3) 吸取單個核細胞層，置於15ml離心管中。
4) 加3倍體積PBS洗液，18°C， 300g，離心10min。
5) 吸棄上清，8ml PBS洗液重懸，18'C， 300g，離心10min。
6) 徹底吸棄上清。
(2) 流式細胞儀檢測游離肝癌細胞
1) 將上述步驟所獲患者單個核細胞用200 ul PBS洗液重懸，100nl/每管分裝入2個 L5ml EP管中，分別標為同型對照管和測試管。
2) 向測試管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，並加入PBS洗液，使生物素化去唾液酸 胎球蛋白的終濃度為0. 4mg/ml，終體積為150u 1。向同型對照管中加入50 p 1 PBS洗液。 37。C孵育lh。
3) 每管各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。
4) 每管各用lO(Hil PBS洗液重懸細胞，測試管中加入10ul PE標記的小鼠抗人CD45 單抗和10ul FITC標記的鏈黴親和素。同型對照管中加入10nl PE標記的小鼠同型單抗和 10 ul FITC標記的鏈黴親和素。室溫避光孵育20min。
5) 各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。
6) 毎管500u 1 PBS洗液重懸，並移入2個Trucount絕對計數管中，混勻，相應標為同型對照管和測試管。7) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果如圖4, CD45-ASGPR+定義為播散肝癌細胞，CD45'ASGPR—定義為血細胞。 同型對照管未檢測到CD45—ASGPR+細胞(游離肝癌細胞)(圖4A)。測試管檢測到11個CD45—ASGPR+細胞(游離肝癌細胞)(圖4B)，即該肝癌患者5ml血中 含ll個游離肝癌細胞。實施例4採用ASGPR抗體檢測游離肝癌細胞即基於ASGPR單抗的流式細胞儀檢測游離肝癌細胞的技術。採用Ficoll分離外周血單個 核細胞，然後先用小鼠抗人ASGPRIgGl與肝癌細胞膜上的ASGPR結合，再用大鼠抗小鼠IgGl 抗體-FITC與小鼠抗人ASGPR IgGl結合，從而使肝癌細胞被間接螢光標記。接著用大鼠抗人 CD45-PE標記外周血單個核細胞。然後用流式細胞儀即可檢測到標本中是否含有游離肝癌細 胞(CD45—ASGPR+定義為肝癌細胞，CD45+ASGPR—定義為血細胞)。主要材料10ml肝癌患者志願者外周血(肝素抗凝)。Ficoll-Paque Plus,購自GE Healthcare。小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，為法國Dendritics公司產品。小鼠抗人同型單抗 (IgGl) 、 FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體、PE標記的大鼠抗人CD45單抗(IgG2a)、 PE標 記的大鼠同型單抗(IgG2a),均購自晶美公司。PBS洗液(含1，BS、 80U/ml肝素)，自配。 FACSAria流式細胞儀、Trucount絕對計數管、鞘流液FACSFlow，均為Becton Dickinson公 司產品。實驗步驟(1) Ficoll分離外周血單個核細胞1) 將患者10ml肝素抗凝血、0. 4ml肝素、10mlPBS洗液於50ml離心管中混勻，平鋪於 14ml Ficoll上，18°C， 600g，離心25min。2) 吸棄上層血清。3) 吸取單個核細胞層，置於15ml離心管中。4) 加3倍體積PBS洗液，1S。C， 300g，離心10min。5) 吸棄上清，8mlPBS洗液重懸，18°C， 300g，離心10min。6) 徹底吸棄上清。(2) 流式細胞儀檢測游離肝癌細胞-.1) 將上述步驟所獲患者單個核細胞用200ul PBS洗液重懸，100ul/每管分裝入2個 1.5ml EP管中，分別標為同型對照管和測試管。2) 向測試管中加入小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，使小鼠抗人ASGPR單抗的終濃度為2.0 Pg /ml，終體積為110iU。向同型對照管中加入lOul小鼠同型單抗(IgGl)。室溫 避光孵育20min。3) 每管各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。4) 每管各用100nl PBS洗液重懸細胞，測試管中加入10ul PE標記的大鼠抗人CD45 單抗(IgG2a)和10y 1 FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。同型對照管中加入10ul PE標記 的大鼠同型單抗(IgG2a)禾卩10y 1 FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。室溫避光孵育20min。5) 每管各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。6) 每管500u 1 PBS洗液重懸，並移入2個Trucount絕對計數管中，混勻，相應標為同 型對照管和測試管。7) FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體檢測分析。 結果如圖5， CD45-ASGPR+定義為游離肝癌細胞，CD45+ASGPR—定義為血細胞。 同型對照管未檢測到CD45—ASGPR+細胞(游離肝癌細胞)(圖5A)。測試管檢測到15個CD45—ASGPR+細胞(游離肝癌細胞)(圖5B)，即該肝癌患者5ml血中 含15個游離肝癌細胞。實施例5利用ASGPR配體分選游離肝癌細胞即基於生物素化去唾液酸胎球蛋白的流式細胞儀分選游離肝癌細胞的技術。採用Ficoll 分離外周血單個核細胞，然後先用生物素化去唾液酸胎球蛋白作為配體與肝癌細胞膜上的 ASGPR結合，再用抗生物素抗體-FITC (也可以用親和素-FITC)與生物素化去唾液酸胎球蛋 白結合，從而使肝癌細胞被間接螢光標記。接著用小鼠抗人CD45-PE標記外周血單個核細胞。 然後用流式細胞儀即可分選標本中的游離肝癌細胞(CD45—ASGPR+定義為肝癌細胞，CD45+ASGPR— 定義為血細胞)。主要材料10ml肝癌患者志願者外周血(肝素抗凝)。Ficoll-P叫ue Plus,購自GE Healthcare。 PE標記的小鼠抗人CD45單抗(IgGl) 、 PE標記的小鼠同型單抗(IgGl) 、 FITC 標記的鏈黴親和素，均購自晶美公司。無血清固EM培養液，購自Gibco公司。PBS洗液(含 0. 5%BSA、 80U/ml肝素)，自配。FACSAria流式細胞儀、分選質控試劑Accudrop Beads、鞘流液FACSFlow，均為Becton Dickinson公司產品。 實驗步驟(1) Ficoll分離外周血單個核細胞1) 將患者10ml肝素抗凝血、0. 4ml肝素、10mlPBS洗液於50ml離心管中混勻，平鋪於 14mlFico11上，18°C, 600g，離心25min。2) 吸棄上層血清。3) 吸取單個核細胞層，置於15ml離心管中。4) 加3倍體積PBS洗液，18°C， 300g，離心10min。5) 吸棄上清，8ml PBS洗液重懸，18°C， 300g，離心10min。6) 徹底吸棄上清。(2) 流式細胞儀檢測游離肝癌細胞1) 將上述步驟所獲患者單個核細胞用200 u 1 PBS洗液重懸，100y 1/每管分裝入2個 L5ml EP管中，分別標為同型對照管和測試管。2) 向測試管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，並加入PBS洗液，使生物素化去唾液酸 胎球蛋白的終濃度為0. 4mg/ml，終體積為150ti 1。向同型對照管中加入50u 1 PBS洗液。 37。C孵育lh。3) 每管各加入lml PBS洗液'20°C, 300g，離心5tnin，棄上清。重複1次。4) 每管各用100ul PBS洗液重懸細胞，測試管中加入10ul PE標記的小鼠抗人CD45 單抗和10ul FITC標記的鏈黴親和素。同型對照管中加入10yl PE標記的小鼠同型單抗和 10yl FITC標記的鏈黴親和素。室溫避光孵育20min。5) 各加入lml PBS洗液，20'C， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。6) 每管50(Ui 1 PBS洗液重懸。7) 採用FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體進行分析和分選。 結果-將測試管分選到的細胞懸液離心塗片後，用CK3-6H5抗體進行免疫細胞化學染色，見圖 6。如圖所示視野中有2個胞槳呈棕黃色(圖中為深灰色)的細胞，即肝癌細胞。實施例6 利用ASGPR抗體分選游離肝癌細胞即基於ASGPR單抗的流式細胞儀分選游離肝癌細胞的技術。採用Ficoll分離外周血單個 核細胞，然後先用小鼠抗人ASGPRIgGl與肝癌細胞膜上的ASGPR結合，再用大鼠抗小鼠IgGl抗體-FITC與小鼠抗人ASGPR IgGl結合，從而使肝癌細胞被間接螢光標記。接著用大鼠抗人 CD45-PE標記外周血單個核細胞。然後用流式細胞儀即可分選標本中的游離肝癌細胞 (CD45ASGPR+定義為肝癌細胞，CD45'ASGPR—定義為血細胞)。主要材料10ml肝癌患者志願者外周血(肝素抗凝)。Ficoll-P叫ue Plus,購自GE Healthcare。小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，為法國Dendritics公司產品。小鼠抗人同型單抗 (IgGl) 、 FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體、PE標記的大鼠抗人CD45單抗(IgG2a)、 PE標 記的大鼠同型單抗(IgG2a)，均購自晶美公司。PBS洗液(含1，BS、 80U/ml肝素)，自配。 FACSAria流式細月包儀、分選質控試齊U Accudrop Beads、鞘流液FACSFlow，均為Becton Dickinson公司產品。實驗步驟(1) Ficoll分離外周血單個核細胞1) 將患者10ml肝素抗凝血、0.4ml肝素、10mlPBS洗液於50ml離心管中混勻，平鋪於 14ml Ficoll上，1S。C， 60。g，離心25min。2) 吸棄上層血清。3) 吸取單個核細胞層，置於15ml離心管中。4) 加3倍體積PBS洗液，18°C， 300g，離心10min。5) 吸棄上清，8mlPBS洗液重懸，18°C， 300g，離心10min。6) 徹底吸棄上清。(2) 流式細胞儀檢測游離肝癌細胞1) 將上述步驟所獲患者單個核細胞用200ul PBS洗液重懸，100ul/每管分裝入2個 L5ml EP管中，分別標為同型對照管和測試管。2) 向測試管中加入小鼠抗人ASGPR單抗(IgGl)，使小鼠抗人ASGPR單抗的終濃度為2.0 Ug /ml，終體積為110 ul。向同型對照管中加入10 ul小鼠同型單抗(IgGl)。室溫 避光孵育20min。3) 每管各加入lml PBS洗液，20。C， 300g,離心5min，棄上清。重複1次。4) 每管各用100ul PBS洗液重懸細胞，測試管中加入10ul PE標記的大鼠抗人CD45 單抗(IgG2a)和10ul FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。同型對照管中加入10ul PE標記 的大鼠同型單抗(IgG2a)禾UlOu 1 FITC標記的大鼠抗小鼠IgGl抗體。室溫避光孵育20min。5) 每管各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，離心5min，棄上清。重複1次。6) 每管500u 1 PBS洗液重懸。7)採用FACSAria流式細胞儀及CellQuest軟體進行分析和分選。 結果-
將測試管分選到的細胞懸液離心塗片後，用CK3-6H5抗體進行免疫細胞化學染色，見圖 7。如圖所示視野中有3個胞漿呈棕黃色(圖中為深灰色)的細胞，即肝癌細胞。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作 為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本 發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種肝癌細胞的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟(a)採集樣品；(b)從樣品中分離單個核細胞；(c)以與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異結合的物質A與單個核細胞中的肝癌細胞結合，形成複合物B；(d)以螢光素間接標記複合物B；(e)用流式細胞儀檢測樣品中的肝癌細胞。
2. 權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述物質A選自ASGPR的配體或抗體。
3. 權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(b)中採取的分離方法為密度梯度細 胞分離法。
4. 權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，所述樣品選自骨髓、血液或其他體液。
5. 權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於，所述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。
6. 權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR的配體，所述ASGPR的配 體為可與ASGPR的糖識別區(CRD)特異結合的蛋白、糖、脂類、多肽或核酸。
7. 權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為以半 乳糖殘基或N-乙醯半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白。
8. 權利要求7所述的檢測方法，其特徵在於，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為去唾 液酸胎球蛋白。
9. 權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR胞外區的抗體。
10. 權利要求9所述的檢測方法，其特徵在於，所述抗體為單克隆抗體。
11. 權利要求l-8任一權利要求所述的檢測方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR的配體， 所述步驟(c)中ASGPR的配體與生物素相連接，步驟(d)中採用螢光素-鏈黴親和素或螢光 素-生物素抗體標記複合物B。
12. 權利要求8所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(c)中去唾液酸胎球蛋白的反應濃 度為0. 1-0. 8mg/ml。
13. 權利要求11或12所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(c)中去唾液酸胎球蛋白的 反應濃度0. 4-0.8mg/ml。
14. 權利要求10所述的檢測方法,其特徵在於，所述抗體為小鼠抗人ASGPR單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
15. 權利要求14所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(d)中採用螢光素-二抗標記複合 物B。
16. 權利要求14所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(c)中ASGPR單抗的反應濃度為 0. 1-5. 0u g/ml。
17. 權利要求16所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(c)中ASGPR單抗的反應濃度為 2. 0-4. g/ml。
18. 權利要求17所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(c)中抗體為小鼠抗人ASGPR單抗。
19. 一種肝癌細胞的分選方法，其特徵在於，包括以下步驟(a) 採集樣品；(b) 從樣品中分離單個核細胞；(c) 以與去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異結合的物質A與單個核細胞中的肝癌細胞結合， 形成複合物B;(d) 以螢光素間接標記複合物B;(e) 用流式細胞儀分選肝癌細胞。
20. 權利要求19所述的分選方法，其特徵在於，所述物質A選自ASGPR的配體或抗體。
21. 權利要求19所述的分選方法，其特徵在於，所述步驟(b)中採取的分離方法為密度梯度 細胞分離法。
22. 權利要求19所述的分選方法，其特徵在於，所述樣品選自血液、骨髓或其他體液。
23. 權利要求22所述的分選方法，其特徵在於，所述其他體液為淋巴液、胸水或腹水。
24. 權利要求20所述的分選方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR的配體，所述ASGPR的 配體為可與ASGPR的糖識別區(CRD)特異結合的蛋白、糖、多肽或核酸。
25. 權利要求24所述的分選方法，其特徵在於，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為以 半乳糖殘基或N-乙醯半乳糖胺殘基為端基的糖蛋白。
26. 權利要求25所述的分選方法，其特徵在於，所述可與ASGPR的CRD特異結合的蛋白為去 唾液酸胎球蛋白。
27. 權利要求26所述的分選方法，其特徵在於，所述步驟(c)中去唾液酸胎球蛋白的反應濃 度為0. 1-0. 8mg/ml。
28. 權利要求27所述的分選方法，其特徵在於，所述步驟(c)中去唾液酸胎球蛋白的反應濃 度為0. 4-0. 8mg/ml。
29. 權利要求20所述的分選方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR胞外區的單克隆抗體。
30. 權利要求29所述的分選方法，其特徵在於，所述ASGPR胞外區的抗體為小鼠抗人ASGPR 單抗、兔抗人ASGPR單抗或大鼠抗人ASGPR單抗。
31. 權利要求19-23任一權利要求所述的分選方法，其特徵在於，所述物質A為ASGPR的配體， 所述步驟(c)中ASGPR的配體與生物素相連接，步驟(d)中採用螢光素-鏈黴親和素或螢光 素-生物素抗體標記複合物B。
32. 權利要求30所述的分選方法，其特徵在於，所述步驟(d)中採用螢光素-二抗標記複合 物B。
33. 權利要求30所述的分選方法，其特徵在於，所述步驟(c)中ASGPR單抗的反應濃度為 0. 1-5. Ou g/ml。
34. 權利要求33所述的分選方法，其特徵在於，所述步驟(c)中ASGPR單抗的反應濃度為 2. 0-4. 0 u g/ml 。
35. 權利要求35所述的分選方法，其特徵在於，所述步驟(c)中抗體為小鼠抗人ASGPR單抗。
36. 權利要求19-30、 32-35任一權利要求所述的分選方法分選到的肝癌細胞。
37. 權利要求31所述的分選方法分選到的肝癌細胞。
全文摘要
本發明提供了一種游離肝癌細胞的檢測方法，所述檢測方法基於肝癌細胞膜上的去唾液酸糖蛋白受體，利用去唾液酸糖蛋白受體的配體或者抗體與肝癌細胞結合形成複合物，然後用螢光素間接標記所述複合物，再用流式細胞儀對樣品中的肝癌細胞進行檢測計數或分選。該方法可用於肝癌的診斷、轉移復發預測及療效監測等。本發明方法可以檢測和分選游離肝癌細胞，其敏感性高、特異性好，且操作簡便。
文檔編號G01N33/48GK101303352SQ20081004019
公開日2008年11月12日 申請日期2008年7月3日 優先權日2008年7月3日
發明者康曉燕, 文 徐, 施樂華, 殷正豐 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學